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Western blot 实验技术一、 原理Western Blot采用是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记二抗。通过PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上蛋白质或多肽作为抗原，与相应抗体起免疫反映，再与酶、荧光或同位素标记第二抗体起反映，通过底物显色或放射自显影以检测电泳分离特异性目基因表达蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平表达。Western Blot按实验环节分重要涉及两某些：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（重要目为按分子量大小对蛋白质进行分离）； Western印迹（在韧性支持物上通过抗原抗体杂交后显色强弱反映蛋白丰度）。1SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳： 该技术一方面在1967年由Shapir0建立，1969年由weber和Osborn进一步完善。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)，N，N，N，N 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联向成具备网状立体构造凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可依照不同蛋白质分子所带电荷差别及分子大小不同所产生不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化样品中只具有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质氢键和疏水键，并按一定比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷量远远超过其自身原有电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然电荷差别。因而，各种蛋白质 SDS复合物在电泳时迁移率，不再受原有电荷和分子形状影响。这种电泳办法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDSPAGE)。由于SDS PAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差别这一因素除去或减小到可以忽视不计限度，因而惯用来鉴定蛋白质分离样品纯化限度，如果被鉴定蛋白质样品很纯，只具有一种具三级构造蛋白质或具有相似分子量亚基具四级构造蛋白质，那么 SDSPAGE后，就只浮现一条蛋白质区带。SDSPAGE具备如下特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反映，在诸多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其敏捷度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，依照被分离物分子量选取适当浓度，通过变化单体及交联剂浓度调节凝胶孔径；(7)辨别率高，特别在不持续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高辨别率。 实验模式图 成果图2Western印迹：通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分离后蛋白质，在电场中转移到固相支持物上（惯用硝酸纤维素滤膜）。而后以固相载体上蛋白质或多肽作为抗原，与相应抗体起免疫反映，再与酶或同位素标记第二抗体起反映，通过底物显色或放射自显影以检测电泳分离特异性目基因表达蛋白成分。转膜模式图 杂交模式图二、实验准备一抗体选购流程（1）一方面拟定研究抗原分子正式及别用名，明确针对种属，明确除WB以外拟开展实验种类（如：Flow Cyt，ICC/IF，IHC - Wmt，IHC-Fr，IHC-P，IP,）。（2）从惯用信誉较好公司网站查询符合（1）中规定抗体，国外公司涉及：Abcam，ABGENT，cell signaling，Abnova，chemicon，novus，BD，epitomics。国内推荐：三鹰，中杉金桥，天德悦。仔细阅读抗体阐明书，需要考虑因素涉及：与否有文献已刊登，抗体效价，到货周期，抗体价格，单抗多抗，包装规格，抗体克隆号，并根据一抗种属选取相应二抗。（注意：普通国外抗体到货时间为3-5周，国内抗体3-5天）（3）订购成功后，定期与抗体代理公司联系，核算抗体状态并督促其及时到货。（4）收到抗体后，第一时间分装抗体避免重复冻融（置于冰上，推荐10 ul每支分装并保存于-20）。妥善保管阐明书，建议打印一份放实验室，原版放办公室。（5）每批订购抗体至少保存5 ul 存底，用于重要实验验证。二抗选购流程二抗重要选取国内抗体，本实验室选取天德悦公司产品，使用者重要需考虑种属问题。样本制备（1）样本制备前需明的确验目，并依照下述实验办法选取适当实验体系，如：待检测蛋白所处位置（细胞浆，细胞膜，分泌蛋白等）（2）尽量保持细胞培养稳定性（即实验可重复性），如:细胞培养密度，更换培养液时间等。（3）如使用蛋白酶解决，也许会将目蛋白降解，同步还引入了新蛋白质从而干扰实验。因而建议解决贴壁细胞时，直接在培养瓶中加入裂解液，并用细胞刮进行收集。（4）蛋白质稳定，自从细胞破裂后，诸多蛋白质就变得不稳定，其中某些蛋白质在细胞内释放出来蛋白酶作用下被水解，尚有某些在机械剪切力作用下发生断裂。因而在蛋白质提取过程中需要轻柔、低温（全程都在冰浴中进行，有条件可使用液氮）、加蛋白本酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等。（5）冻存样本需明确其保存时间、详细提取信息及保存状态。注意蛋白样本应尽量避免重复冻融。（6）惯用蛋白酶抑制剂有如下几种：丝氨酸蛋白酶抑制剂： PMSF，AEBSF-HCl，Aprotinin，Chymostatin，亮肽素（Leupeptin）天冬氨酸蛋白酶：PMSF，碘乙酸、抑肽素(Pepstatin),云芝发酵物巯基蛋白酶抑制剂：PMSF，TLCK，TPCK，Antipain-HCl,N-乙基顺丁烯二酰亚胺金属蛋白酶抑制剂（金属离子螯合剂）：EDTA，EGTA，塔罗肽苏氨酸蛋白酶：当前缺少资料酸酶抑制剂：NaF，激活原矾酸钠、焦磷酸钠、-甘油磷酸钠。（7）提取蛋白浓度信息：试剂订购本实验室WB常规试剂由黄启超和张璟组统一订购，订购信息如下：试剂耗材名称货号规格试剂耗材厂商试剂保存条件订购负责人代理公司联系人电话PMSF(100mM)ST50610ML碧云天-20黄启超教师雅怡李元洲磷酸酶抑制剂S18732g碧云天-20黄启超教师雅怡李元洲Beta-actin内参抗体BS-0061R100ul博奥森-20黄启超 教师雅怡李元洲Beta-actin mouse mAb(5B7)TDY041100ul天德悦（北京）-20黄启超 教师雅怡李元洲Beta-tublin mouse mAb(5G3)TDY043100ul天德悦（北京）-20黄启超 教师雅怡李元洲Goat anti-Rabbit IgG (H+L)，HRP ConjugatedS-004F100ul天德悦（北京）-20黄启超 教师雅怡李元洲Goat anti-Mouse IgG (H+L)，HRP ConjugatedS-001F100ul天德悦（北京）-20黄启超 教师雅怡李元洲蛋白彩虹Maker250ul/瓶晶彩-20黄启超 教师雅怡李元洲RIPA裂解液(强)P0013B100ml晶彩4黄启超 教师雅怡李元洲上样缓冲液5*还原型JC-PE0075只/包晶彩-20黄启超教师雅怡李元洲叠氮化钠BH315-1100g科昊室温阴凉黄启超教师科昊肖建芳发光液JC-PC001500MLMillipore4黄启超教师雅怡李元洲蛋白loading bufferJC-PE0075支/包晶彩-20黄启超 教师雅怡李元洲超厚滤纸室温干燥曲萍教师牛血清白蛋白DH016-1.125g科昊4曲萍教师科昊肖建芳脱脂奶粉DH220-3100gAmresco室温曲萍教师科昊肖建芳丙烯酰胺DH006-3.1500gGenview室温曲萍教师甲叉双丙烯酰胺室温曲萍教师Tris77-86-1500G室温曲萍教师甘氨酸DH149-1.1500G室温曲萍教师SDSDH286-1.2500G室温曲萍教师过硫酸胺室温曲萍教师NaCl室温曲萍教师HCL10019318500g国药集团化学试剂公司室温曲萍教师TEMED4曲萍教师Tween-209005645/sj0107b4612j生工生物室温曲萍教师甲醇室温曲萍教师考马斯亮蓝染色液P0017B250ml碧云天室温曲萍教师考马斯亮蓝染色脱色液P0017C500ml碧云天室温曲萍教师丽春红P0022120ml碧云天室温曲萍教师-巯基乙醇110112100ml西安国安生物室温曲萍教师薄滤纸室温曲萍教师封口袋室温曲萍教师配胶玻璃版180-15040.75莱博公司室温曲萍教师配胶短玻璃版180-1507莱博公司室温曲萍教师梳子180-180415孔莱博公司室温曲萍教师电泳电极室温曲萍教师PVDF膜(0.45uM)IPVH0001026.5cmX3.75mmillipore，immobilon室温曲萍教师PVDF膜(0.2uM)ISEQ0001026.5cmX3.75mmillipore，immobilon室温曲萍教师冰乙酸室温曲萍教师Kcl室温曲萍教师Na2HPO412H2O室温曲萍教师K2HPO4室温曲萍教师三氯乙酸室温曲萍教师冰乙酸室温曲萍教师三、操作环节：试剂配制 1. 10过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml 溶解后，0.1ml分装 4保存，保存时间为1周。2. 1.5M TrisHCl（pH8.8） lower buffer Tris 18.17g 超纯水 80ml 浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至100ml，过滤 ， 4保存3. 1.0M TrisHCl（pH6.8）upper buffer Tris 12.12g 超纯水 60ml 浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至100ml，过滤 ， 4保存，4. 10SDS SDS 5g 蒸馏水至 50ml 50水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中浮现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。5. 30Acr/Bic（29：1） 丙稀酰胺（Acr） 29g甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g超纯水至 100m溶解后，过滤 ，4避光保存。以上1-5可自行配制，也可购买SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒（博士德AR0138 or 碧云天 P0012）。6. 5XSDS上样缓冲 （碧云天有售） 0.25mol/L TrisHCl pH6.8 0.5mol/L二硫苏糖醇， 10 SDS 0.5溴酚蓝 50甘油7. 电泳液缓冲液 5x Running buffer Tris（MW121.14） 15.1 g 甘氨酸（MW75.07） 72 g SDS 5 g 蒸馏水至 1000ml 4保存 分离6200KDa 8. 转移缓冲液 1x Transfer buffer 甘氨酸（MW75.07） 14.4g Tris（MW121.14） 3.03g SDS 0.2 g 甲醇 200ml 蒸馏水至 1000ml 4保存 9 . 染色液 500ml 考马斯亮兰 0.5g 甲醇 200ml 冰醋酸 50ml 水 250ml10. 脱色液 500ml 无水乙醇 125ml 冰乙酸 50ml 水 325ml11. PBS缓冲液 10x NaCl 80g KCl 2g Na2HPO412H2O 36.151g (Or Na2HPO4 14.4g) K2HPO4 2.4g 蒸馏水至 1000ml 调pH至7.4 1 x PBST = 1 x PBS(1000ml) + 吐温20 (1ml)12. 10X丽春红染液 丽春红S 0.2g 三氯乙酸 3g 磺基水杨酸 3g 蒸馏水至 10ml 使用时将其稀释10倍13. 封闭液 5脱脂奶 4保存 （完达山脱脂奶粉） 脱脂奶粉 5g PBST 100ml 14. Stripping buffer 100ml -巯基乙醇 0.69ml SDS 2g 1MTris HCl PH 6.7 6.25ml 也可采用30%H2O2,但洗脱能力较Stripping buffer弱。15 PIERCE 或者 Millipore （P90719）ECL发光液 分A,B液，用前1:1配制。操作环节 （一） 蛋白样品制备 裂解液： 50ml Tris 0.121g Stock buffer ，可分装， 20 保存。 NaCl 0.146g NaF 0.105g 焦磷酸钠 0.112g 蔗糖 0.428gLysis buffer Stock buffer 500 ul DTT （1M） 0.5 ul 蛋白酶抑制剂 5ul （sigma，P8340）若研究磷酸化，加入Na3VO4 ，终浓度1mM。1 mol/L DTT (20 ml)1称取3.09 g DTT，加入到50 ml塑料离心管中。2加20 ml0.01 M NaOAc (pH5.2)，溶解后使用0.22m滤器过滤除菌。3分装后20oC保存。（参照分子克隆二版P884）此外，也可依照实验目购买碧云天RIPA裂解液，再加入蛋白酶抑制剂即可。（1） 单层贴壁细胞总蛋白提取： 1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残存培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2、每瓶细胞加3ml 4预冷PBS（0.01M pH7.27.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 3、按1ml裂解液加10 PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） 4、每瓶细胞加400 含PMSF裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5、裂解完后，用干净刮棒将细胞刮于培养瓶一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 6、于4下13500rpm离心25min。（提前开离心机预冷） 7、将离心后上清分装转移倒0.5min离心管中放于-20保存。 （2） 组织中总蛋白提取： 如心肌组织 称量100mg用预冷PBS清洗（300g 5min 4 ）（若无血液残留此步可省略）加Lysis buffer 500 ul 剪碎匀浆 1min 低温（在冰上操作）离心（1g 10min 4 ）取上清。 分装-80 冻存，蛋白定量。取某些样品 加入 loading buffer 5x （可购买碧云天loading buffer）， （蛋白：buffer = 体积比 4:1 ）煮沸5分钟， 20 保存。（二） 蛋白定量 PIERCE，BCA蛋白定量试剂盒，按阐明操作。（三） SDSPAGE电泳（1） 制胶凝胶浓度与蛋白分离范畴凝胶配方配胶 ，按顺序加，上下层胶一起配，节约时间和枪头，最后加AP和TEMED。（2） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 （3） 灌胶与上样 a、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶） b、 按前面办法配12分离胶，加入TEMED后及时摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后胶凝更快。（灌胶时开始可快某些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。） c、 当水和胶之间有一条折射线时，阐明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。（普通下层胶凝固需要40min。） d、 按前面办法配5浓缩胶,加入TEMED后及时摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔上样体积减小，因此在浓缩胶凝固过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1-2次就行了，不补胶问题也不大）。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子两边竖直向上轻轻将其拔出。 （普通上层胶凝固需要30min。）e、 测完蛋白含量后，计算含60-80g蛋白（依照自己实验需要进行选取，没有固定量）溶液体积即为上样量。取出上样样品至200lEP管中，加入5SDS 上样缓冲液至终浓度为1。（上样总体积普通不超过15l，加样孔最大限度可加20样品）（其实大一点垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到40l，胶做得较好话50也是问题不大）上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性。f、 加足够电泳液(1*RUNNING BUFFER)后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也也许使样品溢出。加入下一种样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤多次，以免交叉污染） （4） 电泳：电泳时间普通45 h，电压为40V较好，也可用60V。（为了加迅速度，浓缩胶时用80V跑，到分离胶后来用120V跑）电泳至溴酚兰刚跑出即可终结电泳，进行转膜（如果目条带比较大话，最佳使用可视蛋白Prestain marker，Fermentas0441和0671比较好。普通要让目条带跑过度离胶1/3比较好，不要局限于此阐明）。 （5） 清水冲洗胶板，小心取出胶，考染4h/过夜脱色液2h/过夜。观测脱色后胶里蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗带纹，并比较其分子量，判断与否是预期基因产物。（此步可省略），使用过染料可以重复使用多次。（四） 转膜 （1） 取出玻璃胶板，用自来水冲洗干净，塑料刀轻轻撬开上方玻璃板，沿胶分界线切掉上层胶，切掉多余胶，将切好胶放入预冷transfer buffer 中浸泡30min。（2） 按胶大小切PVDF膜（用尺子量胶大小，再用铅笔做标记），先用甲醇浸泡5min，再放入 transfer buffer 中。按胶大小切两块超厚滤纸（滤纸应当比膜小），放入transfer buffer 中浸泡5min以上使用。 （PVDF膜,millipore；超厚滤纸,Bio-Rad）（3） Bio-Rad半干转系统：电转三明治顺序如下 +极超厚滤纸 PVDF膜PAGE胶超厚滤纸 极顺序为：阴极滤纸胶膜滤纸。滤纸长宽分别比胶小12mm，而膜长宽分别比胶大12mm。绝对禁忌：上下两层滤纸由于过大而互相接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。各层间不能有气泡，特别是胶与膜之间。可用沾湿玻璃棒轻轻碾开，赶走气泡。与胶相接触面为膜正面，剪膜一角作为标记。（4） 盖上盖子，打开电源开始转膜。设立电压25v,时间30min。（40-100kd此条件即可）。电流应在0.1-0.2之间，不得不不大于0.3， 若过大应及时停止，也许是液体不好。（5） 转完后将膜用1丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上染液就可看到膜上蛋白。（普通不需要做这步） （6） 封闭将膜放在用5%脱脂奶粉中（平皿装），37C 1h。若所测样品中具有生物素则不能用脱脂牛奶，改用5%BSA（BSA 组分五，鼎国有售）。（五） 免疫反映（也可使用杂交袋进行一抗和二抗孵育，节约抗体） （1） 将一抗用PBST稀释至恰当浓度（在1.5ml离心管中）；剪下恰当大小一块儿PE手套铺于上，四角用水浸湿以使手套保持平整；将抗体溶液加到PE手套上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；用保鲜膜盖住，4度过夜（或者室温下孵育12h后），用PBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min。（2） 同上办法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育12h后，用PBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min。（六） 化学发光，显影，定影 （1） 将PIERCE 或者 Millipore （P90719）ECL发光液， A和B两种试剂1：1混合,待用。（2） 打开凝胶成像系统，打开抽屉铺上保鲜膜，尽量铺平。放上PVDF膜，关上抽屉，打开光圈，调节膜位置，详细如下： 打开电源开关； 打开成像系统及电脑； 铺上保鲜膜，放上PVDF膜，加上发光液，关闭抽屉； 点击桌面上Quantity One，从FILE下拉菜单中选取ChemiDoc XRS， 打开图像采集窗口，自动曝光，保存，FREEZE。（七） 凝胶图象分析：用凝胶图象解决系统分析目的带分子量和净光密度值。 （八）发光完PVDF膜仍可重复使用，strip掉抗体（stripping buffer， 50度45min； or 30% H2O2 37度15min），漂洗三遍后从封闭开始做其她抗体。四、常用问题对初学者看什么资料比较好？技术实验指南和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?1)玻璃没有洗干净，应当要洗得非常干净。2)过硫酸铵和TEMED加量不适当，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。3)加完试剂后来没有较好摇匀，导致有些部位聚合剂浓度过高，聚合相对较快导致胶不平。4)稍微注意手法，均匀加入。5)灌胶后应当用水或者正丁醇压胶面。6)边沿胶是不容易聚合完全，灌完胶后要及时加无水正丁醇覆盖，浓度越低胶越不要使用双蒸水压顶，此外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少量AP来增长边沿胶凝聚强度。7)温度也是影响胶聚合重要因素，也许为了让胶更快凝固而把胶放到50度温箱，由于受热不均匀，也会导致胶聚合不均匀。胶为什么总是漏？1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其他附件。2）避免玻璃边沿（与胶条接触处）破损很重要，特别是下面和胶条接触地方。3）核心是找一块很平桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了。4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。5）下面胶条注意不要老化，如果有裂纹话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用6）玻璃在使用过程中容易导致小缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了好久诸多小缺口玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽时候，去掉封条，把底上凡士林擦干。（注意，一定要擦干净，特别是少量进入了两隔玻璃之间空腔，由于凡士林不导电，会影响电泳效果。）7）可以在海绵垫下再垫某些纸，使得它与玻璃贴更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。8）由于两块玻板没有放完全对齐，底部不在同一种平面，因此封条封不严，重新对齐后就不漏了。后来每次只要在水平桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下拟定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，普通不会再漏。9）先把两块玻片放在夹子上，不要加快，放到架子上，使两块玻片底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样普通就不会漏胶了。条带跑得比正常窄？1）也许由于胶凝不均匀，聚合不是较好，灌胶时候尽量混匀。2）也许与拔梳子关于，拔梳应当迅速，冲洗加样孔时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，尚有就是要等批示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。3）也许是样品问题，如果盐浓度较高，便会挤压其他条带，致使条带宽窄不一，由于同样因素，样品在凝胶中速度会很慢，导致条带走较慢。4）常用因素是：每孔上样量不均匀，应保证每孔中上样量一致。5）也许是系统ph出了问题，有也许是电极缓冲液，也有也许是凝胶缓冲液，更新缓冲液。为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样效果呢？1）微笑是由于灌胶时候冷却不均匀，中间某些冷却不好，导致凝胶中分子有不同迁移率所致。这种状况在较厚凝胶以及垂直电泳时经常发生。“倒微笑“也称“皱眉”现象经常是由于垂直电泳时电泳槽装置不适当引起，特别是当凝胶和玻璃板构成三明治底部有气泡或接近隔片凝胶聚合不完全便会产生这种现象。2）书上说浮现“微笑”是由于整个胶冷凝不均匀，中间某些和两端受热不同样而致成了“倒微笑”也许是由于两端胶凝不好，加AP和TEMED后应当混合均匀。3）样品中盐浓度过高、点样量太多或每孔点样量不均匀、电泳电压不稳定或过高Western-blot制胶时好多泡泡怎么办？1）一方面，玻璃板一定要洗干净，用洗干净洗，冲干净后再用双蒸水冲一，晾干。配胶时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。2）配胶时混匀要轻，尽量不产气愤泡，上胶时要快，枪也不打究竟。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。虽然在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。3）倒胶时候，用1ml枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡。4）将胶在小烧杯里配好后，将电泳槽略微倾斜，将烧杯嘴靠在玻璃边沿，直接倒进去，速度快，并且不容易产气愤泡，不妨试试。5）用双蒸水封时建议用200ul枪加水，这样压力小，以免把胶冲起来。6）国产只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。7）分离胶中气泡与插梳子关于，垂直插容易产气愤泡，且不容意排除。将梳子倾斜5-10度插入，虽然产气愤泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。8)尚有一种制胶起泡泡因素，就是配胶液体所有在四度存储，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反映放热关系，液体中微小气泡在凝固凝胶中也会放大成可见较大泡泡，这种状况在夏天室温较高时更容易浮现。避免办法是将制胶成分中除催化剂外某些配备后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。凝胶肿胀或卷曲注意转膜之前，切割下来凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要具有20%甲醇。条带歪斜、或漂移由于转膜仪使用时间太长，两块板之间海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间也许存在潜在间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间空隙中流走。使用十几张普通草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常美丽。此外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也也许浮现上述状况。膜上单个或各种白点1）转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐级压紧，赶尽气泡。2）同步转膜液要提前配备好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在局部会抵抗蛋白转膜，减少转膜效率。转膜缓冲液过热缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高，同步转膜过程中注意降温。背景过高1）封闭不全。2）一抗或者封闭液与膜蛋白交叉反映。3）一抗或二抗中某些不纯物质也可以导致背景。4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都也许遇到这种状况。5)曝光时间控制。6、没有信号1)用单抗时比较容易浮现这种状况。2)蛋白表达量3)蛋白转膜效率4)一抗二抗效价问题微量进样器堵了怎么办？一方面从防止入手，每次用后进样器及时用蒸馏水清洗！如果堵了，不要紧，有办法：可以用如下办法解决：1）一方面重复推拉上样针，看与否可将堵塞物吹出来；2）办法1不灵，若是25或50ul针，把针从后侧拔出，然后重新插入，使其内部产气愤压，也许压出堵塞物质；3）如上述办法不灵可以在拔出后注入些清水，然后重新插入，用水压排出，4）最后办法，最灵办法：开始环节同第3种办法中，在加入水后，将上样器前端针部放在酒精灯上煅烧至红色（预计在什么位置堵），注意烧红某些不要距离玻璃过近，然后，趁热突然推针，将水强行推出，通道打开后，再通过稀酸或稀碱冲洗即可！5）或者放在超声清洗仪里，超声试试。在western实验中，普通有人采用TBS，有人采用PBS，能否有人解释一下两者在使用中区别？选取适当缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质稳定及保证明验重复性是很重要。PBS缓冲能力强于TBS（由于混合缓冲液在一定离子强度下经常具备更宽缓冲范畴），TBS在PH7.0如下缓冲能力较弱（但是PBS易污染）。但咱们经常要依照咱们实验目选用适当缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子互换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子互换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。western blot中使用TBS