鲤疱疹病毒2型ORF144原核表达和多克隆抗体制备_吴红军.pdf

收稿日期:2022-05-24 基金项目:安徽省高校自然科学基金(KJ2019A0164)资助。作者简介:吴红军，硕士研究生。E-mail：*通信作者:朱若林，博士，讲师。E-mail： 安徽农业大学学报,2023,50(3):457-462 Journal of Anhui Agricultural University DOI 10.13610/ki.1672-352x.20230625.020 网络出版时间：2023-06-27 10:55:56 URL https:/ 鲤疱疹病毒 2 型 ORF144 原核表达和多克隆抗体制备 吴红军，潘李佳，李 节，何艳格，杜宏瑶，龚保荣，吴宜靖，鲍传和，朱若林*(安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036)摘 要：鲤疱疹病毒 2 型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)引起的鲫造血器官坏死病是近年来对鲫(Carassius carassius)养殖业危害最大的疾病之一。通过 PCR 扩增得到 ORF144 基因全长，将其与 pET-32a 原核表达载体连接构建重组载体 pET-ORF144，转化到大肠杆菌中，经 IPTG 诱导表达得到大小约 46 kDa 的重组蛋白，该蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在。将重组融合蛋白纯化后免疫 BALB/c 小鼠获得多克隆抗体，间接 ELISA 检测显示抗体效价大于 151 200。经 Western Blot 验证该抗体可特异性识别感染 CyHV-2 的细胞中的蛋白质和纯化的融合蛋白。间接免疫荧光结果显示该蛋白定位于细胞质，呈点状分布。结果表明构建的 ORF144 多克隆抗体可为病毒的基因功能和致病机制研究提供基础。关键词：鲤疱疹病毒 2 型；ORF144；原核表达；多克隆抗体 中图分类号：S941 文献标识码：A 文章编号：1672-352X(2023)03-0457-06 The prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of Cyprinid herpesvirus 2 ORF144 WU Hongjun,PAN Lijia,LI Jie,HE Yange,DU Hongyao,GONG Baorong,WU Yijing,BAO Chuanhe,ZHU Ruolin(School of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036)Abstract:Haematopoietic necrosis in Carassius carassius is one of the most damaging diseases in recent years caused by Cyprinid herpesvirus 2(CyHV-2).CyHV-2 belongs to the family Alloherpesviridae and the genus Cy-prinivirus.The genus also includes Cyprinid herpesvirus 1(CyHV-1),Cyprinid herpesvirus 3(CyHV-3),and An-guillid herpesvirus 1(AngHV).This virus is a double-stranded DNA virus with a total gene length of about 290 kb and contains 156 open reading frames(ORFs).Analysis of the CyHV-2 genome revealed that it contains four TRIM family genes,a family of E3 ubiquitinylated ligases that play an important role in the host immune system,while the role of TRIM protein analogs present in the virus has less been studied.The function of ORF144,the TRIM analogue of CyHV-2,has not been reported.In this study,the full length of ORF144 gene was obtained by PCR amplification.The recombinant prokaryotic expression vector pET-ORF144,constructed by ligating ORF144 gene with pET-32a,was transformed into competent E.coli cells,and the recombinant protein of about 46 kDa in size was obtained by IPTG-induced expression,which existed mainly as an insoluble inclusion body.The recombinant fusion protein was purified and immunized to BALB/c mice to obtain polyclonal antibodies.The potency of the antibody was greater than 151 200 by indirect ELISA,and the antibody was verified by Western Blot to specifically recognize the pro-tein in CyHV-2 infected cells and the purified fusion protein.Indirect immunofluorescence results showed that the protein was localized in the cytoplasm with a punctate distribution.In conclusion,the ORF144 polyclonal antibody constructed in this experiment can lay the foundation for gene function and pathogenesis study of the virus.Key words:Cyprinid herpesvirus 2;ORF144;prokaryotic expression;polyclonal antibodies CyHV-2 是一种能感染鲫（Carassius auratus）和金鱼（Carassius auratus Linnaeus），导致急性鳃出血并引起高死亡率的病毒病原。该病毒自 1992 年首次在日本发现后1，迅速在全世界传播，在美国2、458 安 徽 农 业 大 学 学 报 2023 年 英国3、中国4、新西兰3和澳大利亚5都有发现。在我国江苏省，仅 2012 年就导致鲫发病面积达 3万 hm2，危害 90%以上养殖区，发病区死亡率 50%以上，造成严重的经济损失6。此后在湖南、江西、浙江、湖北等省7也相继检测到感染CyHV-2的鲫鱼。CyHV-2 属于异疱疹病毒科（Alloherpesviridae）、鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus）。该属还包括鲤疱疹病毒 1 型（Cyprinid herpesvirus 1，CyHV-1）、鲤疱疹病毒 3 型（Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3）和鳗鲡疱疹病毒 1 型（Anguillid herpesvirus 1，AngHV）8。该病毒为双链 DNA 病毒，基因全长约 290 kb，共包含 156 个开放阅读框（Open reading frame,ORF）9。研究表明，在 CyHV-2 的基因组中有一组 TRIM（Tripartite-motif protein）家族基因，包含 4 个 ORF（ORF41、128、144 和 150）10。TRIM 家族蛋白属于 E3 泛素化连接酶，其在哺乳动物和脊椎动物中的功能已开展相关研究，但是其在病毒中的功能还研究较少。有研究表明，哺乳动物和鱼类中的 TRIM 家族蛋白在细胞的增殖与分化11、肿瘤的抑制12等方面发挥着调控作用。此外，TRIM 在病毒与宿主的互作中，能通过影响宿主的先天性免疫发挥着对病毒的抑制作用13，但是，对病毒基因组中的 TRIM 蛋白类似物的作用研究较少。本试验选取 CyHV-2 基因组中 TRIM 家族的ORF144 基因开展研究。通过构建原核表达载体获得重组融合蛋白，将蛋白免疫小鼠获得了其多克隆抗体并检测了抗体的效价和特异性，以期为CyHV-2病毒的基因功能和发病机制研究奠定基础。1 材料与方法 1.1 供试材料 CyHV-2 为实验室从患病鲫中分离得到。鲫鳃细胞系（Carassius carassius gill cells,CCG）由本实验室构建。BALB/c 小鼠购自安徽医科大学实验动物中心。pET-32a 质粒、DH5 和 Rosetta（DE3）感受态、病毒提取试剂盒、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶等均购自北京全式金生物技术有限公司，DNA 纯化回收试剂盒及 PAGE 胶蛋白微量回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和商品化抗体均购自碧云天生物技术有限公司。1.2 引物设计与合成 根据 GenBank（MN201961）上发表的序列，利用 Primer6.0 软件设计 1 对特异性引物扩增全长，序列为 F:5-TTTGGAATTCATGTCCACCTACG-3；R:5-AGTCTCGAGCTTAGAGTATGCTGC-3，划线处分别是 EcoR I 和 Xho I 酶切位点，该引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.3 ORF144 基因的克隆 以纯化的 CyHV-2 病毒 DNA 为模板，用合成的特异性引物进行 PCR 扩增，PCR 反应体系为：DNA模板 2 L，10 molL-1上下游引物各 2 L，Prime star Max Premix（2）25 L，灭菌双蒸水 19 L，总体系为 50 L。PCR 反应程序为：95 预变性 5 min；95 变性 30 s，55 退火 30 s，72 延伸 1 min，35 个循环；72 延伸 10 min。将 PCR 产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收目的片段并与 pEasy-T1 载体连接，连接产物转化到 DH5 感受态中，PCR 筛选阳性克隆（命名为pEasy-T-ORF144）后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。1.4 重组原核表达载体的构建 将重组质粒 pEasy-T-ORF144 和 pET-32a（+）载体分别用 EcoR I 和 Xho I 在 37 进行双酶切，2 h 后，酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的片段，用 T4 DNA 连接酶 4连接过夜，转化至 Rosetta（DE3）感受态细胞中，PCR 筛选阳性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序无突变后用于诱导原核表达，重组质粒命名为 pET-ORF144。1.5 融合蛋白的诱导表达 将包含 pET-ORF144 质粒的大肠杆菌 Rosetta接种于含氨苄抗生素的 LB 培养基中，37、200 r min-1振荡培养菌液，待 OD600值达到 0.6 时加入终浓度为 0.5 mmol L-1的 IPTG 进行诱导表达，6 h后离心收集菌体，超声破碎后分别收集上清和沉淀，加入蛋白质上样缓冲液后，沸水浴 10 min，8 000 r min-1离心后各取 10 L 上清进行 SDS-PAGE 电泳。将诱导得到的目的蛋白切胶并通过 PAGE 胶蛋白微量回收试剂盒进行回收纯化。1.6 多克隆抗体的制备 取纯化后的融合蛋白免疫 6 周龄 BALB/c 小鼠，首次免疫将融合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混匀，以后每隔 7 d 将融合蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合加强免疫，共免疫 4 次。首次免疫剂量为每只 50 g，加强免疫剂量为每只 30 g，最后一次加强免疫 3 d 后取血，分离血清获得抗体。1.7 间接 ELISA 测定抗体效价 将纯化的融合蛋白用碳酸盐包被液稀释到 50 卷 3 期 吴红军等:鲤疱疹病毒 2 型 ORF144 原核表达和多克隆抗体制备 459 1.25 g mL-1包被酶标板，100 L孔-1，37 孵育 2 h，TBST 清洗 3 次。将待测血清作为一抗进行 2 倍梯度稀释，从1 24 100依次稀释到1212 100，37 孵育 1 h，TBST 清洗 3 次。以 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 作为二抗，37 孵育 2 h，TBST 清洗 3 次。经四甲基苯胺（TMB）溶液显色后用酶标仪测定 OD450值，以检测孔 OD450值是阴性对照 OD450 2 倍以上来确定抗体效价。同时设置未免疫小鼠血清为阴性对照，PBS 缓冲液为空白对照，每个稀释度重复 3 次，结果取平均值。1.8 Western Blot 检测 分别取 CyHV-2 感染的 CCG 细胞样品、纯化后的 ORF144 融合蛋白和正常 CCG 细胞样品，经SDS-PAGE 凝胶电泳后转到 PVDF 膜上（300 mA 恒流转膜 60 min）。PVDF膜经TBST洗1次后，用 5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，然后用 TBST 洗膜 2 次，每次 5 min。将抗体血清经 11 000 稀释后作为一抗，在 4 水平摇床孵育过夜。次日，用 TBST 清洗 4 次，每次 5 min，加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG经 11 000 稀释后作为二抗，室温下孵育 2 h 后，用 TBST 清洗 4 次，每次 5 min，最后用 DAB 显色液进行显色。1.9 间接免疫荧光检测 将 CCG 进行细胞传代于 6 孔板中的无菌玻片上，第 2 天接种 CyHV-2 病毒，48 h 观察到细胞出现典型病变后，取细胞进行间接免疫荧光检测。程序为：将玻片用 PBS 缓冲液清洗 3 次，每次 5 min，经 4%多聚甲醛室温固定 10 min 及 0.3%Triton X-100 透化 15 min，PBS 洗净后，加 5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，PBS 清洗后加入 ORF144 抗体（11 000 稀释），4 孵育过夜，PBS 清洗 3 次后加入 FITC 标记的二抗（1150 稀释），PBS 清洗 3 次后，加入 DAPI 室温染色 10 min，PBS 清洗 5 次，每次 5 min，50%甘油封片后使用激光共聚焦显微镜观察并拍照记录。2 结果与分析 2.1 ORF144 基因的扩增及原核表达载体的构建 根据设计的引物PCR扩增获得ORF144基因的全长为 702 bp（图 1），将片段切胶回收连接到pEasy-T1 载体中，获得重组载体 pEasy-T-ORF144。将pEasy-T-ORF144与 pET-32a(+)连接后获得重组载体 pET-32a-ORF144。将重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，经比对序列无突变。M：Marker 2000；1.PCR 扩增图；2.阴性对照。图 1 ORF144 基因 PCR 扩增产物电泳图 Figure 1 Electrophoretic profile of PCR product of ORF144 gene (a)(b)(c)M.蛋白分子量标准；1.未诱导；2.诱导；3.诱导上清；4.诱导沉淀；5.纯化的 ORF144 融合蛋白。图 2 蛋白诱导表达产物的 SDS-PAGE 分析 Figure 2 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression products 2.2 目的蛋白 ORF144 的诱导表达 将包含重组质粒的大肠杆菌进行IPTG诱导后，SDS-PAGE 电泳结果显示在约 46 kDa 的位置出现了大量表达的蛋白，见图 2（a），蛋白大小与预计一致。超声破碎处理诱导后的菌体,将上清和沉淀分别进行 SDS-PAGE 电泳检测，结果显示，融合蛋白主要存在于沉淀中，以不溶性的包涵体形式存在，见图 2（b）。将目的蛋白进行切胶回收，电泳结果显示获得了较纯的 ORF144 融合蛋白，见图 2（c）。2.3 ELISA 检测抗体效价 利用间接 ELISA 检测制备的多克隆抗体的效价，取 3 次重复试验结果的平均值，结果见表 1。取阳性血清 OD450比阴性血清 OD450值大于 2.0 以上的血清稀释度为待测血清的效价，其中 PBS 为空白对照，其值均小于 0.1，结果显示，待测血清效价大于 151 200。2.4 Western Blot 取 CyHV-2 感染的 CCG 细胞（图 3）及纯化的融合蛋白样品进行 Western Blot 试验来检测多克隆抗体的特异性，以未感染的细胞作为阴性对照。结460 安 徽 农 业 大 学 学 报 2023 年 果显示，CyHV-2 感染的 CCG 细胞和重组融合蛋白中均检测到单一蛋白条带，未感染细胞未检测到任何蛋白条带。其中 CyHV-2 感染的 CCG 细胞中的蛋白大小为约 62 kDa，比预计的 25.7 kDa 大；融合蛋白大小约为 46 kDa，与诱导结果大小一致（图4）。Western Blot 结果表明，本试验制备的多克隆抗体可以特异性识别 ORF144 蛋白及其融合蛋白。表 1 ELISA 检测多克隆抗体效价 Table 1 The titer of polyclonal antibody detected by ELISA 稀释度 多克隆抗体 Pa 阴性对照 Nb 比值 P/N 空白对照 PBS 124 100 1.182 0.071 16.737 0.053 125 100 0.788 0.055 14.258 0.052 126 100 0.488 0.059 8.739 0.053 127 100 0.316 0.054 5.894 0.050 128 100 0.205 0.054 3.804 0.054 129 100 0.137 0.052 2.659 0.053 1210 100 0.103 0.054 1.921 0.051 1211 100 0.078 0.050 1.550 0.052 注：Pa 表示 3 组待测多抗检测结果的平均值；Nb 表示 3 组阴性对照检测结果的平均值。(a)(b)(a)未感染细胞；(b)感染后出现明显 CPE 细胞。图 3 CyHV-2 感染 CCG 细胞 Figure 3 CyHV-2-infected CCG cells M.蛋白分子量标准；1.感染 CyHV-2 的 CCG 细胞；2.未感染 CyHV-2 的 CCG 细胞；3.纯化后的融合蛋白。图 4 Western Blot 检测多克隆抗体特异性 Figure 4 Specificity of polyclonal antibody detected by Western Blot (a)(b)(c)(a)DAPI 染核；(b)间接免疫荧光检测 ORF144 蛋白；(c)叠加效果。图 5 CyHV-2 ORF144 蛋白在鲫鳃细胞中的定位 Figure 5 Subcellular localization of ORF144 protein in carassius carassius gill cells 2.5 间接免疫荧光 取CyHV-2感染 48 h后的有明显病变的CCG细胞，通过间接免疫荧光的方法检测 ORF144 蛋白定位。激光共聚焦荧光显微镜观察结果显示，制备的多克隆抗体可以识别 CCG 细胞中的 ORF144 蛋白，且蛋白主要定位于细胞质上，呈点状分布（图 5）。3 讨论和结论 CyHV-2 基因组共包含 156 个 ORF，其中只有少部分基因已开展初步研究，大部分基因功能仍然未知。Guo14、彭俊杰15及 Shen16 等分别对ORF66、ORF25 和 ORF92 进行了原核表达并制备了其单克隆抗体；周勇17和余琳18 等分别对 ORF4和 ORF121 进行了原核表达并构建了其多克隆抗体；Zhou 等19使用酵母表达系统制备了 ORF25 及其截短基因的疫苗并证实了其对 CyHV-2 感染具有一定的免疫保护作用；金李萍等20通过 RNA 干扰技术证实ORF57的沉默能降低CyHV-2的致细胞病变力和复制率；Du 等21对 ORF104 的研究表明其可以特异性激活 p38 信号通路并促进病毒感染。本试验选取的 ORF144 属 TRIM 家族基因，其在 CyHV-2感染细胞过程中的功能尚鲜见报道。TRIM 属于 E3 连接酶家族，因其保守的 RBCC结构域而得名，也称为 RBCC 家族蛋白，其从 N 端到 C 端依次是 RING 结构域、B-box 结构域、Coiled-coil 结构域，可协调靶蛋白的泛素化，以组装信号复合物、介导蛋白水解降解、改变亚细胞定位或调节宿主的转录物或疫苗蛋白质组成22-25。目前在人类中已报道 80 多种不同的 TRIM，在斑马鱼中则包含 200 多种26。TRIM 不仅参与转录、细胞增殖、信号转导、发育、自噬和免疫27，还是很多重要疾病（包括癌症、传染病、炎症和神经异常等）的关键调控因子28。Yang 等29研究表明，TRIM22 通过50 卷 3 期 吴红军等:鲤疱疹病毒 2 型 ORF144 原核表达和多克隆抗体制备 461 泛素化 NS5 来抑制人丙型肝炎病毒（HCV）的复制；Wang 等30研究表明，石斑鱼 TRIM39 体外表达能抑制新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV）和赤点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）的复制；Yang31和 Yu32 等分别从石斑鱼克隆得到 TRIM25 与 TRIM32 并验证其能提高宿主干扰素免疫反应，抑制 SGIV 和RGNNV的病毒复制。TRIM不仅存在于脊椎动物中，也存在于病毒中，如人单纯疱疹病毒型（HSV-1）、狂犬病毒（RV）和卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）等，相关研究表明病毒中的 TRIM 基因能通过多种途径促进病毒的感染33-35。对 CyHV-2 的基因组解析显示其包含 4 个 TRIM 家族类似物（ORF41、128、144和 150），但是其功能研究还鲜见报道。本试验对 CyHV-2 ORF144 基因进行了原核表达，并成功获得了其多克隆抗体。经检测，该抗体可以识别感染 CyHV-2 的细胞中的蛋白质和纯化的融合蛋白且特异性较强。其中，病毒感染的细胞样品中条带大小为约 62 kDa，比预期大小 25.7 kDa大。有研究表明 TRIM 家族蛋白常以同源二聚体或异源二聚体的形式存在36-37，其中 RING 结构域通过组合成一个 RING 结构域复合体来参与不同类型的生化过程38-39。具有抗 HIV 病毒能力的 TRIM5一般通过其 B-box2 功能域表面的疏水氨基酸形成高级同源多聚体40。本研究中 Western Blot 检测到细胞中的病毒蛋白大小比预计的大，可能是因为ORF144 是以多聚体的形式存在。ELISA 显示获得的抗体效价大于 151 200，效价较高，间接免疫荧光结果显示抗体可特异性识别感染细胞中的病毒蛋白，且该蛋白定位于细胞质，呈点状分布。因此，本试验制备的多克隆抗体，可以为 ORF144 基因功能研究，CyHV-2 的免疫学检测、基因功能和致病机制研究奠定基础。参考文献：1 JUNG S J,MIYAZAKI T.Herpesviral haematopoietic ne-crosis of goldfish,Carassius auratus(L.)J.J Fish Dis,1995,18(3):211-220.2 GOODWIN A E,MERRY G E,SADLER J.Detection of the herpesviral hematopoietic necrosis disease agent(Cy-prinid herpesvirus 2)in moribund and healthy goldfish:validation of a quantitative PCR diagnostic methodJ.Dis Aquat Organ,2006,69(2/3):137-143.3 JEFFERY K R,BATEMAN K,BAYLEY A,et al.Isolation of a cyprinid herpesvirus 2 from goldfish,Carassius au-ratus(L.),in the UKJ.J Fish Dis,2007,30(11):649-656.4 WU T,DING Z F,REN M,et al.The histo-and ul-tra-pathological studies on a fatal disease of Prussian carp(Carassius gibelio)in mainland China associated with cyprinid herpesvirus 2(CyHV-2)J.Aquaculture,2013,412/413:8-13.5 STEPHENS F J,RAIDAL S R,JONES B.Haematopoiet-ic necrosis in a goldfish(Carassius auratus)associated with an agent morphologically 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