培养基制备的基本方法和注意重点事项.docx

培养基制备基础方法和注意事项1. 培养基配方选定同一个培养基配方在不一样著作中常会有一些差异。所以，除所用是标准方法，应严格按其要求进行配制外通常均应尽可能搜集相关资料加以比较查对再依据自己使用目标加以选择，统计其起源。2 培养基制备统计每次制备培养基均应有统计，包含培养推各称，配方及其起源和多种成份牌号。最终pH 值、消毒温度和时间制各日期和制备者等，统计应复制一份，原统计保留备查，复制统计随制好培养基一同存放、以防发生混乱。3.培养基成份称取培养基多种成份必需正确称取并要注意预防错乱最好一次完成，不要中止。可将配方置于傍侧，每称完一个成份即在配方上做出记号，并将所需称取药品一次取齐，置于左侧，每种称取完成后，即移放于右侧。完全称取完成后还应进行一次检验。4.培养基各成份混合和溶化培养基所用化学药品均应是化学纯。使用蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢锅加热溶化也可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动，以防焦化、如发觉有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成份溶化后，再用较小火力使全部成份完全溶化迄至煮沸。如为琼脂培养基，应先用一部分水将琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成份，然后将两溶液充足混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失水分，最终必需加以补足。5.培养塞pH 初步调整培养基各成份完全溶解后，应进行pH 初步调正，因培养基在加热消毒过程中、pH 会有所改变，比如，牛肉浸液约可降低pH0.2.而肠浸液pH 却会有显著升高。所以，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基最终pH ，确保培养基质量。pH 调正后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物析出。6培养基过滤澄清液体培养基必需绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，所以，须要采取过滤或其它澄清方法以达成此项要求。通常液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应拆叠成折扇成漏斗形，以避免因液压不均匀而引发滤纸破裂。琼脂培养基可用清雪白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达成澄清要求、则须用蛋清澄清法。立即冷却至55-60 培养基放入大三角烧瓶内，装入量不得超出烧瓶容量1/ 2 ，每1000ml 培养基加入1-2个鸡蛋蛋白强力振摇3-5 分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。若能自行沉淀者，亦可静置冰箱中1-2日、吸收其上清液即可。7.培养基分装培养基分装，应按使用目标和要求，分装于试管、烧瓶等合适容器内。分装量不得超出容器装盛量2/ 3 。容器口可用垫有防湿纸棉塞封堵，其外还双用防水纸包扎（现试管通常多有用螺旋盖者）。分装时最好能使用半自动或电动定量分装器。分装琼脂抖面培养基时，分装量应以能形成2 / 3 底层和1/ 3 斜面量为合适。分装容器应予先清洗洁净并经干烤消毒，以利于培养基根本灭菌。每批培养基应另外分装20ml 培养基于一小玻瓶中，随该批培养基同时灭菌，认为测定该批培养基最终pH之用。8.培养基灭菌通常培养基可采取121 高压蒸汽灭菌15分钟方法。在多种培养基制备方法中，如无特殊要求，即可用此法灭菌。一些畏热成份，如糖类，应另行配成20% 如或更高浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应从无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50 左右培养基中。琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出、待冷至55-60时，摆置成合适斜面、待其自然凝固。9. 培养基质量测试每批培养基制备好以后应仔细检验一遍：如发觉破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。将全部培养基放入361 恒温箱培养过夜，如发觉有菌生长，即弃去。用相关标准菌株接种1-2 管或瓶培养基，培养24- 48 小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并反复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。10.培养基保留培养基应存放于冷暗处，最好能放于一般冰箱内。放置时间不宜超出一周，倾注平板培养基不宜超出3天。每批培养基均必需附有该批培养基制各统计副页或显著标签。培养基常规配制程序一、目标要求了解培养基配制原理。了解培养基常规配制程序。了解培养基配制过程各步骤要求和注意事项。二、基础原理 正确掌握培养基基配制方法是从事微生物学试验工作关键基础，因为微生物种类及代谢类型多样性，所以用于培养微生物培养基种类也很多，它们配方及配制方法虽各有差异。但通常培养基配制程序却大致相同，比如器皿准备，培养基配制和分装，棉塞制作，培养基灭菌，斜面和平板制作和培养基无菌检验等基础步骤大致相向。三、试验材科(一)药品待配多种培养组成成份，琼脂，1mol/L NaOH溶液，1mol/l (升，统一用大写)HCl溶液。(二)仪器天平或台秤，高压蒸汽灭菌锅。(三)玻璃器皿移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。(四)其它物品药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸等。四、试验内容(一)玻璃器皿洗涤和包装1玻璃器皿洗涤 玻璃器皿在使用前必需洗刷洁净。将锥形瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂水浸泡。再用自来水及蒸馏水冲洗，洗刷洁净玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。 2灭菌前玻璃器皿包装 (1)培养皿包装 培养皿由一盖底组成一套。可用报纸将几套培养皿包成一包，或将几套培养皿直接置于特制铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后培养皿须经灭菌以后才能使用。 (2)移液管包装 在移液管上端塞入小段棉花(勿用脱脂棉)。它作用是避免外界及口中杂菌吹入管内，并预防菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左有。棉花本身长度约1-15cm。塞棉花时，可用一外圈拉直曲别针，将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。先将报纸裁成宽约5cm左右长纸条，然后将已塞好棉花移液管尖端放在长条报纸一端，约成45度角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩下纸条，折叠打结，准备灭菌(见图511)。(二)液体及固体培养基配制过程 1液体培养基配制 (1)称量通常可用1/100粗天平称量配制培养基所需多种药品。先按培养基配方计算各成份用量，然后进行正确称量。 (2)溶化 将称好药品置于一烧杯中，先加入少许水(依据试验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻棒搅动，加热溶解。 (3)定容 待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按百分比吸收一定体积溶液，加入至培养基中。 (4)调pH 通常见pH试纸测定培养基pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/l NaOH或1mol/l HCl溶液进行调整。调整pH时，应逐滴加入NaOH或HCl溶液，预防局部过酸或过碱，破坏培养基中成份。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达成所需pH为止。 (5)过滤 用滤纸或多层纱布过滤培养基。通常无特殊要求时，此步可省去。 2固体培养基配制配制固体培养基时，应将已配好液体培养基加热煮沸，再将称好琼脂(15-2)加入，并用玻棒不停搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最终补足因蒸发而失去水分。(三) 培养基分装 依据不一样需要，可将己配好培养基分装入试管或锥形瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口培养基，并将脱脂棉弃去。 1试管分装取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再和另一玻璃管相接，橡皮管中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内(图512)。装入试管培养基量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15150 mm时，液体培养基可分装至试管高度14左右为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面固体培养基分装量为管高15(约34m1)；半固体培养基分装量为管高13为宜。 2锥形瓶分装 用于振荡培养微生物用时，可在250 m1锥形瓶中加入50 ml液体培养基，若用于制作平板培养基用时，可在250 m1锥形瓶中加入150ml培养基，然后再加入3g琼脂粉(按2计算)，灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。(四)棉塞制作及试管、锥形瓶包扎 为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为预防杂菌污染，则必需对通入试管或锥形瓶内空气预优异行过滤除菌。通常方法是在试管及锥形瓶口加上棉花塞等。 1试管棉塞制作制棉塞时，应选择大小、厚薄适中一般棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞(图513)。制作棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入。棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞23在试管内，13在试管外(图514)。现在也有采取金属或塑料试管帽替换棉塞。直接盖在试管口上。灭菌待用。将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽试管拥成一捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制日期，灭菌待用。 2锥形瓶棉塞制作 通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布替换棉塞包在瓶口上。现在也有采取无菌培养容器封口膜直接盖在瓶口，既确保良好通气，过滤除菌又操作简便，故极受欢迎。 在装好培养基并塞好棉塞或包上八层纱布或盖好培养容器封口膜锥形瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。(五)培养基灭菌 培养基经分装包扎以后，应立即进行高压蒸汽灭菌，100Pa灭菌20min（灭菌条件依据培养基不一样有所差异，含糖培养基105，30min）。如因特殊情况不能立即灭菌，则应暂存于冰箱中。(六)斜面和平板制作 1斜面制作 将已灭菌装有琼脂培养基试管，趁热置于木棒上，使成合适斜度，凝固后即成斜面(图515)。斜面长度不超出试管长度12为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。 2平板制作 将装在锥形瓶或试管中已灭菌琼脂培养基融化后，待冷至50左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上冷凝水太多，温度低于50，培养基易于凝固而无法制作平板。 平板制作应采取无菌操作，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶底部或试管，左于同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，月左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口恰好伸入，倾入10-12m1培养基，快速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿、使培养基均匀分布于整个平皿中、冷凝后即成平板(图516)。(七)培养基无菌检验 灭菌后培养基，通常需进行无菌检验。最好从中取出1-2管（瓶），置于37恒温箱中培养12天，确定无菌后方可使用。(八)无菌水制备 在每个250 mL锥形瓶内装99mL蒸馏水并塞上棉塞。在每支试管内装4.5m1蒸馏水。塞上棉塞或盖上塑料试管盖。再在棉塞上包上一张牛皮纸。高压蒸汽灭菌，100 Pa灭菌20分钟。