响应曲面法优化蓝藻多糖提取工艺研究-毕业论文.doc

安徽大学
本科毕业论文

题　　目：响应曲面法优化蓝藻多糖提取工艺研究
学生姓名：　周维清 学号： D31014005
院（系）： 　生命科学学院　 专业： 生物工程
入学时间：　 　　2010 　 　年　 09 　月
导师姓名：　 孔小卫、戴玲　　 职称/学位： 副教授
导师所在单位：　　 　安徽大学生命科学学院

12

响应曲面法优化蓝藻多糖提取工艺的研究

作者：周维清 安徽大学生命科学学院2010级生物工程专业，230601
指导教师：戴玲 孔小卫 安徽大学生命科学学院，230601

摘 要
目的：利用响应面分析法研究铜绿微囊藻中水溶性多糖的提取工艺。方法：在提取温度、料液比、提取时间、冻融次数、溶菌酶和EDTA6个单因素实验的基础上，选择提取温度、提取时间、料液比3个因素3水平的Box -Behnken 中心组合研究, 并运用Design Expert 8.0 软件对试验数据进行分析。建立了以上3个主要因素对水提蓝藻多糖得率影响的数学模型，通过响应面分析法对提取条件进行优化，确定了水提法提取蓝藻多糖的最佳工艺。 结果：试验结果表明，各提取因素对铜绿微囊藻多糖得率的影响顺序为：提取温度＞料液比＞提取时间＞。结论：所得最佳提取条件：提取温度53℃，料液比1:51，提取时间4.3h，在此条件下，预期的粗多糖得率为1.18%，实际得率为1.06%。

关键词：蓝藻；水溶性多糖；响应面分析；工艺优化

Optimization of the extraction technology of algae’Polysaccharides by Response Surface Methodology

Author: ZhouWeiqing School:Anhui University Hefei, 230601 Department: School of Life Sciences Major:2010 Biological Engineering, Hefei, 230601
Advisor: Kong Xiaowei and DaiLing School of Life Sciences,in Anhui University Hefei, 230601

Abstract
Objective: the extraction technology of  algae’polysaccharide by using response surface analysis  Method: On the basis of extraction temperature, extraction time, ratio of material to liquid, freeze thawing cycles, lysozyme and EDTA experiment of 6 single factor,  choose extraction temperature, extraction time, solid to liquid ratio of 3 factors and 3 levels to conduct Study of Box -Behnken center , and analyze the test data by use Design Expert 8.0.Establish a mathematical model of effect on extraction rate of polysaccharide about the above 3 main factors, finally,the extraction conditions were optimized by response surface analysis, and determined the optimal condition of blue-green algae polysaccharide extraction . Results: the influence factors on the sequence of Microcystis aeruginosa polysaccharide extraction  are   as  follows: extracting temperature>solid-liquid ratio >extraction time. Conclusion: the optimum extraction conditions: extraction temperature 53 ℃,solid-liquid ratio 1:51, extraction time 4.3h, under this condition, the crude polysaccharide expected rate of 1.18%, the actual rate of 1.06%.
Keywords: algae; water soluble polysaccharide; response surface analysis;process optimization

目 录
1引言 1
1.1铜绿微囊藻的研究背景 1
1.2铜绿微囊藻多糖研究背景 1
1.3响应曲面法的研究进展 2
1.4论文研究的意义 2
2.材料、试剂和仪器 2
2.1材料 2
2.2试剂 3
2.3 仪器设备 3
3 方法 3
3.1蓝藻多糖提取工艺路线 3
3.2蓝藻多糖单因素提取实验 3
3.3蓝藻多糖提取的中心组合实验 3
3.4 数据处理 4
4 结果与分析 4
4.1 单因素提取对水溶性多糖得率的影响 4
4.1.1提取温度对多糖得率的影响 4
4.1.2水料比对多糖得率的影响 4
4.1.3提取时间对多糖得率的影响 5
4.1.4溶菌酶浓度和EDTA对多糖得率的影响 6
4.1.5反复冻融次数对多糖得率的影响 6
4.2响应面法优化分析提取条件结果分析 7
4.3最佳工艺条件检验 11
5 结论与展望 11
参考文献 12
致　　谢 12

响应曲面法优化蓝藻多糖提取工艺的研究

1引言
1.1铜绿微囊藻的研究背景
铜绿微囊藻（学名：Microcystis aeruginosa）为蓝藻门，色球藻科、微囊藻属，浮游性、暖温性藻类植物是一种出现在淡水中的蓝菌,多生长在湖泊、池塘等有机质丰富的水体中，会产生有害藻华，具有一定的生态学与经济重要性，是优养化的淡水中最主要的有毒蓝菌藻华来源。
微囊藻属的特征为小型的细胞，细胞大小仅有3至8微米，且其外没有鞘包覆。原生质体的颜色是浅蓝绿色，但因细胞中具有充满空气的囊泡在光下可能呈暗色，这是光学显微镜下微囊藻的鉴别特征之一。囊泡提供微囊藻足够的浮力，使其停留在有足够光线和二氧化碳提供生长的水层。群体呈球形团块状或不规则穿孔的网状团块，橄榄绿色或污绿色，幼时球形、椭圆形、中实；成熟后为中空地囊状体，随着群体地不断增长，胶被某些区域破裂或穿孔，使群体成窗格状的囊状体或不规则裂片状的网状体；群体最后破裂成不规则的、大小不一的裂片；此裂片又可成为一个窗格状群体。群体胶被质地均匀，无层理，无色透明，明显，但边缘部高度水化。
微囊藻形成藻华时淡水溶氧量的显著降低会导致水中动物的死亡，还能产生神经毒素脂多糖与肝毒素微囊藻素。微囊藻素是一些环状的非核糖体多肽，由脱氢丙氨酸衍生物和ADDA氨基酸等非蛋白氨基酸组成，可强烈抑制第一型与第二型蛋白质磷酸酶，对动植物都有毒性，对肝脏的毒性很强，也和全脂炎有关。在理想的环境下铜绿微囊藻可以持续产生对肝有害的微囊藻素，其为饮用水污染的来源之一，且这种毒素对热的抗性高，甚至以活性碳吸附、加入氯或臭氧消毒也无法完全消除，对经济的影响包括为了减轻毒素需要在净水上花费的额外成本，和发生有害藻华的河湖需暂时封闭对当地旅游业造成伤害。也有研究显示铜绿微囊藻可以产生2,6-二叔丁基对甲酚，这种物质主要在食品添加剂中被用作为抗氧化剂，在工业上也具有许多用途。
1.2铜绿微囊藻多糖研究背景
铜绿微囊藻胞内存在着大量酸性杂多糖，胞外的胶被中含有大量黏液层多糖富含大量的糖醛酸，也属于酸性杂多糖，酸性杂多糖大多具有很强的抗病毒功效，有研究认为天然药的酸性多糖能屏蔽H I V病毒和乙肝病毒对细胞的结合位点具有抑制病毒侵染的作用，从而引起了医药研究人员的极大关注。除此之外微囊藻多糖还能抗氧化、增强免疫功能，抗凝血降血脂，抗突变等多种功效，而决定其生物活性和功能就是它复杂的构效关系、溶解度、粘度以及其物理化学性质，具有深远的研究意义。
铜绿微囊藻多糖是一种由单糖组成的天然高分子化合物，其不同单糖残基、主链连接方式和侧链基团,形成了链内和链间氢键的不同结构层次，从而形成了不同的构象、不同分子量和功能的复杂的多糖结构。多糖结构层次可以分为一、二、三、四级，一级结构主要体现在主链和支链的性质上，前者如糖基的组成、排列顺序及其连接方式等，后者如分支的有无、类型、位置及长短等；二级结构指多糖的主链间以氢键结合的各种聚合体；在二级结构的基础上，糖单位间的非共价键相互作用形成有序而粗大的构像，即多糖的三、四级高级结构。其初级和高级都直接决定多糖的生物活性。多糖结构复杂、多样，结构的研究特别是高级结构的研究难度大，目前，微囊藻多糖结构研究多局限于一级结构的研究，主要是分析多糖的组成、相对分子质量及糖苷键的类型等，高级结构的研究没有取得较大的突破。但科学家们都在往这方面的不断摸索和努力。
1.3响应曲面法的研究进展
响应曲面法( response surface method，RSM) 近年来被广泛应用于众多过程的优化控制，它是一种优化生物过程的统计学试验设计，建立连续变量曲面模型对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，确定最佳水平范围。响应曲面法能以最经济的方式，利用较少的试验数量和时间快速有效地确定试验中多因素系统的最佳条件，所需要的试验组数相对较少，可节省人力物力，已经成功应用于各种各样的生物过程优化中。本试验采用热水法提取铜绿微囊藻中的多糖，选定提取温度、料液比、提取时间3个主要因素3水平进行中心组合试验，通过Design Expert 8.0 软件进行响应面分析得出铜绿微囊藻多糖水提法提取的最佳条件。
响应曲面设计参考步骤如下：1．确定实验的指标（变量）；2．确定因素水平编码，参照有关的正交表进行实验编号；3．进行实验；4．计算分析，得回归方程，并进行显著性检验；5．作图，分析最终结果。
1.4论文研究的意义
目前水体富营养化日趋严重的情况下铜绿微囊藻的生长失控引起的水华爆发常常成为一种生态灾难。如何有效地利用微囊藻资源，使其变废为宝是必须正视的问题，铜绿微囊藻多糖的开发和利用早已成为资源开发的热点。铜绿微囊藻无论在胞内还是胞外都能分离得到富含糖醛酸和硫酸基团的酸性多糖，展现出铜绿微囊藻作为蓝藻酸性多糖提取的丰富资源的可贵前景。本实验旨在研究铜绿微囊藻多糖的提取优化条件，为微囊藻多糖的结构、理化性质研究、分离纯化奠定基础，也为生物活性研究和药理药效研究作铺垫，充分利用这一宝贵资源为资源整合和利用做出贡献。
2.材料、试剂和仪器
2.1材料
铜绿微囊藻，在巢湖采集，经在安徽大学环境科学学院冷冻冻融后，成为可利用的藻浆。
2.2试剂
（1）无水乙醇：上海振业化工有限公司
（2）正丁醇：上海申博化工有限公司
(3)三氯甲烷:国药集团化学试剂有限公司
以上试剂均为分析纯。
2.3 仪器设备
（1）电子天平：上海越平科学仪器有限公司
（3）DK-S24型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司
（4）TDL-5M台式大容量冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司
（5）旋转蒸发仪：巩义市予华仪器有限责任公司
(6）TD5A-WS台式低速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司
（7）冷冻干燥机：德国CHRIST生产
（9）冰箱：荣事达
（10）烘箱：上海精宏实验设备有限公司
3 方法
3.1蓝藻多糖提取工艺路线
蓝藻藻浆→热水法浸提多糖→离心后过滤去残渣→收集上清液→上清液浓缩至8-10ml→浓缩液加5倍体积乙醇沉淀（隔夜沉淀）→离心去上清液留沉淀→沉淀加水后抽干乙醇至溶液8ml左右→冷冻干燥→粗多糖→称重→计算粗多糖得率
分别测定不同温度，时间，料液比，冻融次数，溶菌酶浓度对粗多糖得率的影响。
3.2蓝藻多糖单因素提取实验
分别以不同的温度、水料比、提取时间，冻融次数及溶菌酶浓度做单因素试验, 考察各单因素对多糖得率的影响。
3.3蓝藻多糖提取的中心组合实验
根据Box -Benhnken 的中心组合试验设计原理，在单因素试验基础上，确定中心组合试验因素与水平，以多糖得率为响应值，通过响应面分析对提取条件进行优化。试验因素及水平编码如表1所示。
具体试验设计方案见表2。

表1　中心组合设计的因素与水平表
Table1. Variables and levels in the design of the center combination experiment

变量 代码 编码水平
-1 0 1
提取温度/℃ A 40 60 80
提取时间/h B 3 4 5
料液比/ml/g C 40 50 60

对提取温度A、提取时间B和液料比C作变换如下：
A=(T － 60)/20，B=(t － 4)/1，C=(z － 50)/10，(T、t、z 分别为试验提取温度、提取时间及液料比)。以A、B、C 为自变量， 以 2次试验所得多糖提取率的平均值为响应值(R1)。
3.4 数据处理
每组实验均设定二个平行实验，结果求平均值，然后运用Design Expert 8.0 软件对试验数据进行分析。
4 结果与分析
4.1 单因素提取对水溶性多糖得率的影响
4.1.1提取温度对多糖得率的影响
以30 mL /g 的料液比，分别于40、50、60、70、80、90 ℃下提取4 h，并以95%的乙醇沉淀，醇沉比为1︰5。结果如图1，由图可知，随着温度的升高，多糖的提取率逐渐增加，且增幅明显，当温度增到70℃左右后增幅变小，80℃时多糖的提取率最高，之后随着温度的增加，多糖提取率逐渐减小。这里考虑到蓝藻多糖还有很多后续研究，为了保持多糖结构不被严重破坏，应选择提取温度在60-70℃之间为宜。

图1 提取温度对多糖得率的影响
Fig.1 Effects of temperature on polysaccharides extraction rate

4.1.2水料比对多糖得率的影响
在提取温度为60 ℃下，分别以10、20、30、40、50mL /g 的料液比提取4h，并以95%的乙醇沉淀。结果见图2，由图2可知，多糖提取率随液料比的增大而呈上升趋势，这是由于加液量越大则提取出来的多糖越容易溶解，损失就越少，但料液比到达30ml/g 左右时多糖提取率增幅不大，提取率缓慢增加。增大液料比虽有利于多糖提取，但会增大后续浓缩的时间与能耗，所以从成本考虑料液比应在30-40mL /g 左右。

图2 料液比对多糖得率的影响
Fig.2Effect of liquid/solid ratio on yield of polysaccharides

4.1.3提取时间对多糖得率的影响
在提取温度为60℃下，以30mL/g 的料液比进行提取，时间分别为1、2、3、4、5 和6h，并以95%的乙醇沉淀。结果见图3，由图3 可知，多糖提取率随着提取时间的增长，呈现先上升再稳定的总体趋势，在4 h 左右出现最大值,随后增幅不明显。说明提取产物浸出过程与时间密切相关，时间过短，产物溶解不充分，但时间过长，又可能会引起产物结构的变化。单因素试验的结果显示，提取时间应在4-5h 左右。

图3 提取时间对多糖得率的影响
Fig.3 Effects of time on polysaccharides extraction rate

4.1.4溶菌酶浓度和EDTA对多糖得率的影响
在提取温度为60℃,料液比为30mL/g及其它情况保持不变的情况下,加入0g、0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g的溶菌酶，根据实验结果得图4，加入溶菌酶对多糖得率并没有什么正面促进作用，随着溶菌酶量的增多，多糖提取率反而不断下降。然而，加入溶菌酶的同时，每组加入同等量的EDTA，效果就不一样，多糖提取率总体都因为EDTA的加入而升高，如红色趋势线所示，随着溶菌酶量变多，多糖提取率先增加后慢慢减少，并在溶菌酶量为0.1g时提取率达到最大值。所以试验中，为保证获得更多的多糖，可以加入适量的溶菌酶和EDTA来提高产率。

图4溶菌酶和EDTA对多糖得率的影响
Fig.4 Effects of lysozyme and EDTA on polysaccharides extraction rate

4.1.5反复冻融次数对多糖得率的影响
同样保持提取温度为60℃，水浴4h,料液比为30mL/g，醇沉比为1︰5及其他相同条件下，考查冻融次数为1次、2次、3次、4次直到7次对多糖得率的影响，根据实验结果如图5所示，随着冻融次数的增加，多糖得率也随之增加，后来增幅减少甚至呈下降趋势。由图可知，冻融次数在3次的时候，多糖得率最高，之后增加冻融次数反而抑制多糖的提取，实验中为保证多糖结构不被破坏，应选冻融次数为2次。

图5冻融次数对多糖得率的影响
Fig.5 Effects of freezing numbers on polysaccharides extraction rate

4.2响应面法优化分析提取条件结果分析
由前述表1的分析因素与水平,得响应面分析方案和结果如下:本实验共17个实验点，12个析因点为析因实验，5个零点为中心试验，用以估计实验误差。

表2 Box -Behnken 试验设计中水提蓝藻多糖得量实测值与预测值
Table2. the expected and actural yield of Microcystis aeruginosa’polysaccharide and in the design of Box-Behnken experiment

实验编号
A提取温度/℃
B提取时间/ h
C料液比/ml/g
多糖得率实际值/g
多糖得率预测值/g
1
0
-1
-1
1.07
1.07
2
0
1
-1
1.16
1.2
3
-1
-1
1
1.11
1.02
4
1
1
0
1.05
1.12
5
0
0
0
1.02
1.06
6
0
-1
1
0.95
0.98
7
0
0
0
1.05
1,06
8
-1
0
1
1.13
1.28
9
0
1
1
0.99
0.97
10
-1
1
0
1.16
1.07
11
0
0
0
1.09
1.06
12
0
0
0
1.09
1.06
13
1
-1
0
1.26
1.32
14
1
0
1
1.31
1.25
15
1
0
-1
1.83
1.76
16
-1
0
-1
1.06
1.09
17
0
0
0
1.08
1.06

采用Design Expert 8.0 程序对所得数据进行回归分析，3个因素经过拟合得到多糖提取量( R1) 回归方程如下所示：
R1=+1.06+0.16*A+0.029*B
-0.08*C-0.13*A*B-0.17*A*C
-0.037*B*C+0.15*A2-0.14*B2+0.14*C2

表3响应曲面二次模型方差分析
ANOVA for Response Surface Quadratic Model
Analysis of variance table [Partial sum of squares - Type III]
资源项 平方和 自由度 均方差 F值 Prob > F
Source
Sum of Squares

df
Mean Squres
Value
p-value
显著性
Modle
0.57
9
0.063
6.58
0.0106
*
A-A
0.18
1
0.18
18.52
0.0034
**
B-B
6.243E-003
1
6.243E-003
0.65
0.4455
-
C-C
0.053
1
0.053
5.55
0.0506
-
AB
0.055
1
0.055
5.81
0.0468
*
AC
0.13
1
0.13
13.35
0.0081
**
B-C
5.892E-003
1
5.892E-003
0.62
0.4580
-
A2
0.089
1
0.089
9.29
0.0186
*
B2
0.077
1
0.077
8.08
0.0249
*
C2
0.066
1
0.066
6.89
0.0341
*
残差
Residual
0.067
7
9.553E-003

-
失拟项
Lack of Fit
0.063
3
0.021
20.40
0.0069
-
纯误差
Pure Error
4.102E-003
4
1.026E-003

-
Cor Total
0.63
16

-
注：* ：差异显著，P ＜ 0 . 0 5 ；* * ：差异极显著，P ＜ 0 . 0 1 。
R-Squared拟合度=0.8943
表三为响应曲面二次方差回归模型分析，因为R2=0.8943，表明该模型与实际拟合较好，自变量(提取温度、提取时间和液料比)与响应值(提取量)之间线性关系显著。回归方程各项的方差分析结果还表明，提取温度的一次项、提取温度和液料比的交互作用均达到极显著水平(P ＜ 0.01)。此外，提取时间和提取温度的交互作用、提取温度、提取时间、液料比的二次项也较为显著(P ＜ 0.05)。由实验数据得各因素对多糖提取率的影响次序：提取温度一次项＞提取温度和液料比交互项＞提取温度二次项＞提取时间二次项＞料液比二次项＞提取温度和提取时间交互项。
响应面图形是响应值对各试验因子所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。当响应面分析图为山谷形曲面，有极小值存在；当为山丘曲面，有极大值存在；当为马鞍形曲面，无极值存在。通过响应面三维图，可直观地反映各因素的交互作用对响应值的影响，从而确定最佳工艺参数范围。根据拟合模型绘制蓝藻多糖提取率三维响应曲面图及其等高线分析图。比较响应面三维图可知，所选范围内是否存在极值；等高线的形状反映出交互作用的大小，圆形表示两因素的交互作用不显著，椭圆形则表示两因素交互作用显著。
Design-Expert 8.0 软件处理得响应面分析结果见图：

图6提取温度与液料比（A-C）对多糖提取率影响的响应面图
Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction temperature and liquid/solid ratio on yield of polysaccharides

图6中，提取温度和液料比（A-C）的交互作用极其显著，且由表3中AC的 P 值<0.01可验证。二维图为山谷曲面，有极小值存在，通过响应面三维图，反映了提取温度与液料比（A-C）的交互作用对响应值的影响，从而确定最佳工艺参数范围。在试验水平范围内，提取时间4h，酒精沉淀浓度为95%的情况下，当提取温度在60℃时，粗多糖的得率随液料比增加而增加，之后增幅不大；当液料比为40ml/g，粗多糖的得率随提取温增加而增加变化趋势明显，多糖提取量明显增加。

图7 提取时间与料液比（B-C）对多糖提取率影响的响应面图
Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of time and liquid/solid ratioin on yield of the extraction polysaccharides

图7中，提取时间和液料比（B-C）的交互作用可以看出来，当提取时间为4h 时，随着料液比的增加，多糖提取量会增多，当料液比为50ml/g时，随着时间的增长，多糖提取量先增加后减少，本图更多的体现了单因素对多糖提取的影响，交互作用不是很明显。表3中BC的 P 值=0.4580>0.05可验证。二维图图为马鞍形可知，提取时间和液料比（B-C）的交互作用下，无极值存在。

图8 提取温度与提取时间（A-B）对多糖提取率影响的响应面图
Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature and time in the extraction on yield of polysaccharides

图8中当C＝50（料液比为1:50），乙醇浓度为95%时，当提取时间为4h时，随着温度的升高，粗多糖得率先快速增加后增幅减少，说明提取温度对多糖提取有重要的作用；提取温度为60℃时，随提取时间的延长，多糖得率先上升，后减少，且在4小时左右达到最大。由此可以推断出，在料液比和酒精沉淀浓度一定的条件下，提取时间和提取温度的有明显交互作用，这与表3中的AC的P小于0.05一致。此外要控制多糖提取时间和温度，不能无限制的增加提取温度和延长提取时间。
4.3最佳工艺条件检验
通过回归模型的预测，从多糖最佳得量考虑，其它条件不变，得热水提取蓝藻多糖的最佳工艺条件:提取温度为80℃、液料比为1：40、提取时间为3.78h、预测响应值为1.76g。为检验RSM 的可靠性，采用上述最优条件进行验证试验，同时考虑多糖结构的完好性，将提取工艺参数修正，修正方式如下：
对上述回归方程取一阶偏导数等于零，整理可得如下三式：
0.16+0.3A—0.13B－0.17C=0 (1)
0.029—0.13A－0.28B－0.037C=0 (2)
-0.08－0.17A－0.037B+0.28C=0 (3)
式(1)、(2)、(3)联立方程组，解得A= -0.36478，B=0.2599，C=0.0987，代入前述的变换公式得到提取温度T=52.7℃，液料比z=50.98ml/g，提取时间t=4.26h，即该铜绿微囊藻多糖提取工艺最佳工艺条件为采用水为溶剂、提取温度52.7℃、提取时间4.26h、料液比1:50.98。但考虑到实际情况，所以确定其将最佳提取工艺条件为温度53℃、时间4.3h、料液比1:51。在此修正条件下，实际测得提取率为1.06g，回归模型预测提取率理论值可达1.18g、实际测定值比理论预测值低11.3%。因此，采用RSM 法优化得到的浸提条件参数准确可靠。
5 结论与展望
利用Design Expert8.0软件，采用Box-Behnken建立热水法提取铜绿微囊藻多糖的回归模型，方程拟合良好。在热水法提取蓝藻多糖的过程中，提取温度是影响多糖提取率的最关键因素，各提取因素对热水提取微囊藻多糖得率的影响顺序为：提取温度＞料液比＞提取时间。其它条件不变，当提取温度53℃、料液比1:51、提取时间4.3h时为最佳工艺参数。在此条件下预期的多糖得率是1.18g，实际得率是1.06g。综合整个实验的设计及最终结果来看，本实验在设计上还存在一些缺陷，比如称量的过程、旋转蒸发的过程难免有误差存在，在这些方面还要不断加强改进，才能为下次实验做好铺垫，得出更加理想的效果。

参考文献
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致　　谢
本实验是在孔小卫老师悉心指导下完成的。整个实验过程中，孔老师和戴玲老师在实验方案的设计和解决实验各方面问题给予了很大帮助，及时对我们的问题进行讲解和指导，同时不断跟进我们的实验进度，付出了很多的时间与精力。在这里真心的感谢两位慈祥的老师孔老师和戴老师对我的帮助，感谢您们的陪伴！
另外要特别感谢的是王军老师、李志平学长和其它实验室的老师们的支持与帮助，一方面为我解决了实验仪器的问题，另一方面对我在实验过程中所遇到的问题给予了详细的指导。此外，还要感谢同实验室的张弛、纪启芳、汪洋等同学在实验过程中对我的关心和帮助，对我的实验操作提出了很多宝贵的意见。
最后，我要感谢各位论文评阅老师和答辩委员会的全体老师们，感谢你们在百忙之中抽出时间来评阅我的论文。