鹿茸多肽预处理通过miR-...H9c2细胞损伤的保护作用_周高峰.pdf

第 49 卷 第 2 期2023年 3 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.2Mar.2023DOI：10.13481/j.1671587X.20230213鹿茸多肽预处理通过 miR-133a调控 TGF-/Smad信号通路对 TBHP诱导心肌 H9c2细胞损伤的保护作用周高峰1,肖静1,2,周佳1,刘俊秀1,律广富3,王雨辰1,林贺1,黄晓巍1（1.长春中医药大学药学院临床药学与中药药理教研室，吉林 长春 130117；2.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100094；3.长春中医药大学 吉林省人参研究科学院中药药理组，吉林 长春 130117）摘要 目的目的：探讨鹿茸多肽（VAP）预处理对叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导大鼠心肌 H9c2细胞损伤的保护作用，阐明 VAP 对 miR-133a/转化生长因子 （TGF-）/Smad 轴 的 作 用 及 其 机 制。方法方法：将 H9c2 心肌细胞分为空白对照组、空白血清组、TBHP 组、TBHP+低剂量（100 mg kg1）VAP 组、TBHP+高剂量（400 mg kg1）VAP 组和 miR-133抑制剂（miR-133 inhibitor）组。空白对照组不做任何处理，其余各组细胞经 VAP 处理 24 h 后，给予 200 mol L1 TBHP 处理；miR-133 inhibitor 组细胞转染 miR-133 inhibitor 24 h，给予 400 mg kg1 VAP 处理 24 h，并给予 200 mol L1 TBHP处理。MTT 法检测各组 H9c2细胞存活率，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组细胞培养上清液中肌钙蛋白 T（cTnT）、肌钙蛋白 I（cTnI）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平，实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）法检测各组 H9c2细胞中 miR-133表达水平，Western blotting法检测各组 H9c2细胞中转化生长因子 1（TGF-1）、磷 酸 化 Smad2/3（p-Smad2/3）和 Smad4 蛋 白 表 达 水 平。结果结果：MTT 法检测，与 TBHP 组比较，TBHP+低剂量 VAP 组和 TBHP+高剂量 VAP 组 H9c2细胞存 活 率 升 高（P0.05）。ELISA 法检测，与空白对照组比较，TBHP 组 H9c2 细胞中 cTnT、cTnI 和 CK-MB 水平升高（P0.05）；与 TBHP组比较，TBHP+低剂量 VAP组和 TBHP+高剂量 VAP组 H9c2细胞中 cTnT、cTnI和 CK-MB 水平降低（P0.05）。RT-qPCR 法 检 测，与 空 白 对 照 组 比 较，TBHP 组 H9c2 细 胞 中miR-133a 表达水平降低（P0.05）；与 TBHP 组比较，TBHP+低剂量 VAP 组和 TBHP+高剂量VAP组 H9c2细胞中 miR-133a表达水平升高（P0.05或 P0.01），miR-133 inhibitor 组 H9c2细胞中 miR-133a 表达水平明显降低（P0.01）。Western blotting 法检测，与空白对照组比较，TBHP 组H9c2 细 胞 中 TGF-1、p-Smad2/3 和 Smad4 蛋 白 表 达 水 平 升 高（P0.05）；与 TBHP 组 比 较，TBHP+低剂量 VAP组和 TBHP+高剂量 VAP组 H9c2细胞中TGF-1、p-Smad2/3和 Smad4 蛋白表达水 平 降 低（P0.05）。结论结论：VAP 预处理通过 miR-133a 调控 TGF-/Smad 信号通路保护 TPHP 诱导的大鼠心肌 H9c2细胞损伤。关键词 鹿茸多肽；心肌损伤；微小 RNA-133a；转化生长因子；血清药理学中图分类号 R285.5文献标志码 A文章编号 1671587X(2023)02036908收稿日期 20220502基金项目 吉林省卫健委技术创新项目（2020J068）；吉林省发改委创新能力建设项目（2021C011）作者简介 周高峰（1995），女，内蒙古自治区通辽市人，在读硕士研究生，主要从事心血管及内分泌药理学方面的研究。通信作者 黄晓巍，主任药师，博士研究生导师（E-mail：）；林 贺，副教授，硕士研究生导师（E-mail：）369第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报（医学版）Protective effect of Velvet antler polypeptide pretreatment on myocardial H9c2 cell injury induced by TBHP through regulating TGF-/Smad signaling pathway with miR-133aZHOU Gaofeng1,XIAO Jing1,2,ZHOU Jia1,LIU Junxiu1,LYU Guangfu3,WANG Yuchen1,LIN He1,HUANG Xiaowei1（1.Department of Clinical Pharmacy and Pharmacology of Chinese Medicine，School of Pharmacy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China；2.Institute of Medicinal Plant Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100094，China；3.Department of Pharmacology of Traditional Chinese Medicine，Jilin Ginseng Academy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China）ABSTRACT Objective：To explore the protective effect of velvet antler peptide（VAP）pretreatment on the myocardial H9c2 cell injury of the rats induced by tert-butyl hydroperoxide（TBHP），and to clarify the effect of VAP on miR-133a/transforming growth factor-（TGF-）/Smad axis and its mechanism.Methods：The H9c2 cells were divided into blank control group，blank serum group，TBHP group，TBHP+low dose（100 mg kg1）of VAP group，TBHP+high dose（400 mg kg1）of VAP group，and miR-133 inhibitor（miR-133 inhibitor）group.The cells in blank control group were given no treatment，and the cells in the other groups were treated with VAP for 24 h，then were treated with 200 mol L1 TBHP；the cells in miR-133 inhibitor group were transfected with miR-133 inhibitor for 24 h，treated with 100 mg kg1 VAP for 24 h+200 mol L1 TBHP.MTT assay was used to detect the survival rates of the H9c2 cells in various groups；the levels of troponin T（cTnT），and cardial troponin T（cTnI）in culture supernatant of the cells in various groups were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method and creatine kinase-MB（CK-MB）；the expression levels of miR-133 in the H9c2 cells in various groups were detected by real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）method；the expression levels of transforming growth factor-1（TGF-1），phosphorylated Smad2/3（p-Smad2/3），and Smad4 proteins the in H9c2 cells in various groups were detected by Western blotting method.Results：The MTT results showed that compared with TBHP group，the survival rates of H9c2 cells in TBHP+low dose of VAP group and TBHP+high dose of VAP group were increased（P0.05）.The ELISA assay results showed that compared with blank control group the levels of cTnT，cTnI，and CK-MB in the H9c2 cells in TBHP group were increased（P0.05）；compared with TBHP group，the levels of cTnT，cTnI，CK-MB in the H9c2 cells in TBHP+low dose of VAP group and TBHP+high dose of VAP group were decreased（P0.05）.The RT-qPCR results showed that compared with blank control group，the expression level of miR-133a in the H9c2 cells in TBHP group was decreased（P0.05）；compared with TBHP group，the expression levels of miR-133a in the H9c2 cells in TBHP+low dose of VAP group and TBHP+high dose of VAP group were increased（P0.05 or P0.01），and the expression level of miR-133a in the cells in miR-133 inhibitor group was decreased（P0.01）.The Western blotting results showed that compared with blank control group，the expression levels of TGF-1，p-Smad2/3，and Smad4 proteins in the H9c2 cells in TBHP group were increased（P0.05）；compared with TBHP group，the expression levels of TGF-1，p-Smad2/3，and Smad4 proteins in the H9c2 cells in TBHP+low dose of VAP and TBHP+high dose of VAP groups were decreased（P0.05）.Conclusion：VAP pretreatment can protect the myocardial H9c2 370周高峰，等.鹿茸多肽预处理通过 miR133a调控 TGF/Smad信号通路对 TBHP诱导心肌 H9c2细胞cell injury of the rats induced by TBHP through regulating the TGF-/Smad signaling pathway with miR-133a.KEYWORDS Velvet antler polypeptide；Myocardial injury；MicroRNA-133a；Transforming growth factor-；Serum pharmacology急 性 心 肌 梗 死（acute myocardial infarction，AMI）在心血管疾病中死亡率较高，死亡人数近年来迅速增加，并倾向于在年轻个体中较多发生，且预后较差，给患者和社会均带来沉重负担1。鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，是哺乳动物中唯一具有完全再生能力的附属器官2。心肌梗死后再灌注治疗也会导致炎症和氧化应激等一系列的病理生理反应，进而导致细胞凋亡及坏死。慢性心肌梗死后会发生持续性的细胞凋亡及心室重构和 心肌 纤维 化，最 终导 致心 力衰竭3。心肌梗死及再灌注损伤仍是临床难题，中药及其提取物在保护心脏、防止心肌细胞凋亡及纤维化等方面具有良好的疗效4。本草纲目 记载：“鹿茸能生精补髓，养血益阳，强筋健骨，治一切虚损，耳聋，目暗，眩晕，虚痢”。鹿茸多肽（velvet antler polypeptide，VAP）对大鼠循环、免疫、运动和神经系统具有改善和治疗作用，并对心肌缺血损伤、心肌梗死、心肌缺血再灌注和冠心病心绞痛具有保护作用5-6。VAP 通过调控 Notch 通路和蛋白 激 酶 B/哺 乳 动 物 雷 帕 霉 素 靶 蛋 白（protein kinase B/mammalian target of rapamycin，Akt/mTOR）信号通路调控内皮祖细胞增殖和迁移保护心脏微血管7；VAP 能明显降低阿霉素诱导的心肌细胞损伤模型中转化生长因子 （transforming growth factor-，TGF-）蛋白表达水平，减少心肌细胞凋亡，保护心肌组织8；通过调节心肌特异性 转 录 因 子 Nkx2.5 和 GATA 结 合 蛋 白 4（transcription factor GATA4，GATA4）的表达缓解 阿 霉 素 所 致 的 心 肌 细 胞 损 伤9。微 小 RNA（microRNAs，miRNAs）是一类由内源基因编码的长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子。miR-133是一种肌源性miRNA，可通过降低TGF-1表达保护心肌细胞，在正常的心肌细胞中表达丰富，具有调节心肌细胞肥大和心肌细胞分化发育的功能，其表达与多种心脏疾病密切相关10-11。李敏12研究表明：稳心中药可提高血清球蛋白水平，降低血清心肌酶水平，增加 miR-133表达水平发挥强心作用。YU 等13研究发现：芦荟大黄素可通过上调 miR-133表达水平来减轻心肌梗死和心肌细胞凋亡。同时，miR-133可调控 TGF-/Smads、丝裂 原 活 化 蛋 白 激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和 磷 脂 酰 肌 醇3-激 酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/Akt 等 多 条 通路改善心肌细胞能量代谢，修复受损心肌14。本课题组前期动物实验研究15表明：VAP 可通过TGF-/Smads 信号通路改善大鼠冠状动脉左前降支结扎诱导的心肌梗死后缺血损伤及纤维化损伤，改善心肌组织病理状态，减少心肌细胞凋亡。本研究 通 过 采 用 叔 丁 基 过 氧 化 氢（tert-butyl hydroperoxide，TBHP）诱导大鼠心肌 H9c2 细胞损伤，探讨 VAP含药血清对心肌细胞的保护作用，阐明 VAP对 miR-133/TGF-/Smad轴的作用机制，为研究 VAP 对心肌细胞损伤的修复作用提供实验依据。1 材料与方法 1.1实验动物实验动物、细胞细胞、药物药物、主要试剂和仪器主要试剂和仪器SPF级 Wistar 雄性大鼠 21 只，体质量（18020）g，购自长春市亿斯实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK（吉）-2020-0002。VAP（长春中 医 药 大 学 药 学 院 制 备，每 1 g VAP 约 含 生 药28.9 g，批号：20201120）。大鼠 H9c2 细胞（中国科学院上海细胞库，批号：3111C0001CCC000219）。青 链 霉 素（北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司，货 号：P1400），胎牛血清（中国 CLARK Bioscience公司，货号：FB15015C），高糖 DMEM 培养基（货号：31053036）和胰蛋白酶-EDTA（0.25%）（批号：25200072）购自美国 Gibco 公司，TBHP 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，货号：458139，micrOFF gga-miR-133a-3p inhibitor（广州锐博生物技术有限公司），二甲基亚砜和 PBS 缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，批号：D8371、P1022），肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、心肌肌钙蛋白 T（cardiac troponin T，cTnT）和心肌肌钙蛋白 I（cardiac troponin I，cTnI）酶联免疫吸附 试 验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（江苏酶免生物科技有限公司，货号：MM-0625R1、MM-0795R1和MM-61550R1），371第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报（医学版）PrimeScript High Fidelity RT-PCR Kit 试剂盒（日本 TaKaRa 技术有限公司，货号：R023A50），RNAsimple Total RNA Kit总 RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司，货号：DP419），全蛋白提取试剂盒（货号：p0033）和 BCA 蛋白浓度测试试剂 盒（上 海 碧 云 天 生 物 技 术 有 限 公 司，货 号：p0012s），TGF-1 抗体、Smad4 抗体和 p-Smad2/3抗体（北京索莱宝科技有限公司，货号：21898-1-AP、10231-1-AP 和 K009346P）。多功能微孔板酶标仪（型 号：SUNERGY-HTX）和 二 氧 化 碳 培 养 箱（型号：311）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，电泳仪和电泳槽（型号：BE6085）购自美国伯 乐 Bio-Rad 公 司，多 道 生 理 记 录 仪（型 号：ML22）购自埃德仪器国际贸易有限公司，倒置荧光 显 微 镜（型 号：CKX4）购 自 日 本 奥 林 巴 斯公司。1.2VAP 含药血清制备含药血清制备健康 Wistar 大鼠 21 只，随机分为空白血清组、低剂量（100 mg kg1）VAP 组和 高剂量（400 mg kg1）VAP 组，均灌胃给药，每天 1次，连续 7。于第 7天灌胃 2 h后，腹主动脉 取 血，3 000 r min1离 心 15 min，分 离 血 清，0.22 m 微孔滤膜过滤除菌后分装，置于80 冰箱保存备用。1.3细胞培养与转染细胞培养与转染大鼠 H9c2 细胞生长于含10%胎牛血清的 DMEM 培养液中，置于 37、5%CO2饱和湿度的恒温密闭培养箱中进行常规培养并传代，0.25%胰蛋白酶消化，每 3 d 消化传代1 次。接种 2104个细胞至含有适量完全培养基的24 孔细胞培养板中。转染：用 30 L 1Buffer 稀释 1.25 L 20 mol L1 miRNA inhibitor，轻轻混匀；加入 3 L CP Reagent，轻轻吹打混匀，室温孵育 015 min。将混合液加入到无双抗完全培养基中，轻轻混匀；24 h后进行加药处理。1.4实验分组实验分组将 6 孔细胞培养板中培养 24 h 的H9c2 细胞更换新培养液，每 2 孔行不同的药物处理。H9C2 细胞 分 为 空 白 对 照 组、空 白 血 清 组、TBHP组、TBHP+低剂量 VAP组、TBHP+高剂量 VAP 组和 miR-133 inhibitor组；除空白对照组和TBHP 组外，其余各组细胞均给予 VAP 20%含药血 清，miR-133 inhibitor 组 细 胞 先 转 染 miR-133 inhibitor后再给予 VAP含药血清。1.5MTT 法检测各组细胞存活率法检测各组细胞存活率将 H9c2 细胞分为空白对照组（无任何处理）、正常对照组（加入 5%或 10%或 20%空白血清）、低剂量 VAP 组（加入 5%或 10%或 20%低剂量 VAP 含药血清）和高剂量 VAP 组（加入 5%或 10%或 20%高剂量VAP 含药血清）。药 物 干 预 24 h 后，每 孔 加 入15 L 四甲基偶氮唑蓝，孵育 4 h 后，弃去上清液。每孔加入 150 L 二甲基亚砜，避光处振摇 10 min，采用多功能微孔酶标仪测定 490 nm 处的 A 值。将H9c2 细胞分为 6 组：空白对照组（无任何处理）、正常对照组（20%空白血清）、TBHP 组（20%空白血清+200 mol L1 TBHP）、低剂量 VAP 含药血 清组（20%低剂量 VAP 含药血清+200 mol L1 TBHP）、高剂量 VAP 含药血清组（20%高剂量VAP 含药血清+200 mol L1 TBHP）、miR-133抑 制 剂 组（miR-133 inhibitor 24 h+400 mg kg1 VAP 24 h+200 mol L1 TBHP）。药物干预 24 和48 h后，按照上述实验方法操作。细胞存活率=实验孔平均 A值/对照孔平均 A值100%。1.6ELISA 法检测各组细胞培养上清液中法检测各组细胞培养上清液中 cTnT、cTnI和和 CK-MB水平水平将 H9c2细胞接种于 6孔细胞培养板（每孔 6104个细胞）中培养 24 h。收集细胞上清液，采用 ELISA 法检测各组细胞培养上清液中 cTnT、cTnI 和 CK-MB 水平，具体步骤参照试剂盒说明书进行。1.7 实 时 荧 光 定 量实 时 荧 光 定 量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法 检 测 各 组 细 胞 中法 检 测 各 组 细 胞 中miR-133表达水平表达水平将 H9c2细胞接种于 6孔细胞培养板（每孔 6104个细胞）中培养 24 h。实验分组同“1.4”，收集细胞，TRIzol 法提取细胞中的总RNA，实验步骤参照试剂盒说明书。应用紫外分光光度计检测 RNA 的浓度和纯度，反转录合成cDNA，步 骤 参 照 cDNA 合 成 试 剂 盒，根 据RT-qPCR 试剂盒检测 miR-133 表达水平，内参基因为 GAPDH。反应总体积为 20 L，反应程序：94、15 s（变性）；58、15 s（退火），72、15 s（延伸），30个循环。miR-133a正向引物：5-ACAC-TCCAGCTGGGCAAAGTTACAGTGC-3，反 向引 物：5-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3；GAPDH 正 向 引 物：5-GCTVATTTGCAGGGG-GGAG-3，反 向 引 物：5-GTTGGTGGTGCAG-GAGGCA-3。以GAPDH为内参对照，采用2Ct法计算各组细胞中 miR-133表达水平。1.8Western blotting法检测各组细胞中法检测各组细胞中 TGF-1、p-Smad2/3 和和 Smad4 蛋白表达水平蛋白表达水平将细胞接种372周高峰，等.鹿茸多肽预处理通过 miR133a调控 TGF/Smad信号通路对 TBHP诱导心肌 H9c2细胞于 6孔 细 胞 培 养 板（每 孔 6104个 细胞）中培养24 h。细胞分组和处理见“1.4”。收集各组细胞，按照总蛋白提取试剂盒说明书提取各组总蛋白，采用 BCA 定量，每孔上样 20 L 蛋白，进行凝胶电泳，90 min后转膜至 PVDF膜上，奶粉封闭液封闭1 h，加入兔抗 GAPDH、TGF-1、p-Smad2/3 和Smad4 一抗，4 孵育过夜，次日加入抗兔二抗，并在室温摇床孵育 2 h，按照高敏感度化学发光检测 试 剂 盒 说 明 书 滴 加 发 光 工 作 液 显 色 后，以GAPDH 为内参，采用 Imageproplus 6.0 软件进行灰度值分析。目的蛋白表达水平目的蛋白条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。1.9统计学分析统计学分析采用 SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析。各组 H9c2细胞存活率，各组 H9c2细胞培养上清中 cTnT、cTnI 和 CK-MB 水平，各组H9c2 细 胞 中 miR-133 表 达 水 平 及 TGF-1、p-Smad2/3和 Smad4蛋白表达水平均符合正态分布且方差齐，以 xs 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。以 P0.05)；与空白对照组比较，5%和 10%VAP 含药血清组细胞存活率明显降低（P0.05），故选取 20%含药血清浓度。TBHP 作用 H9c2 细胞 24 和 48 h 后，与空白对照 组 比 较，TBHP 组 细 胞 存 活 率 明 显 降 低(P0.05)；与 TBHP 组比较，低和高剂量 VAP 组的细胞存活率明显升高（P0.05)。见表 1。2.2 各 组 细 胞 培 养 上 清 液 中各 组 细 胞 培 养 上 清 液 中 cTnT、cTnI 和和CK-MB 水平水平与空白对照组比较，TBHP 组细胞培养上清液中 cTnT、cTnI 和 CK-MB 水平明显升高（P0.05）；与 TBHP组比较，TBHP+低剂量VAP 组和 TBHP+高剂量 VAP 组细胞培养上清液中 cTnT、cTnI 和 CK-MB 水 平 明 显 降 低（P0.05 或 P0.05）。见表2。2.3各组各组 H9c2细胞中细胞中 miR-133表达水平表达水平与空白对照组比较，TBHP 组细胞中 miR-133a 表达水平明显降低（P0.05）；与 TBHP组比较，TBHP+低剂量 VAP 组和 TBHP+高剂量 VAP 组细胞中miR-133a 表 达 水 平 明 显 升 高（P0.05 或 P0.01），miR-133 inhibitor 组细胞中 miR-133a 表达水平明显降低（P0.01）。见表 3。2.4各组细胞中各组细胞中 TGF-1、p-Smad2/3 和和 Smad4蛋白表达水平蛋白表达水平与空白对照组比较，TBHP组细胞中TGF-1、p-Smad2/3和 Smad4蛋白表达水平明显升高（P0.05）；与 TBHP 组比较，TBHP+低和高 剂 量 VAP 组 细 胞 中 TGF-1、p-Smad2/3 和Smad4 蛋 白 表 达 水 平 明 显 降 低（P0.05）。见表 4和图 1。3 讨 论 TBHP可以损伤心肌细胞，是诱导心肌细胞氧化应激和凋亡的体外造模方法。本研究采用 MTT法筛选出 TBHP 制备 H9c2 损伤模型的作用最佳时间（24 h）和浓度（200 mol L1）；当 TBHP 浓表表 1各组各组 H9c2细胞存活率细胞存活率TabTab.1 1Survival rates of H9c2 cells in various groups(n=6，xs，/%）GroupBlank controlBlank serumTBHPTBHP+low dose of VAPTBHP+high dose of VAPmiR-133 inhibitorSurvival rate5%serum containing drugs100.000.0095.036.9163.532.11*68.344.41*51.682.40*10%serum containing drugs100.000.0098.801.9675.202.73*75.283.18*55.423.75*20%serum containing drugs100.000.00104.503.1382.083.5186.894.4666.733.75*24 h after treated with TBHP100.000.00105.003.3461.553.64*83.082.7394.143.6863.863.7548 h after treated with TBHP100.000.0095.443.7445.903.09*64.352.4776.905.2249.692.99“”：No data.*P0.05 vs blank control group；P0.05 vs TBHP group.373第 49 卷 第 2 期 2023 年 3 月吉林大学学报（医学版）度为 200 mol L1时，cTnT、cTnI 和 CK-MB 大量释放至细胞中，TGF-1、p-Smad2/3 和 Smad4蛋白表达水平及 miR-133 表达水平发生明显变化，提示 TBHP 浓度在 200 mol L1时引起 H9c2 损伤明显；通过 VAP 含药血清干预后，能够达到改善H9c2造模后的损伤程度16。VAP 可明显降低阿霉素诱导心肌损伤模型大鼠心肌组织中 TGF-1蛋白表达水平，改善心肌损伤；可激活核因子 E2 相关因子 2/抗氧化反应元件（nuclear factor E2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE）信 号 通 路，促 进 下 游 人 血 红 素 加 氧 酶 1（heme oxygenases-1，HO-1）表达，防止心肌缺血再灌注损伤17-18。前期研究15证明：VAP 可以改善冠状动脉左前降支结扎诱导的大鼠心肌梗死后缺血损伤，降低血清中 cTnT、cTnI 和 CK-MB 水平，调控 TGF-/Samds 表 达 水 平，降 低 型 胶 原（collagen，Col）和型胶原（collagen，Col）蛋白表达，改善心肌组织病理状态，减少心肌细胞凋亡。本研究结果显示：与 TBHP 组比较，VAP 给药组细胞中 cTnT、cTnI 和 CK-MB 水平明显降低，miR-133a 表达水平升高，TGF-1、p-Smad2/3 和 Smad4 蛋白表达水平降低，miR-133 inhibitor可以逆转 VAP给药组相应的改变。本研究结果表明：VAP 对心肌细胞具有保护作用，可能是通过 miR-133a 调控 TGF-/Smads 信号通路发挥相应作用。TGF-/Smads 信号通路是典型的纤维化通路，心肌细胞发生损伤后，激活其通路并磷酸化下游的 Smad2 和 Smad3 蛋白，与 Smad4 蛋白结合后入细胞核发挥相应作用15。miR-133在正常心肌 细 胞 中 表 达 丰 富，有 研 究19-20表 明：过 表 达miR-133能改善心肌细胞纤维化损伤，而抑制 miR-133表达会使心肌纤维化损伤加重。本研究结果表表表 4各组各组 H9c2细胞中细胞中 TGF-1、p-Smad2/3和和 Smad4蛋白表达水平蛋白表达水平TabTab.4 4Expression levels of TGFExpression levels of TGF-1 1,p p-SmadSmad2 2/3 3,and Smadand Smad4 4 in in H9c2 cells in various groups(n=6，xs）GroupBlank controlBlank serumTBHPTBHP+low dose of VAPTBHP+high dose of VAPmiR-133 inhibitorp-Smad2/3 1.000.001.030.124.310.34*2.140.352.830.323.920.41TGF-1 1.000.001.110.122.920.36*1.860.151.960.222.510.31Smad4 1.000.000.960.112.810.24*1.320.351.470.322.630.41*P0.05 vs blank control group；P 0.05 vs TBHP group.表表 2各组各组 H9c2细胞中细胞中 cTnT、cTnI和和 CK-MB水平水平TabTab.2 2Levels of cTnT,cTnI,and CK-MB in H9c2 cells in various groups(n=6，xs）GroupBlank controlBlank serumTBHPTBHP+low dose of VAPTBHP+high dose of VAPmiR-133 inhibitorcTnTB/(pg L1)15.272.4616.561.9725.763.29*19.343.6917.663.2624.333.34cTnIB/(pg L1)53.724.9756.121.6684.166.55*64.446.9659.964.0475.668.20CK-MBB/(g L1)11.271.9811.331.3725.213.06*19.872.2515.451.3222.721.34*P0.05 vs blank control group；P 0.05，P0.01 vs TBHP group.表表 3各组各组 H9c2细胞中细胞中 miR-133表达水平表达水平TaTab b.3 3 Expression levels of miR-133 in H9c2 cells in various groups(n=6，xs）GroupBlank controlBlank serumTBHPTBHP+low dose of VAPTBHP+high dose of VAPmiR-133 inhibitorExpression leve of miR-133a 1.000.000.970.140.400.06*0.660.130.890.150.270.05*P0.05 vs blank control group；P0.05，P0.01 vs TBHP group.374周高峰，等.鹿茸多肽预处理通过 miR133a调控 TGF/Smad信号通路对 TBHP诱导心肌 H9c2细胞明：VAP 能通过增加 miR-133 表达水平改善心肌细胞损伤。研究21-23表明：miR-133被抑制并伴有心肌损伤时 TGF-水平升高导致上皮间质转化，相反，miR-133表达水平升高时会阻断 TGF-诱导的上皮间质转化。本研究结果表明：VAP 能通过提高 miR-133 的表达调控 TGF-/Smads 信号通路进而保护 TBHP诱导的 H9c2细胞损伤。综上所述，VAP 含