麦芽协同复合蛋白酶催化玉米...水解物制备及抗氧化活性研究_周丹丹.pdf

收稿日期：基金项目：国家重点研发计划“十三五”子课题（）；中央支持地方高校改革发展资金高水平人才项目（）作者简介：周丹丹（），女，在读硕士，研究方向为轻工技术与工程。通信作者：刘晓兰（），女，教授，研究方向为植物蛋白源生物活性肽健康功能解析。谷物科学麦芽协同复合蛋白酶催化玉米蛋白水解物制备及抗氧化活性研究周丹丹，刘晓兰，邓永平，郑喜群，（齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔；黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，黑龙江齐齐哈尔；黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆）摘 要：研究了麦芽协同复合蛋白酶水解玉米蛋白粉的条件，并分析了水解物的抗氧化活性。结果表明：最佳条件为先用麦芽水解，在底物质量浓度 、麦芽添加量 、温度 条件下水解 ；然后用复合蛋白酶水解，在加酶量 、温度 条件下水解 。在此条件下，蛋白质回收率为%，相比于不加麦芽，蛋白质回收率提高了%。水解物蛋白质量浓度为 时，亚铁离子螯合率、清除率、清除率和清除率分别为%、%、%和%，相比于不加麦芽，亚铁离子螯合率降低%，清除率、清除率和清除率分别提高了%、%和%。关键词：玉米蛋白粉；麦芽；复合蛋白酶；水解；抗氧化活性 ，（，；，；，）：,:,%,%,%,%,%,%,年第 卷第 期 粮食与油脂，%,%:;中图分类号：文献标志码：文章编号：（）玉米蛋白粉经过蛋白酶水解，其加工性能和消化利用率得以改善，还可以获得多种具有生物活性的肽片段，如抗氧化肽、抗高血压肽和醒酒护肝肽等。采用蛋白酶对玉米蛋白粉进行水解，可以扩大其在食品、医药等领域的应用。复合蛋白酶 作用位点广，是水解玉米蛋白粉常用蛋白酶之一，但由于复合蛋白酶用量较多，且商业酶制剂价格偏高，大大提高了玉米蛋白水解物生产成本。大麦芽由大麦经浸泡、发芽和热风干燥制成，大麦芽含有丰富的蛋白酶系如内肽酶、羧肽酶、氨肽酶、二肽酶等，且大麦发芽后氨肽酶和羧肽酶的酶活力增长 倍。在啤酒酿造工业，这些蛋白酶可以水解大麦中蛋白质以增加其溶解性；在中医领域，大麦芽可作为助消化的辅助药物。本研究探索了麦芽协同复合蛋白酶水解玉米蛋白粉的最佳条件，分析了水解物的抗氧化活性，以期为降低玉米蛋白水解物的生产成本并扩大玉米蛋白粉的应用范围提供基础数据。材料与方法 材料与试剂玉米蛋白粉（蛋白质含量%），黑龙江龙凤玉米开发有限公司；麦芽，中粮麦芽有限公司；复合蛋白酶（），南宁东恒华道生物科技有限公司；其他试剂为国产分析纯。仪器与设备 型粉碎机，泰斯特仪器有限公司；型集热式磁力加热搅拌器，上海跃进医疗器械厂；型 计，上海精密科学仪器有限公司；型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；型真空冷冻干燥机，美国 公司；型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；型 杜马斯定氮仪，北京盈盛恒泰科技有限责任公司。方法 玉米蛋白粉预处理按照文献，的方法对玉米蛋白粉进行去淀粉和高温蒸煮。麦芽粉的制备按照文献的方法制备麦芽粉。酶解方法以玉米蛋白粉为原料，麦芽作为第一步水解酶，水解结束后不作灭酶处理，加入复合蛋白酶作为第二步水解酶，依次对玉米蛋白粉进行水解。水解结束后沸水浴灭酶 ，再以 离心，取上清液测定可溶性蛋白质含量，并计算蛋白质回收率。将剩余上清液冷冻干燥，测定其在蛋白质量浓度为 时的亚铁离子螯合率和清除率。以不加入麦芽为对照组。每次试验重复 次，结果取平均值。玉米蛋白粉水解单因素试验 麦芽水解玉米蛋白粉在固定玉米蛋白粉悬浮液底物质量浓度 、温度 、麦芽添加量 、反应时间 的基础上，进行单因素试验，考察麦芽添加量和反应时间对麦芽水解玉米蛋白粉水解度、亚铁离子螯合率和 清除率的影响。麦芽协同复合蛋白酶水解玉米蛋白粉在 的基础上，以复合蛋白酶添加量 、反应温度 、反应 、反应时间 为第二步水解固定条件，进行单因素试验，分别考察复合蛋白酶添加量、反应温度、反应 和反应时间对复合蛋白酶水解玉米蛋白粉蛋白质回收率、亚铁离子螯合率和 清除率的影响。复合蛋白酶水解玉米蛋白粉响应面优化试验在单因素试验的基础上，以蛋白质回收率（）为指标，复合蛋白酶加酶量（）、反应时间（）、反应温度（）和 （）为因素，设计响应面试验。因素水平见表。表 响应面试验设计因素水平水平因素 加酶量（）反应时间 反应温度 水解度的测定采用甲醛滴定法测定麦芽水解玉米蛋白粉时粮食与油脂 年第 卷第 期的水解度（），水解液中游离氨基酸态氮含量测定采用 食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定；样品中总氮含量测定采用杜马斯定氮法。按式（）计算水解度（）。水溶液中游离氨基酸态氮含量样品中总氮含量%（）蛋白质回收率的测定采用 法测定上清液中可溶性蛋白质含量；样品中总蛋白质含量测定采用杜马斯定氮法。按式（）计算蛋白质回收率（）。上清液中蛋白质含量原料中总蛋白质含量%（）抗氧化活性的测定按照刘玥等的方法测定水解物亚铁离子螯合率、和 清除率，按照 等方法测定水解物的清除率。结果与讨论 麦芽水解玉米蛋白粉效果不同蛋白酶最适作用条件不同，且麦芽中氨肽酶和羧肽酶的最适 为 ，若将麦芽作为第二步水解酶，反应结束后蛋白质溶液呈酸性会使大部分蛋白质沉淀，降低蛋白质回收率。因此，本试验将麦芽作为第一步水解酶。最适麦芽添加量的确定由图 可知：随着麦芽添加量的增加，亚铁离子螯合率逐渐增加，水解度和 清除率先增加后减小，在麦芽添加量为 时最大，分别为%和%。这可能是因为本试验中选取的是高浓度体系，麦芽添加量过高会导致体系黏度增大，流动性变差，阻碍了酶与底物接触，影响水解效果。因此，选择麦芽最适添加量为 。图 麦芽添加量对麦芽水解玉米蛋白粉水解效果的影响 麦芽最适反应时间的确定由图 可知：随着反应时间的延长，水解度和亚铁离子螯合率逐渐增加，但 清除率无明显变化。在反应 后，水解度增加不明显，这可能是因为随着水解反应的进行，底物与酶特异性结合，大分子蛋白质被分解为小分子多肽和氨基酸等，底物浓度降低会减少酶切作用位点；且产物的大量积累对反应产生竞争性抑制。因此，选择最适反应时间为 。图 反应时间对麦芽水解玉米蛋白粉水解效果的影响 麦芽协同复合蛋白酶水解玉米蛋白粉效果 最适加酶量的确定由图 可知：随着加酶量的增加，蛋白质回收率、亚铁离子螯合率和 清除率呈先增加而后趋于平缓。这是因为随着反应的进行，具有抗氧化能力的肽片段也随之增多。但当加酶量超过一定水平时，水解物的抗氧化活性开始降低，这可能是因为复合蛋白酶会对具有抗氧化能力肽片段再次进行剪切，导致其失去抗氧化能力。不同的是亚铁离子螯合率在加酶量为 时达到最大值图 加酶量对麦芽协同复合蛋白酶水解玉米蛋白粉水解效果的影响 年第 卷第 期 粮食与油脂%，清除率在加酶量为 时达到最大值%，综合考虑选择加酶量为 ，与对照组相比，麦芽的加入使得蛋白质回收率提高了%，水解物的 清除率提高了%。这可能是因为麦芽中的蛋白酶种类多，作用位点差异较大，在麦芽的作用下玉米蛋白粉暴露出较多有利于复合蛋白酶的水解位点，易于复合蛋白酶发挥作用，产生更多具有 清除能力的小分子肽，因此增加了蛋白质回收率和水解物的 清除率。最适反应时间的确定由图 可知：随着反应时间的延长，蛋白质回收率不断升高，但在 后增长速度变缓。这与麦芽反应时间对水解度的影响机制一致。在整个时间范围内，亚铁离子螯合率和 清除率无明显变化，这可能是因为 的作用位点广泛，专一性不强，水解物中所含抗氧化肽结构、氨基酸组成及序列差异不大。但 清除率在反应时间为 时达到最大值%，综合考虑选取最适宜反应时间为 ，与对照组相比，麦芽的加入使得蛋白质回收率和 清除率分别提高了%、%。图 反应时间对麦芽协同复合蛋白酶水解玉米蛋白粉水解效果的影响 最适反应温度的确定由图 可知：随着温度的升高，蛋白质回收率先升高后降低，在温度 时达到最大值%。这是因为蛋白酶有最适作用温度，在低于最适温度时，升高温度能加快分子运动速率，从而增加底物与酶的结合几率，提高水解效果；在超过酶的最适温度时，继续升高温度会破坏酶分子的空间构象导致酶变性失活，从而降低反应速率。在整个温度变化范围内，亚铁离子螯合率和 清除率无明显变化，这可能是因为温度仅对复合蛋白酶的活性产生较大影响，对其作用位点并无太大影响。但亚铁离子螯合率和 清除率在温度 时达到最大值，分别为%、%，故选择最适反应温度为，与对照组相比，麦芽加入使得蛋白质回收率和 清除率分别提高了%、%。图 反应温度对麦芽协同复合蛋白酶水解玉米蛋白粉水解效果的影响 最适反应 的确定由图 可知：在整个 范围内，水解物的蛋白质回收率、亚铁离子螯合率和 清除率均呈现先升高后降低的趋势，并在 时达到最大值，分别为%、%和%。这是因为 会影响酶的稳定性，改变 不但会影响蛋白酶分子的空间构象、与催化有关基团的解离状况，还会影响酶与底物的结合状态及酶底物复合物的解离，从而影响水解效果。水解物亚铁离子螯合率和 清除率均随 而改变，可能有 种原因，一是 能影响酶活性图 反应 对麦芽协同复合蛋白酶水解玉米蛋白粉水解效果的影响粮食与油脂 年第 卷第 期部位上相关基团的一些活动，进而影响蛋白酶的作用位点，导致不同 下水解物的抗氧化活性不同；二是不同的 可能会影响溶液中多肽的空间结构，导致其抗氧化活性受到影响，故选择最适 为，与对照组相比，麦芽的加入使得蛋白质回收率和 清除率分别提高了%、%。麦芽协同复合蛋白酶水解玉米蛋白粉条件优化响应面试验方案及结果见表，方差分析见表。表 响应面试验方案及结果试验号%运用 软件对试验结果进行回归拟合，得到回归方程：。表 蛋白质回收率模型方差分析方差来源平方和自由度均方 值 值显著性模型 残差失拟项 纯误差总和 失拟项 纯误差总和 注：“”表示极显著水平（）；“”表示显著水平（）。模型相关系数 和校正系数 分别为 、，接近于，表示蛋白质回收率模型相关度很好；变异系数 ，说明该数学模型对蛋白质回收率的置信度极高，可以较好地反映试验的真实值。由表 可知：该模型极显著，且失拟项不显著。综上所述，该回归模型蛋白质回收率的拟合程度较好，试验误差小。、对蛋白质回收率的影响极显著（），对蛋白质回收率的影响显著（）。经拟合得出复合蛋白酶的最佳水解条件为加酶量 、反应时间 、反应温度 、，在此条件下，蛋白质回收率为%。为方便试验操作，在麦芽水解玉米蛋白粉的基础上，将复合蛋白酶最佳水解条件修正为加酶量 、反应时间 、反应温度 、，在此条件下进行 次验证实验，蛋白质回收率平均为%，与理论预测值相比其 年第 卷第 期 粮食与油脂相对误差为%。水解物亚铁离子螯合率和清除率分别为%和%。其他条件相同时，相比于不加麦芽，蛋白质回收率、亚铁离子螯合率和 清除率分别提高了%、%和%。玉米蛋白水解物的抗氧化活性由表 可知：在其他水解条件相同时，麦芽协同复合蛋白酶水解玉米蛋白粉的水解物的、和清除率均显著（）高于未加入麦芽进行玉米蛋白粉水解的产物。这可能是因为玉米蛋白粉在经过麦芽的初步水解后高级结构被破坏，埋藏于分子内部的复合蛋白酶的水解位点被暴露出来，促进了复合蛋白酶对玉米蛋白粉的水解作用。表 玉米蛋白水解物的抗氧化活性%抗氧化活性玉米蛋白水解物加入麦芽不加麦芽亚铁离子螯合率 清除率 清除率 清除率 注：水解物蛋白质量浓度 ，同行不同字母表示差异显著。结论本文研究并优化了麦芽协同复合蛋白酶水解玉米蛋白粉的工艺，得到最佳工艺条件为先用麦芽水解，在 底 物 质 量 浓 度 、麦 芽 添 加 量 、温度 条件下水解；然后用复合蛋白酶水解，在加酶量 、温度 条件下水解 。在此条件下水解玉米蛋白粉提高了水解物蛋白质回收率和抗氧化活性，对于玉米蛋白粉的深加工及产物的产业化应用具有重要意义。参考文献 刘祥,郑喜群,刘晓兰 美拉德糖基化对玉米蛋白粉双酶水解产物抗氧化活性的影响 食品与机械,():刘晓兰,宋占兰,郑喜群 高底物浓度玉米蛋白的双酶复合水解效果研究 粮食与饲料工业,():管敦仪 啤酒工业手册 北京:中国轻工业出版社,王晓杰,刘晓兰,曲悦,等 两步水解法制备玉米抗氧化活性肽及产物的稳定性 中国粮油学报,():郑喜群 玉米黄粉的酶解工艺与抗氧化活性肽的制备 北京:中国农业大学,():刘玥,刘晓兰,郑喜群,等 复合蛋白酶水解玉米谷蛋白产物的抗氧化活性研究 食品与机械,():,():粮食与油脂 年第 卷第 期