蛋白质综合项目工程重点.doc

一、名词解释1、蛋白质工程（Protein Engineering）以蛋白质分子构造规律及其生物功能关系作为基本，通过化学、物理和分子生物学手段进行基因修饰或基因合成，对既有蛋白质进行改造，或制造一种新蛋白质，以满足人类对生产和生活需求工程技术。2、构造模体（supersecondary structure，motif）介于蛋白质二级构造和三级构造之间空间构造,指相邻二级构造单元组合在一起，彼此互相作用，排列形成规则、在空间构造上可以辨认二级构造组合体，并充当三级构造构件（block building），其基本形式有、和等。3、构造域（domain）是在二级构造或超二级构造基本上形成三级构造局部折叠区，它是相对独立紧密球状实体。 4、蛋白质折叠(protein folding)从体内新生多肽链或体外变性多肽链一维线性氨基酸序列转化为具备特性三维构造活性蛋白质过程。5、分子伴侣 （molecular chaperone）一大类互相之间没关于系蛋白质，它们具备共同功能是协助其她含蛋白质构造在体内进行非共价组装和卸装，但不是这些构造在发挥其正常生物学功能时永久构成某些。6、晶胞(Unit cell)空间点阵单位（大小和形状完全相似平行六面体），是晶体构造最小单位。7、核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）指核磁矩不为零核，在外磁场作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸取某一特定频率射频辐射（radio frequency，RF）物理过程。8、化学势（位）移 （d）在有机化合物中，各种氢核周边电子云密度不同（构造中不同位置）共振频率有差别，即引起共振吸取峰位移，这种现象称为化学位移。9、耦合常数 （J）由于自旋裂分形成多重峰中相邻2峰间距离。用以表征2核之间耦合伙用大小，单位赫兹Hz。10、蛋白质组（proteome）一种基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达全套蛋白质。二、问答题1、蛋白质修饰特异性与非特异性诱变办法： 随机突变：UV、X射线、其她化学办法、转座元件、简并引物 定点突变：核式突变、限制性内切酶位点、寡核苷酸介导突变、PCR依赖1）、Kunkel突变法UUUUUUTemplateUUUUUUTemplateUUMutant TemplateUU +UU dut-ung-双突变菌株添加突变引物 在不含U碱基噬菌体内延伸引物 转染于dut+ung+野生型受体菌 不含U碱基保存，含U碱基被切除原理：当大肠杆菌dUTP酶缺失突变时（dut-），这些细菌就不能把dUTP转化为dUMP,因而细菌体内dUTP浓度大为增长，并且某些dUTP会掺入到DNA合成中应当由胸腺嘧啶占据位置。而此时大肠杆菌体内还存在一种尿嘧啶-N-糖基化酶，它可以去除掺入到DNA中尿嘧啶残基。但在尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷性菌株中（ung-），由于该酶失活将不能把尿嘧啶从DNA链中剔除，使细菌DNA中一小某些胸腺嘧啶残基被尿嘧啶所取代。在dut-ung-F菌株中，取代比例有所提高，由该菌株培养M13噬菌体DNA中会具有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体转染ung+菌株，尿嘧啶被除去，并因而产生某些可阻断DNA合成且对特定核酸酶敏感位点。病毒DNA被破坏，感染力下降约5个数量级。Kunkel 突变法正是运用上述机制，一方面在dut-ung-双突变菌株中培养恰当重组M13噬菌体，制备出带U单链DNA模板，然后与突变引物退火、引物延伸，然后将延伸反映混合物转染ung+受体菌，模板链因由U碱基位点存在而被破坏，野生型噬菌体产生受到抑制。大某些（80%）后裔噬菌体是由所转染不带U负链复制而来。由于该链是由突变引物延伸而来，因而，后裔噬菌体多带有突变目的基因。因此，Kunkel 突变法所产生突变体不需要运用标记寡核苷酸探针来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来拟定突变体。2）、DpnI法进行定点突变 常规大肠杆菌中质粒含Dpn位点 添加一对正反向突变引物 体外退火延伸 模板质粒对Dpn酶敏感，被切除 体外合成突变序列质粒成功转化原理：一对包括突变位点引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5端终结，再通过重复加热褪火延伸循环，这个反映区别于滚环扩增，不会形成各种串联拷贝。)正反向引物延伸产物退火后配对成为带缺刻开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于本来模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰，对DpnI敏感而被切碎（DpnI辨认序列为甲基化GATC，GATC在几乎各种质粒中都会浮现，并且不止一次），而体外合成带突变序列质粒由于没有甲基化而不被切开，因而在随后转化中得以成功转化，即可得到突变质粒克隆。2、重叠延伸PCR（4个引物）技术Forward mutagenic primerSP6 primer3Remove primersDenature and annealFirst PCRT7 primerReverse mutagenic primer DNA cloningT7 primerSP6 primerSecond PCRExtend to full length by DNA polymerase3（正向引物） （反向引物） （第一轮PCR，共有4种产物） （引物退火变性延伸） （只能5 3方向聚合） （用DNA聚合酶扩增至完整链） （第二轮PCR） （用两端引物扩增目基因）原理：由于采用品有互补末端引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后扩增反映中通过重叠链延伸,将不同来源扩增片段重叠拼接起来.此技术运用PCR技术可以在体外进行有效基因重组,并且不需要内切酶消化和连接酶解决,可运用这一技术不久获得其他依托限制性内切酶消化办法难以得到产物.3、蛋白质构造测定办法优缺陷 1）、蛋白质构造测定办法：X射线晶体构造测定、核磁共振波谱法（NMR）、三维电镜重构。 2）、X射线晶体构造测定：长处：辨别率高、不损伤样品、无污染、相对快捷、能得到晶体完整性大量信息；缺陷：晶体构象是静态，不能测定不稳定过渡态构象；诸多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于构造分析足够大单晶；（瓶颈）X射线晶体衍射工作流程较长。 核磁共振波谱法（NMR）：长处：同样具备高辨别率可以在溶液中操作，接近生理状态 分析并直接模仿出蛋白质空间构造、蛋白质与辅基和底物结合状况以及酶催化动态机理 缺陷：样品分子量要比较小（50KD如下）对不溶蛋白比较困难（如膜蛋白） 实验周期长（1年） 三维电镜重构： 长处：1.可以直接获得分子形貌信息；2.适于解析那些不适合应用X射线晶体学和核磁共振技术进行分析样品（如难以结晶膜蛋白，大分子复合体等）；3.适于捕获动态构造变化信息；4.易同其她技术相结合得到分子复合体高辨别率构造信息；5.电镜图像中包括相位信息，因此在相位拟定上要比X射线晶体学直接和以便。缺陷：最大缺陷是辨别率较低 对小分子蛋白效果不佳4、X射线晶体构造测定原理、环节及优缺陷1)、原理：1.光衍射现象2.X射线发现及应用3.晶体学基本知识4. X射线晶体衍射n 光衍射现象衍射现象：光波偏离直线传播而浮现光强不均匀 分布现象 n X射线发现及应用n 本质争论（波动说 微粒说）n X射线衍射发现n 晶体学基本知识n X射线晶体衍射 2）、X射线晶体构造测定基本过程：蛋白质获取（提纯）晶体生长并经冷冻技术解决重原子衍生物制备衍射数据收集衍生数据分析和改进构造模型获取（涉及修正） 3）、优缺陷：长处：辨别率高、不损伤样品、无污染、相对快捷、能得到晶体完整性大量信息；缺陷：晶体构象是静态，不能测定不稳定过渡态构象；诸多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于构造分析足够大单晶；X射线晶体衍射工作流程较长。 三、简答题（有些没听到）1、空间构造组件及其特点 螺旋（helix）、折叠（sheet）、环肽链（loop）、转角（turn）1）.-螺旋 构造： 多肽链中各个肽平面环绕同一轴旋转，形成螺旋构造. 肽链内形成氢键，氢键取向几乎与轴平行(同一方向），具备极性， N(+)、C(-) 。 中心无空腔，稳定 蛋白质分子为右手a-螺旋。（选） 螺旋一周，沿轴上升距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间距离为0.15nm; 沿主链计算，一种氢键闭合环包括13个原子，3.613 螺旋一侧重要分布亲水（荷电、极性）残基，另一侧重要集中疏水残基 对生物活性具备重要作用 可用螺旋转轮(helical wheel)方式预测两亲性 2）、折叠： 伸展构象，每圈只有2个氨基酸残基特殊螺旋 a-碳原子处在折叠角上，R基团处在棱角上与棱角垂直，两个氨基酸之间轴心距为0.35nm 折叠片也是一种重复性构造，可以把它想象为由折叠条状纸片侧向并排而成。肽主链沿纸条形成锯齿状。 氢键是在片层间而不是片层内形成。 折叠片上侧链都垂直于折叠片平面，并交替地从平面上下二侧伸出。3）、转角（turn）回折(reverse turn) 转折（转角）(b-turn) 转折(-turn)发夹 发夹(hairpin) 无规则卷曲2、蛋白质空间构造层次一级构造、二级构造、构造模体、构造域、三级构造/亚基、四级构造。3、第二遗传密码定义及其特点定义：无构造多肽链到有完整构造功能蛋白质信息传递某些遗传密码第二某些，蛋白质中氨基酸序列与其三维构造相应关系，称之为第二遗传密码或折叠密码。特点：简并性氨基酸序列不同肽链可以有极为相似甚至相似三维构造。 多意性相似氨基酸序列可以在不同条件下决定不同三维构造。 全局性在肽链上相距很远残基可以在空间上彼此接近而互相作用，并对分子总体构造产生重要影响；后形成肽段可以影响已经形成肽段个构象从而导致对分子整体影响等。4、表达系统宿主选取： 体内翻译系统 体外翻译系统：原核生物表达系统：大肠杆菌、枯草杆菌 真核生物表达系统：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统5、大肠杆菌表达载体组件复制起始点、选取性基因、多克隆位点（MCS）、启动子(Promoter)、终结子(Terminator)、核糖体结合位点(SD序列)四、其她一）、蛋白质工程绪论1、蛋白质工程化顺序：工程化：理念设计制造功能实现2、基因工程和蛋白质工程（选）基因工程蛋白质工程相似点都要改造基因，都属于分子水平产生基因（型）无新基因（型） 有新基因（型）产生蛋白质原有新联系蛋白质工程以基因工程为基本，是基因工程应用和延伸3、酶工程与蛋白质工程区别 酶工程：酶工程重点在于对已存酶合理充分运用和大量制备。 蛋白质工程：重点则在于对已存在蛋白质分子改造。4、蛋白质工程产生标志、研究内容、支撑技术1)、1983年，美国Ulmer在Science上一方面提出了“Protein Engineering“蛋白质工程诞生(Science，219：666-671. ) 2）、1. 蛋白质构造分析 基本2. 构造、功能设计和预测 基本应用与验证3. 创造和/或改造蛋白质新蛋白质 终目的3）、蛋白质构造解析技术、生物信息学分析技术、定点突变等遗传操作技术二）、蛋白质构造基本5、氨基酸构型与构象及多肽链构象表征参数 构型configuration：一种分子中原子特定空间排布（L-型单一手性分子） 构型转化时必要有共价键断裂和重新形成 不同构型分子除镜面操作外不能以任何方式重叠 化学上可以分离，不可由单键旋转互相转换 构象conformation：构成分子原子或基团绕单键旋转而形成不同空间排布 构象转化时不需要共价键断裂和重新形成 化学上难以区别和分离表征参数：（1）多肽链构象角 (f,y)（2）拉氏构象图（Ramachandra plot）及多肽链构象容许区6、可用螺旋转轮(helical wheel)方式预测两亲性7、折叠几种形式：平行型/反平行型、混合型（选）8、蛋白质一级构造：多肽链中氨基酸排列顺序，二硫键数目和排列方式9、维系蛋白质构造作用力：肽键、二硫键、氢键、离子键、疏水键 、范德华力维持蛋白质一级构造作用力是：肽 键、二硫键三）、蛋白质折叠10、20世纪60年代，Anfinsen基于还原变性牛胰RNase在不需其她任何物质协助下，仅通过去除变性剂和还原剂就使其恢复天然构造实验成果，提出了“多肽链氨基酸序列包括了形成其热力学上稳定天然构象所必须所有信息”“自组装学说” 。证明了一级构造决定高档构造。Anfinsen贡献：氨基酸序列决定空间构造蛋白质折叠热力学 第一种发现了二硫键异构酶 亲和层析纯化蛋白 合成葡萄杆菌核酸酶固相合成11、体外蛋白质折叠与细胞内新生肽链折叠区别 完整肽链在试管内重折叠相称于翻译完毕后才折叠，与新生肽链合成延伸与折叠同步进行不同。 细胞内新生肽链折叠是一种比蛋白质体外重折叠快得多过程。 温度、浓度、pH值不同 细胞和试管另一种重要差别是“大分子拥挤”问题。12、协助蛋白质和新生肽链折叠生物大分子 分子伴侣 （molecular chaperone） 折叠酶：催化与折叠直接关于化学反映酶。 蛋白质二硫键异构酶(PDI) 肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)13、分子伴侣与酶异同点及作用机制1）、分子伴侣与酶异同点 相似点 参加增进一种反映而自身并不在最后产物中浮现 不同点 分子伴侣对靶蛋白不具备高度专一性 分子伴侣催化效率很低 分子伴侣有时只是制止肽链错误折叠而不是增进其对的折叠。2）、作用机制 辨认折叠过程中形成折叠中间物非天然构造。与这些中间物结合，生成复合物，防止过早或者错误互相作用而制止不对的无效折叠途径，抑制不可逆聚合物产生，增进折叠向对的有效途径进行。 分子伴侣一方面会辨认折叠过程中形成折叠中间物非天然构象，而不会去理睬天然构象。 分子伴侣与初期形成中间物互相作用而防止它们之间聚合；一旦聚合形成，分子伴侣就无能为力了。14、蛋白质质量控制系统（选） 蛋白质是生物体内一切功能执行者。 蛋白质错误折叠可以导致某些疾病。 为保证细胞正常活动，细胞通过各种层次“质量控制”来辨认、纠正和防止错误发生。 15、折叠病与构象病区别（选） “分子病”:由于基因突变导致蛋白质分子中仅仅一种氨基酸残基变化就引起疾病状况，如地中海镰刀状红血球贫血症。分子病不是构象病。 “折叠病”:蛋白质分子氨基酸序列没有变化，只是其构造或者说构象有所变化引起疾病。四）、蛋白质理化性质16、蛋白质理化性质：1）、蛋白质折叠过程中会打破水有序化,则S溶剂为较大正值,因而有助于折叠态。2）、对于典型蛋白质来说,对折叠构造稳定性做出单项最大贡献是疏水残基引起S溶剂。3）、蛋白质稳定性重要指蛋白质物理上（热力学）稳定性，而不是化学稳定性。4）、与蛋白质折叠有关焓有两个： 通过平衡常数算得Vant Hoff 焓， DHVH 通过量热法获得量热焓，DHcal如果DHVH DHcal ，表白在 Tm处没有中间体存在，系统属于两态转变 五）、蛋白质分子模仿与设计17、设计层次、分类 “小改”：定位突变和化学修饰 “中改”：构造域进行拼接组装 全新蛋白质设计（“大改”） 完全从头设计全新蛋白质 基于某些理论和研究成果，设计出初始分子模型设计循环18、蛋白质设计目的及解决办法 设计目的 解决办法热稳定性对氧化稳定性引入二硫桥增长内氢键数目改进内疏水堆积增长表面盐桥把Cys转换为Ala或Ser把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu把Trp转换为Phe或Tyr19、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸构象特性 分子量都比较小 灵活性 GlyAlaPro 甘氨酸具备高度柔韧性，可在螺旋、 折叠处浮现，但更常用于铰链区或 转角。Gly在定点突变时，普通不适当随意变化 Pro比较刚性，常出当前转角 Ala处在两者之间，惯用作取代别氨基酸首选。20、Janus-真正符合Paracelsus挑战蛋白 六）、蛋白质修饰21、基因融合与基因连接办法及用途 办法：通过限制性内切酶、通过无义突变产生限制性内切酶、重叠延伸PCR 用途：1）、单分子活性组合 2）、检测和提纯 3）、提高基因表达量和增溶作用 4）、细胞定位22、非天然氨基酸引入办法（tRNA介导蛋白质工程）1）、在体内引入氨基酸类似物2）、氨酰化tRNA半合成酶介导体内外翻译3）、非天然氨基酸tRNA合成酶/tRNA对介导蛋白质工程复制起始点、选取性基因、多克隆位点、启动子、终结子、核糖体结合位点七）、蛋白质分离纯化与鉴定23、与蛋白质分离纯化有关理化特性 蛋白质溶解特性：盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法 蛋白质分子大小：透析、超滤、凝胶过滤、离心 蛋白质带电特性：电泳、离子互换层析 蛋白质吸附性质 蛋白质与配体特异性结合不同：免疫亲和层析、生物亲和层析、金属螯合亲和 层析、拟生物亲和层析 蛋白质分子形状 蛋白质变性和复性24、蛋白质纯化总原则和纯化环节 总原则 以合理效率、速度、收率和纯度，将目的蛋白从细胞所有其她成分特别是不想要杂蛋白中分离出来，同步仍保存其生物学活性和化学完整性。 环节 选取实验材料，实验材料预解决 蛋白质提取 蛋白质粗分级 蛋白质细分级 蛋白质鉴定 25、蛋白质粗分级、细分级办法粗分级：1）、使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目的蛋白质浓度往往较低，采用某些简朴办法使目的蛋白质浓缩，同步去除大量杂质，这些纯化办法就属于蛋白质粗分级。2）、硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超过滤、蛋白质结晶等。细分级：1）、粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数状况下还要依照蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特性或分子带电状况进一步纯化，这就是蛋白质细分级。2）、惯用技术：层析（分子筛层析、离子互换层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析）和电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电聚焦电泳（IEF）、双向电泳）26、不持续PAGE分离蛋白质原理（选） 电荷效应 浓缩效应 快慢离子效应 凝胶浓度差效应 分子筛效应27、镍离子层析办法属于亲和层析八）、蛋白质构造测定28、Western Blot基本原理与环节基本原理:在电场作用下将电泳分离多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽特异抗体来检测。普通流程：蛋白样品制备、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、抗原抗体显色反映。详细环节：转膜、封闭、一抗杂交、二抗杂交、底物显色29、晶体初步鉴定（选）小分子晶体蛋白质晶体边界完整，美丽常不完整，易浮现多晶硬度偏硬，易碎成2瓣或几瓣偏软，易碎成粉脱水不变化因脱水而变坏溶解性慢快偏光性强相对弱染色性弱强漂浮性下沉漂浮30、共振条件(1) 核有自旋(磁性核)(2)外磁场,能级裂分;(3)照射频率与外磁场比值n0 / H0 = g / (2p ) 外加射场频率与原子核自旋进动频率相似31、电子显微技术最大缺陷是辨别率较低谱图中化合物构造信息（1）峰位移(d )：每类质子所处化学环境，化合物中位置；（2）峰裂分数：相邻碳原子上质子数；（3）偶合常数(J)：拟定化合物构型。（4）峰数目：标志分子中磁不等性质子种类，多少种；（5）峰强度(面积)：每类质子数目(相对)，多少个；局限性之处：仅能拟定质子（氢谱）。九）、蛋白质组学32、HPP里程碑 两谱：蛋白表达谱、修饰谱 两图：蛋白连锁图、亚细胞定位图 三库：样本库、抗体库、数据库33、 蛋白质组研究整体技术特点：规模化、通量化、自动化技术目的（规定）：有效分离、精确鉴定、合理分析34、蛋白质组学研究手段 蛋白质组研究核心用于分离双向电泳(2 -DE) 蛋白质组技术支柱鉴定技术(Identification) 蛋白质组研究百科全书数据库(database)35、生物质谱技术p 原理:将样品离子化,依照不同质量和电荷差 异拟定分子量技术p 应用:蛋白质序列分析 蛋白质修饰分析p 最重要鉴定技术（支柱）36、 质谱仪构成：进样器、离子化源、质量分析器、离子检测器、控制电脑、数据分析系统离子源 电子碰撞 快原子轰击 电喷雾离子化 基质辅助激光解吸附质量分析技术 飞行时间质谱time-of-flight，TOF 离子阱质谱iron trap，IT 四极杆质谱quaddrupole，Q 傅立叶变换离子回旋共振质谱fourier transform ion cyclotron，FrICR十）、蛋白质芯片、蛋白质构造预测及表面展示37、生物芯片原则 （多选） 有规则（ordered） 显微尺度 (microscopic) 平面 (planar) 特异性地吸附 (specific)38、当前惯用生物芯片制作办法：（选）接触点样法、喷墨法、原位合成法（重要是美国Affymetrix公司开发）39、探针标记：（选）荧光标记（惯用Cy3绿色、Cy5红色）：cy3标记case，cy5对照，表达上调则偏绿，表达下调则偏红，表达不变则黄色。标记相反则成果相反。40、酵母双杂交系统构成（选）酵母双杂交宿主菌株（酵母菌株）、酵母双杂交载体质粒（DB载体质粒、AD载体质粒）41、诱饵与猎物分别与什么结合（选）DNA结合构造域(DB)和转录激活构造域(AD)，与DB 融合蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合蛋白称为“猎物”(prey)。42、蛋白质构造预测办法（Prediction Methods）（选）1）、二级构造预测放法n 记录学办法（Statistical method ）n Chou-Fasman 算法（Chou-Fasman）n GOR办法（GOR method）n 人工神经网络法（Neural network models）n 最邻近算法/同源分析法（Nearest neighbor methods）n 基于所学知识办法（Knowledge based method）n Lim-立体化学办法（Lim）n cohen 法（cohen）n 杂交系统办法（Hybrid system method） 2）、三级构造预测办法43、展示系统分类（选） 基于细胞展示系统：噬菌体展示系统、细胞表面展示系统展示系统 无细胞展示系统：核糖体展示系统、mRNA展示系统最先使用表面展示技术是噬菌体展示技术，在噬菌体展示技术中用是丝状噬菌体。