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甲基化关键调控因子在乳腺癌中的表达和预后价值基金项目:广西教育科学“十四五”规划 年度高校创新创业教育专项课题()年度广西高等教育本科教学改革工程项目()右江民族医学院 年度校级科研课题()第一作者简介:罗凯迪男在读本科生:.通信作者:陈建荣:.本文引用格式罗凯迪陈建荣.甲基化关键调控因子在乳腺癌中的表达和预后价值.右江医学():.罗凯迪陈建荣(右江民族医学院公共卫生与管理学院广西百色)【摘要】目的 通过生物信息学方法筛选有关乳腺癌的关键调控因子研究其在乳腺癌治疗与预后的作用 方法 利用癌症基因组图谱()数据库提取和下载 甲基化调控因子和乳腺癌患者数据使用基因富集分析()数据库查找 甲基化相关基因 通过共识聚类分析两种不同临床因素的乳腺癌组织聚类使用最小绝对值收缩和筛选算子()与比例风险回归模型 回归分析构建预后特征并使用高通量基因表达数据库()进行结果验证 结果 共筛选出 个 甲基化相关调控因子有 个调控因子在乳腺癌组织样本中高表达在共识聚类中将样本中的乳腺癌患者分成聚类 和聚类 发现聚类 的预后比聚类 差且大部分 甲基化调控因子在聚类 中存在更高的表达 同时通过构建风险模型筛选出了、个预后相关关键调控因子并结合临床数据验证其可靠性 通过单因素和多因素 分析证明其是乳腺癌患者的独立预后影响因素 结论、这 个关键调控因子在乳腺癌的治疗和预后的判断上具有一定的价值【关键词】乳腺癌甲基化预后价值生物信息学调控因子中图分类号:.文献标志码:./.()【】.()().().()().右江医学 年第 卷第 期 .().【】目前乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一尽管经过科学家数十年的研究乳腺癌发病率仍以每年增加.的速度上升当前常用的治疗方法明显地减缓了乳腺肿瘤疾病的进展但乳腺肿瘤的复发仍然具有很高的发生率并且复发时患者的死亡率也更高甲基鸟嘌呤()是真核信使()帽处带正电荷的基本修饰 甲基化参与了许多重要的细胞过程如调节 的输出、翻译和剪接此外它在 稳定性和代谢等几个重要的 过程中也起着重要作用 甲基化相关调控因子可作为潜在的分子标志物应用于临床诊断和治疗同时可以为肺癌、鼻咽癌、肝内胆管癌等疾病的治疗提供新的见解 尽管 甲基化相关调控因子具有广阔的临床医疗价值但目前对 甲基化修饰相关机制与乳腺癌之间的关系知之甚少 因此需要进一步确定 甲基化相关调控因子在乳腺癌中的预后意义 本研究探讨 甲基化相关调控因子在乳腺癌中的作用并构建了一种风险模型旨在为乳腺癌患者提供一种有希望的预后标志物 资料与方法.数数据据下下载载 利用癌症基因组图谱()数据库(:/./)下载患者转录组数据和临床数据 共查找和下载到 例乳腺癌病例和 例正常邻近肿瘤组织数据进行进一步分析利用基因富集分析()方法查找 甲基化修饰相关通路调节因子目前发现有 个与 甲基化修饰有关通路包括、在内的 个调控因子被认为与 甲基化修饰有关 从 数据库中提取乳腺癌患者数据内有关这 个调控因子的表达数据进行后阶段的分析同时引入外部数据集进行验证使用从高通量基因表达数据库(:/./)中下载基于 平台的 数据集样本数据其中包含 个组织样本(个肿瘤样本 个正常样本)以及相对应的基因表达数据与患者生存信息.生生物物信信息息学学分分析析使用(版本 .:/./)中的 差异分析包筛选乳腺癌组织和正常组织之间 甲基化修饰的具有差异表达的调控因子 随后利用 中的“”和“”包绘制出热图与正常样本相比在肿瘤样本中表现显著的大多数调控因子是、然 而、这几个调控因子在正常样本和肿瘤样本中差异无统计学意义使用“”包分析在 例乳腺癌患者样本和 例正常相邻样本中 个显著表达的 甲基化相关调控因子的表达相关性使用 中的“”包绘制热图以方便观察 甲基化相关调控因子之间的关联为了进一步评估 甲基化相关调控因子表达水平与乳腺癌预后之间的关系使用“”包将乳腺癌样本进行共识聚类分析()考虑到样本数和后续分析便利性最终将样本分成两个不同的亚组 然后使用 中“”和“”包对数据进行主成分分析()以验证分类的结果利用单因素 回归分析来评估 甲基化相关调控因子与总体生存期()之间的关系为了对模型的复杂度进行更好的控制在研究中还进行了最小绝对值收缩和筛选算子()分析以鉴定出起到独立调控作用的 甲基化相关调控因子 最后确定了 个与 甲基化高度相关的关键调控因子 利用 中的“”包进行模型构建通过其生成的模型形成了不同调控因子的风险评分然后使用中位风险评分将乳腺癌患者分为低风险组和高风险组 使用“”包右江医学 年第 卷第 期 .对相关调控因子进行单因素生存分析 采用 曲线对该模型预后预测准确性进行可视化检验 评估低风险组和高风险组之间的临床病理变化的差异并使用可视化的热图展示出来 此外运用单因素和多因素 回归分析评估该风险评分能否作为独立预后指标的手段为了对这 种 甲基化相关调控因子风险特征的预后值进行验证引入了 数据库中的 数据集作为验证数据 使用与上述相同的方法计算患者风险评分 应用相同的临界标准将患者分为低风险组和高风险组 随后进行了单多因素生存分析以评估预后指标最后使用各种临床因素(性别、年龄、病理分期)和风险评分来制订预后指标图 使用 中“”包预测乳腺癌患者的 年、年和 年生存期.统统计计学学方方法法 所有统计数据均使用(版本.:/./)和 版本().:/./进行处理.是显著性阈值 单多因素分析比较了 个调节因子在乳腺癌组织和 样品正常组织中的表达 富集分析了临床特征与 甲基化相关调控因子的相关性 采用带有 秩和检验的单基因生存曲线来比较生存结果 上述代码可从:/./获得 结 果.鉴鉴定定乳乳腺腺癌癌中中差差异异表表达达的的 甲甲基基化化相相关关调调控控因因子子本文对乳腺癌()和邻近正常组织()中的 个 甲基化相关调控因子进行了差异表达分析 根据热图显示可以清楚地发现大多数 甲基化调控因子在乳腺癌组织和正常对照组织之间的表达差异有统计学意义 肿 瘤 样 本 中 调 控 因 子:、的表达水平均高于正常对照组织(.)(.)、(.)、(.)、(.)、(.)、(.)差异无统计学意义 此外为了进一步了解 个 甲基化相关调控因子之间是否存在内在关联还对这些调控因子进行了相关性分析 结果显示 和 之间的相关性最为显著 表达水平最有可能与 呈正相关 见图、图 注:甲基化相关调控因子在乳腺癌中的分析显示肿瘤组织和正常组织中 个 甲基化相关调控因子的热图(红色上调绿色下调)图 各基因相关性图右江医学 年第 卷第 期 .注:乳腺癌中 个 甲基化相关调控因子的相关性分析显示肿瘤组织和正常组织中 个 甲基化相关调控因子的热图(红色上调绿色下调)图 相关基因差异分析热图.甲甲基基化化相相关关调调控控因因子子的的共共识识聚聚类类分分析析 根据聚类结果当 时边界最清晰为了方便后续的研究并没有将全部乳腺癌样本数据分成三组 分组完成后根据 数据库中的 甲基化相关调控因子的表达结果将 个乳腺癌样品聚类为两组(分别称为聚类 和聚类)值得注意的是从整体上看聚类 的乳腺癌患者的预后比聚类 差但差异无统计学意义(.)此外研究中发现大多数 甲基化相关调控因子在聚类 中显著表达 在乳腺癌中一些临床特征(如性别、年龄、分期、淋巴结转移)在两个亚组之间差异无统计学意义 但是与聚类 相比聚类 在性别、淋巴结转移特征上相关性较高 见图 图 图 乳腺癌的共识聚类相关性图注:当聚类 时各组之间有较强的相关性当 时显示累积分布函数()图 图注:聚类 和聚类 中乳腺癌的临床病理学特征和总生存期的差异显 示 甲基化相关调控因子共识表达所定义的两个亚组的热图和临床病理学特征(红色上调绿色下调)图 不同聚类总体生存曲线图右江医学 年第 卷第 期 .注:例 乳腺癌患者的单因素总体生存期()曲线 聚类 中的乳腺癌患者用红色标记聚类 中的乳腺癌患者用蓝色标记:甲基化相关调控因子共识表达所定义的两个亚组的热图和临床病理学特征(红色上调绿色下调)图 聚类分组结合临床特征热图.基基于于 甲甲基基化化调调控控因因子子的的表表达达水水平平建建立立预预后后风风险险模模型型 考虑到 甲基化相关调控因子与乳腺癌患者预后之间的强相关性本研究同时对 个关键调控因子的表达水平进行了单因素 回归分析 结果显示 个关键调控因子都与总体生存曲线显著相关(只有 被认为是保护基因 随后使用 分析鉴定具有最强预后能力的 甲基化相关调控因子 最终选择了 个最优基因(、)建立乳腺癌风险模型以及计算风险评分的相应系数 风险评分的计算公式如下:风险评分(.)(.)(.)(.)为了探索这 个调控因子特征模型的预后作用根据中位风险评分将乳腺癌患者分为低风险组和高风险组 生存分析曲线显示与低风险组评分患者相比高风险组评分患者的 更差(.)高风险组的 年 为 低风险组 为 还进行了 曲线的分析并评估了 年、年和 年的总体生存率曲线下面积()分别为.、.和.这显示出对生存结果的良好预测能力此外通过绘制乳腺癌患者的风险评分分布图显示出每个患者的生存状态 在热图中可以观察到高风险组和低风险组人群中 个预后调控因子的表达情况在热图的上方绘制了有关临床相关性的信息在比较低风险组和高风险组的临床参数时观察到 分期、存活率和年龄差异均有统计学意义(均.)见图 图 图 预后相关基因森林图右江医学 年第 卷第 期 .图 回归构建模型()图 风险评分分布图图 生存状态分布图右江医学 年第 卷第 期 .注:预后模型的生存分析两个组中的患者被分配到低风险(蓝色)注:预后模型的生存分析两个组中的患者被分配到低风险(蓝色)组和高风险(红色)组使用中位风险评分作为临界值在 组和高风险(红色)组使用中位风险评分作为临界值 年期、队列中低风险组的生存概率高于高风险组(.)年期和 年期 分别为.、.和.图 高低风险组生存曲线 图 曲线注:热图显示了临床病理学特征的分布以及高风险和低风险人群中 种 甲基化相关调控因子的表达图 结合临床特征热图注:为临床病理学参数和总体生存率单因素 回归分析 为临床病理学参数和总体生存率的多因素 回归分析图 临床病理学参数和总体生存率的多因素 回归分析图右江医学 年第 卷第 期 .使使用用 数数据据库库验验证证预预测测特特征征 为了验证其他数据集对 个关键调控因子特征是否存在生存预测的价值研究还引入了 数据集()进行验证 根据 数据的风险评分中位值 数据集中共有 例乳腺癌患者被分为高风险()组和低风险()组 与 数据中的结果相同生存分析曲线表明与高风险组患者相比低风险组的乳腺癌患者的总体生存率曲线明显更好(.).利利用用 个个关关键键调调控控因因子子风风险险特特征征独独立立预预测测乳乳腺腺癌癌患患者者的的预预后后 对临床信息病例进行整理筛选后(去除信息不全的样本)共有 例样本符合进行 回归分析条件 单因素分析结果显示乳腺癌患者的 曲线与 个关键调控因子的风险评分和肿瘤分期显著相关(.)通过多因素 回归分析证明了这 个关键调控因子风险特征能够独立于其他临床病理学特征并作为乳腺癌的预后因素这体现了乳腺癌患者的风险评分和分期与总体生存期曲线独立相关(.)以上结果表明这 个关键调控因子的风险特征能够独立于性别、年龄、风险评分预测预后情况该 个基因风险特征可以作为乳腺癌的独立预后因素.建建立立乳乳腺腺癌癌的的预预后后列列线线图图为了提供一种预测个体生存的定量方法研究根据年龄、性别、组织学等级、病理分期和风险评分建立了一种新的预后列线图(图)结果证明该模型可以系统地预测乳腺癌患者未来 年、年和 年的生存率图 多因素分析列线图 讨 论 国际癌症研究机构最新报告显示女性乳腺癌的发病率已经超过肺癌成为目前全球癌症发病率最高的恶性肿瘤之一 另外乳腺癌患者的总体生存率虽然与其他疾病相比较高但复发率仍远未令人满意据相关报道女性乳腺癌患者治疗后复发转移率达 大概率的复发不仅威胁患者身体健康增加了病死率对患者治疗信心也是很大的打击 因此研究乳腺癌预后水平有计划地进行临床干预可能对降低乳腺癌复发率有积极的意义 要达到此目的需要进一步阐明导致乳腺肿瘤发生的潜在分子机制基因调控和抑制剂近年来引起了学术界的强烈兴趣使用多基因特征的风险评分系统来预测人类癌症的预后水平已经随着 和微阵列技术的发展而广泛地应用 然而在癌症领域中关于 甲基化修饰的研究仍处于初始阶段 在该研究中使用了 个 甲基化关键调控因子建立了预后特征并证明此风险评分能够独立预测乳腺癌患者的预后 因此本研究中的风险特征可以帮助临床医生更准确地进行个性化的生存预测正如预后模型所示 是唯一与乳腺癌患者预后呈正相关的 甲基化调控因子这表明 可能对乳腺癌产生抑制作用 是 蛋白的第三亚家族 到目前为止虽然一部分的研究结果展示了 与人类肿瘤之间的相关性但其生物学功能和相关分析仍然需要进一步研究 目前认为 在各种类型的人类癌症中表现出异质性作用 例如 过度活化可能导致 蛋白的丰度和活性增加提示 可能促进了髓母细胞瘤()的生长和进展因此 基因在乳腺癌中的具体作用仍然难以捉摸需要更多的研究来证明根据前面的研究除 外另外 个关键调控因子、被认为是危险基因这证明其可能对乳腺癌发展起到了促进的作用 可以促进血管的生成和生长在其他癌症中也发现了类似的作用 在前人大量的研究中 被证实与癌细胞的生存有关 也被发现能上调 ()基因的表达并在肺癌细胞增殖的基因表达上具有高表达的特征这对肺癌的发生、发展也起到促进作用 以上的研究右江医学 年第 卷第 期 .表明、这几个基因在多种疾病中都起到促进肿瘤进展的作用未来可以集中研究它们在癌症预防、治疗与控制的方法尽管如此必须承认本研究具有一定的局限性首先由于本研究的数据来自 和 数据库因此需要通过实验的进一步分析来验证这个发现 其次正常组和肿瘤组之间的样本量差异较大这可能会导致研究结果出现偏差 因此本研究的结果可能无法推广到所有人群综上所述本研究证明了 甲基化相关调控因子表达特征具有较大的乳腺癌预后预测潜力 研究结果为进一步探讨乳腺癌中 甲基化的相关调控因子作用提供了额外的证据不过还需要进一步的实验和临床研究来证实这些发现参 考 文 献 .():.():.:.:.():.高娟赵建国.乳腺癌复发转移的相关因素分析.中华转移性肿瘤杂志():.():.:.():.():.():.(收稿日期:修回日期:)(编辑:梁明佩)本刊对有国家自然科学基金资助的研究型论著不收版面费欢迎投稿右江医学 年第 卷第 期 .