环境胁迫下沙门氏菌应激反应及抗性机制研究进展_郑凡.pdf

第 14 卷 第 11 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.11 2023 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun.,2023 基金项目:国家自然科学基金项目(42177406)Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China(42177406)*通信作者:杨新瑶,教授,主要研究方向为水土环境中纳米材料和微生物的行为效应。E-mail:*Corresponding author:YANG Xin-Yao,Professor,Key Laboratory of Ecological Remediation of Regional Polluted Environment,Ministry of Education,Shenyang University,No.21 Wang Hua South Street,North Court of Shenyang University,Shenyang 110044,China.E-mail: 环境胁迫下沙门氏菌应激反应及 抗性机制研究进展 郑 凡,杨 舒,陈芳敏,杨新瑶*(沈阳大学区域污染环境生态修复教育部重点实验室,沈阳 110044)摘摘 要要:细菌为了生存能够适应多种不利于生长的环境条件,因此许多食源性致病菌能够在某些食品加工处理中存活下来。沙门氏菌(Salmonella)是常见的食源性致病细菌,在食品加工中可承受极端 pH、温度、渗透压、贫营养和高压等胁迫。沙门氏菌应对不同环境胁迫,可产生应激蛋白、进行系统自我调节和表达相关基因等,进而影响其致病能力,产生交叉抗性从而更好的生存和繁殖。因此,沙门氏菌能在遗传和表型水平上适应不同的极端环境。本文综述了沙门氏菌耐受环境胁迫,暴露于这些环境胁迫时发生的适应性变化,对细菌致病性的影响,以及产生的交叉保护机制。对这些方面的研究将有助于了解沙门氏菌的发病机制,对于制定抗击沙门氏菌感染的新策略,保障食品安全具有重要意义。关键词关键词:沙门氏菌;致病性;适应性;应激反应;基因 Progress in the study of stress response and resistance mechanism of Salmonella under environmental stress ZHENG Fan,YANG Shu,CHEN Fang-Min,YANG Xin-Yao*(Key Laboratory of Ecological Remediation of Regional Polluted Environment,Ministry of Education,Shenyang University,Shenyang 110044,China)ABSTRACT:Bacteria are able to adapt to a wide range of adverse environmental conditions in order to survive,and many foodborne pathogenic bacteria are able to survive certain food preservation treatments.Salmonella,a common foodborne pathogenic bacterium worldwide,can withstand stresses such as extreme pH,temperature,osmotic pressure,oligotrophy,and high pressure in food preservation.Salmonella responds to different environmental stresses by producing stress proteins,systemic self-regulation and expression of related genes,which in turn affects its pathogenicity and generates cross-resistance for better survival and reproduction.Therefore,Salmonella can adapt to different extreme environments at both genetic and phenotypic levels.This paper reviewed the environmental stresses to which Salmonella is tolerant,the adaptive changes that occur upon exposure to these environmental stresses,the impact on bacterial pathogenicity,and the cross-protection mechanisms that arise.These aspects will contribute to the understanding of the pathogenesis of Salmonella and are important for the development of new strategies to combat Salmonella infections and ensure food safety.DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2023.11.011第 11 期 郑 凡,等:环境胁迫下沙门氏菌应激反应及抗性机制研究进展 131 KEY WORDS:Salmonella;pathogencity;adaptability;stress response;genes 0 引 言 沙门氏菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性的细胞内致病菌,其主要易感对象包括幼儿、孕妇、免疫低下者和老年人。沙门氏菌通过受污染的食物和水传播,进入人体后通过血液从肠道传播到肠道淋巴结、肝脏和脾脏,并进行繁殖1。据报道,全世界每年约有9830万人患沙门氏菌感染引起的肠胃炎,其中约 15.5 万例死亡2。大多数沙门氏菌病例与受污染的食品有关,如鸡蛋、黄瓜、鸡肉、水果和蔬菜等食物3。在食品加工中众多致病性和非致病性细菌面临不同环境胁迫,如贫营养、渗透压、酸、高温消杀等环境,它们会快速感知并通过各种调节方式提高生存能力,同时其致病能力也会发生变化46。食源性沙门氏菌对外界环境有很强的抵抗能力,在应对不利于生存的压力胁迫时,沙门氏菌会通过不同的策略应对环境压力从而产生抗性,使其在不利环境中生长和存活,而且还会调节其毒力和耐药性。随着相关研究的开展,人们对沙门氏菌发病机制的了解大大增加。其中主要包括细菌 III 型蛋白分泌系统,以及沙门氏菌的毒力基因编码 5 种不同的毒力岛(Salmonella pathogenicity islands,SPIs),能够诱导巨噬细胞凋亡。除了毒力岛,沙门氏菌的毒性也由感应激酶和转录调节子组成的双组分系统(two-component system,TCS)调控。沙门氏菌有超过 20 个 TCS,形成一个复杂的网络,调节 SPI-2 和其他毒力基因7。沙门氏菌作为细胞内的病原体通过这些TCS 对细胞外信号作出反应调节基因表达8,例如PhoP-PhoQ TCS、PmrA-PmrB TCS、SsrA-SsrB TCS、OmpR-EnvZ TCS 和 BarA-SirA TCS 等。本文讨论了沙门氏菌在食品加工过程中面临不同环境中遇到的压力胁迫后产生的相关反应。在这些环境压力下,阐述了沙门氏菌发生了哪些适应变化,这些适应给细菌带来哪些优势。到目前为止,与沙门氏菌食品环境适应相关的报道大多只关于细菌存活方面,对于压力环境下沙门氏菌表型的变化与发病机制平衡的研究还不够全面,本文主要对沙门氏菌适应与致病有关的方面进行详细阐述。这不仅可以了解沙门氏菌的生理特征,而且有助于在食物加工过程中设计更有效的灭活方法,以防止沙门氏菌造成的健康风险,有助于提高定量微生物风险评估的准确性。1 沙门氏菌致病机制 沙门氏菌物种是全球食源性疾病的主要致病因子之一,其毒力基因决定了这种微生物的主要致病机制。在与宿主互动过程中,沙门氏菌能够入侵并感染小肠上皮细胞,这一过程会引起人体肠胃的疾病。进入宿主体内后,沙门氏菌会遇到一些屏障,如胃酸低 pH、肠黏膜和肠上皮细胞屏障,沙门氏菌可以通过这些屏障并引起感染8。如图 1沙门氏菌主要有 2 种途径侵染细胞,一是通过跨膜细胞作用穿过褶皱细胞(microfold cells,M cells),另一种是通过SPI-1 分泌的型分泌系统(type secretion system,T3SS)效应蛋白引起膜褶皱。随后由中性粒细胞、胸腺依赖性淋巴细胞(thymusdependentlymphocyte,T cells)、囊依赖淋巴细胞(bursa dependent lymphocyte,B cells)、巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞的浸润而引起炎症。这些细胞通过血液和淋巴系统将细菌运送到脾脏和肝脏810。细菌可以在这些组织中存活数年,从而发生感染。沙门氏菌的致病性是大量毒力相关因子相互作用的结果,主要有毒力岛毒力因子、质粒毒力因子、结构性毒力因子(包括菌毛、鞭毛和脂多糖)、肠毒素毒力因子等11。SPI 是携带毒力基因的染色体区域,在特定感染时刻作为一个紧密而独特的遗传单位发挥作用。相关研究已经描述了多种 SPI11,这些 SPIs 在细菌进化过程中有助于病原体的存活、毒力和传播,如沙门氏菌侵染是由 SPI-4 编码的 1型分泌系统和 SPI-1 编码的 T3SS-1 的协同作用介导的12,SPI-6 编码蛋白在沙门氏菌致病中起关键作用13。目前关于沙门氏菌 5 个毒力岛(SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5)的研究报道相对较多。其中 SPI-1 和 SPI-2 是沙门氏菌最重要的毒力决定因素。这两个毒力岛上编码的基因主要包括两部分:一部分基因编码的是结构蛋白,然后以一定的组装方式形成 T3SS;还有一部分基因则编码功能蛋白,它们被分泌到细菌体外发挥作用1415。肠炎沙门氏菌分别在SPI-1 和 SPI-2 上编码 2 个 T3SS 基因簇 T3SS-1 和 T3SS-2。T3SS-1簇负责肠腔内肠上皮细胞和M细胞的早期侵袭,以及促炎反应的激活。T3SS-2 与感染的后期有关,包括细胞内的生存和宿主吞噬细胞内的复制15。GARMENDIA等16发现 SPI-2 T3SS 分泌装置的表达通过 SsrA-SsrB TCS 调控系统调节,随后由 OmpR-EnvZ TCS 调控。多种环境条件会影响 OmpR-EnvZ 调节系统诱导 SPI-2 T3SS 基因的表达17。除毒力岛外,沙门氏菌的毒性也由双组分系统调控。因此,沙门氏菌的这些调控系统在沙门氏菌的发病机制及其调控中起着重要作用。2 沙门氏菌在不同环境下的应激反应 沙门氏菌在食品加工过程和宿主环境中,面对着温度、pH、贫营养、渗透压等多种环境压力(图 2),这些压力可抑制它们生长甚至致死并诱导产生交叉保护。作为一个群体,沙门氏菌善于适应、生长并在各种压力环境中生存。因此,下文内容主要介绍沙门氏菌在不同环境压力下做出的适应性改变(图 3)。132 食品安全质量检测学报 第 14 卷 图 1 沙门氏菌致病流程图9 Fig.1 Salmonella pathogenic process9 图 2 沙门氏菌在环境中面临的压力18 Fig.2 Pressure on Salmonella in the environment18 2.1 物理环境 2.1.1 贫营养环境 细菌经常遇到缺少基本营养物质(如碳、氮、磷等)的生长环境,在营养匮乏的环境中,沙门氏菌生存的同时依然保持其致病能力,并进化出了包括细胞代谢、基因表达模式等统称为饥饿应激反应(starvation stress response,SSR)19的调节机制。已有研究发现沙门氏菌的 4 个饥饿诱导位点(STIA、STIB、STIC 和 STIE),它们在长时间的磷(P)、碳(C)和氮(N)贫营养中被诱导,在诱导动力学、调控特性及其对贫营养环境存活中发挥作用。4 个 STI 位点均直接或间接受到 CRP基因产物(cAMP 受体蛋白,CRP)的负调控2021。此外,在 缺少 C 或 N 的贫营养过程中,这 4 个位点都受到 RELA 基因产物(即 ppGpp)的正调控。例如 STIA,一种 N、P 贫营养诱导的依赖 S的 SSR 基因,被(p)ppGpp 正向调节,被cAMP 受体蛋白复合物和 OxyR 调节蛋白负向调节。在 SSR早期,细胞内 cAMP 和 ppGpp 水平均升高。随着细胞外葡萄糖水平的下降,通过激活或上调 cyaA 基因和 CRP 基因的表达来增加 cAMP 水平21(图 4)。此外,ppGpp 合成酶可以调节毒力因子的代谢和表达,是抵抗应激条件、内化到宿主细胞和致病所必需的。WANG 等22通过 RNA 测序发现(p)ppGpp 合成酶不仅抑制 DNA 复制和蛋白质合成,而且还控制许多毒力因子的表达,特别是沙门氏菌 SPI-1 和SPI-2 T3SS,以及黏附因子。第 11 期 郑 凡,等:环境胁迫下沙门氏菌应激反应及抗性机制研究进展 133 图 3 沙门氏菌的适应机制 Fig.3 Adaptation mechanisms of Salmonella 图 4 贫营养环境下沙门氏菌中各因子对 rpoS(S)转录的调控 Fig.4 Regulation of rpoS(S)transcription by various factors in Salmonella underpoor nutrition environment 2.1.2 高温环境 温 和 的 热 处理 通 过 启 动热 休 克 反 应(heat shock reaction,HSR)来增强微生物承受后续热处理和其他环境压力的能力。有几种因素可以让沙门氏菌菌株在食品加工环境中生存下来并克服热处理。例如,在热处理前暴露于略高于微生物最佳生长温度的温度,能够导致沙门氏菌的热抗性明显增强。KIM 等23研究发现沙门氏菌暴露在 50下 120 min,对 60的后续热处理抵抗力更强。此外,环境胁迫还诱导了细菌对多种应激的交叉抗性。例如,经过干燥处理的细胞显示出更强的耐热性,GRUZDEV 等24发现干燥的鼠伤寒沙门氏菌比未干燥的细胞在 100条件下存活率更高。SPECTOR 等25发现高温会对包括沙门氏菌在内的革兰氏阴性细菌的细胞质和细胞膜有不同程度的影响。沙门氏菌遭遇高温胁迫后的抵抗机制主要包括:合成热休克蛋白,Sigma 因子 H控制的细胞质内热休克反应和Sigma 因子 E调控的胞外反应。(1)形成热休克蛋白 大量的蛋白质形成热休克蛋白(heat shock protein,S-HSP)家族,S-HSPs 主要在应激过程中发挥作用,在不同的细胞活动(新陈代谢、翻译、转录等)下稳定细胞蛋白质,结合未折叠的蛋白质并形成复合物,阻断非特异性不可逆聚集。S-HSPs 由多达 50 个氨基酸组成,普遍存在于各种不同类群的微生物中,这些蛋白质通常维持蛋白质的动态平衡26。当温度升高时,细菌产生热休克蛋白,以提供其他细胞内蛋白的稳定性,并防止蛋白变性。SIRSAT等27发现沙门氏菌暴露于热应激导致编码热休克蛋白和耐应激蛋白的基因表达,如 ibpA、uspA、uspB、htpG、dnaK和 htrA,以修复受损和错误折叠的蛋白。参与 DNA 代谢的各种基因,如 dnaG、stpA、holC 和 uvrA,都受到热应激的差异调控。作为一种保护性反应,在温度高于最适温度时,细胞质膜和外膜中存在的大量错误折叠和未折叠的蛋白质,反过来通过调节热休克因子 H来启动 HSPs 的表达。随着热应激的处理,Sigma 因子启动了基因的适应性调节。通常表达两个 Sigma 因子:由热休克 Sigma 因子 H或 32调节的细胞质内热应激反应和由胞外功能 Sigma 因子 E或 24调节的胞外热应激反应2829。SIRSAT 等27还检测到在热应激处理后 144 个基因上调和 167 个基因下调。这些基因属于不同的功能类别,但主要属于一般应激反应 Sigma 因子 32/H和 24/E(rpoH 和 rpoE),且已被证明在134 食品安全质量检测学报 第 14 卷 许多病原体的毒力中起关键作用。因此,Sigma 因子和热休克蛋白可能通过克服各种应激源,增加致病和定植潜能,从而增加致病能力。(2)32/H调节的热应激反应 一些 Sigma 因子,如 S(由 rpoS 基因编码)和 H(由rpoH基因编码),参与了压力相关基因的表达30。编码32/H的 rpoH 基因的转录在翻译过程中受到自身的调节,且细胞内的 32/H浓度是在翻译水平上进行调节的。面临较低的温度,分子内氢键阻止 rpoH mRNA 的翻译,而在较高的温度,rpoH mRNA 的二级结构打开,促进了核糖体的结合,提高了翻译效率31。与热应激反应相关的 Sigma 因子已被证明调控超过 100 个基因。作为核糖核酸聚合酶全酶复合体的一部分,32/H调控 30 多种 HSP 的转录,其中大部分是蛋白水解酶32。由 Sigma 因子 32/H表达的蛋白水解酶可以降低细胞膜 HSPs 的表达,使其达到细胞承受环境压力所需的水平。例如,依赖于与膜结合的 ATP 蛋白酶 FtsH31。这种负反馈环有助于控制 HSPs 的过度表达。因此,32/H受细胞质中存在的热休克蛋白以及温度对 rpoH 翻译和蛋白质的直接影响。(3)24/E调节的热应激反应 虽然 32/H和 24/E是可供选择的 Sigma 因子,但 32/H调节细胞质内的热休克蛋白,主要处理细胞质中错误折叠的蛋白质的积累,24/E调节细胞膜蛋白对高温和其他包膜胁迫因子的响应33。但控制 rpoH 基因表达的启动子之一受到 24/E的调节,以协调细胞质和胞外成分的热反应。在较低的温度下,24/E被反 Sigma 因子 rseA 隔离。在45以上的温度,错误折叠的蛋白质流向外膜和周质并聚集在周质中,触发内膜蛋白酶对蛋白水解性切割。这种受调控的膜内蛋白分解导致 E-rseA 抑制复合体释放到细胞质中,与 sspB 相互作用将该复合物引向 ClpXP 蛋白酶体;导致 rseA 片段降解并将 E释放到细胞质中。一旦释放,E与 RNA 聚合酶(RNAPE)形成复合物,并指导特定基因组的转录,其蛋白产物在对抗细胞质外胁迫中发挥作用3435。由于 rseA 基因是 rpoE 操纵子(rpoErseABC)的一部分,而rpoE 操纵子本身是受调控的,所以胞外对热应激反应是反馈控制的。随着细胞内 E水平因胞外应激而升高,内膜中的反 Sigma 因子 rseA 的浓度也随之增加36。2.1.3 渗透环境 细菌面对渗透应激会导致水流出细胞或流入细胞,从而导致细胞结构、功能和活性的改变。无论是对导致高渗环境的渗透升高作出反应,还是对低渗环境的渗透降低作出反应,细菌细胞都试图通过相应增加或减少胞质或周质中溶质的浓度来维持适当的膨压3738。(1)低渗透压胁迫 渗透压降低会导致水净流入细胞,并增加膨压,细菌为了防止破裂,需要释放渗透压。革兰氏阴性菌内壁中有许多敏感通道,如大电导机械敏感性离子通道(mechanosensitive channel of large conductance,MscL)和小电导机械敏感性离子通道(mechanosensitive channel of small conductance,MscS)已经确定了它们在应对低渗性休克建立时会起到释放作用3940。沙门氏菌对抗低渗透应激的另一种策略是调节周质葡聚糖(osmoregulated periplasmic glucan,OPG)的积累。此外,OPG 合成受制于渗透调节和反馈控制。沙门氏菌 opgGH 突变体(缺乏 OPG 生产)在低渗透压条件下表现出对生长、运动和生物膜形成障碍,并降低了在小鼠器官的定植能力和小鼠毒力41。(2)高渗透压胁迫 由于短时间内,在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中编码高亲和 K+转运系统的 kdpABC 操纵子的转录被诱导,这导致细胞内 K+的快速积累42。但细胞内 K+的增加只是一种暂时的解决方案,很快就会被相容溶质的有机化合物的积累所取代。在沙门氏菌中,prou 和 prop 分别编码 ABC转运蛋白复合体和 H+转运蛋白,这 2 个基因位点都在高渗胁迫下上调43。prop 和 prou 膜转运系统能够将许多不同的相容溶质输送到细胞内,如甘氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱和脯氨酸。otsBA 操纵子一般受应激反应 Sigma 因子 S控制,该因子也调节与渗透耐受有关的其他基因44。在启动了所描述的渗透保护剂吸收或合成机制后,置于高渗透环境中细胞的渗透保护剂开始被动扩散43。在持续的高渗胁迫下,otsBA 操纵子的产物会诱导海藻糖的合成,K+谷氨酸的水平开始下降。沙门氏菌有两种主要的孔蛋白,它们作为促进亲水小分子扩散的通道:OmpF 和 OmpC。外膜蛋白OmpC 通过 EnvZ-OmpR TCS 在高渗条件下上调。OmpR-EnvZ 是许多病原菌中最常见的双组分系统之一。当细菌受到外部刺激时,EnvZ 被激活并自我磷酸化,然后一个磷基团被转移到 OmpR 的 N 末端结构域中。磷酸化的 OmpR通过其 C 末端结构域与靶基因的启动子区域结合,从而进行调节。OmpR-EnvZ TCS 调节外膜孔蛋白 OmpF 和 OmpC的表达以响应渗透胁迫45。例如,FENG 等46发现高渗透压会导致 OmpF 下降和 OmpC 水平增加,可能为某些相容的溶质(如甘氨酸甜菜碱)进入周质提供了通道。孔蛋白相关基因(OmpF,OmpC)以及应激诱导的 Sigma 因子(Rpos)的相对表达在抗生素耐药性和应激暴露方面存在差异47,这些基因调节细胞膜的通透性,影响孔蛋白的合成。它们的表达变化可能导致细菌膜通透性的增加和孔蛋白的减少,从而导致耐药性的变化并形成多重耐药,从而产生交叉抗性。2.2 化学环境 2.2.1 乙醇环境 长期以来,乙醇一直被用于食品消毒、加工和物质提取等。在食品加工环节,乙醇可用于食品加工工具、传送带和食品接触面的消毒。适应亚致死水平乙醇的细菌对致第 11 期 郑 凡,等:环境胁迫下沙门氏菌应激反应及抗性机制研究进展 135 死性乙醇的耐受性增强,这被称为乙醇耐受性反应(ethanol tolerance response,ETR)48。HE 等48通过转录组测序确定了肠炎沙门氏菌的 ETR 的适应涉及多个基因表达。沙门氏菌经亚致死乙醇处理后的大量差异基因与代谢过程和生物调节有关。同时一些双组分系统也发生了变化,其中大多数基因在乙醇胁迫后表达上调。几个组氨酸激酶基因(例如 phoR、ssrA、baeS、glnL、ttrS)和响应调节基因(例如 phoB、ssrB)的表达被亚致死乙醇处理后增强,同时这些基因是细菌在恶劣条件下生存所使用的重要的传感和信号元件。TCS 基因及其调节子对其作用方式有影响,因为 共 转 录 可 能 与 编 码 的 蛋 白 质 相 互 作 用 相 关49。OmpR-EnvZ TCS 在乙醇耐受中起着关键作用。乙醇是由组氨酸激酶 EnvZ 感知的,组氨酸激酶 EnvZ 反过来自动磷酸化并将磷酸化基团转移到反应调节因子 OmpR50。此外,ABC 转运蛋白(ATP binding cassette transporters)也在沙门氏菌 ETR 中起到作用,ABC 转运蛋白系统、磷酸转移酶系统、细菌分泌系统的基因表达都有差异51。2.2.2 酸环境 沙门氏菌在肠道或其他环境中会遭遇酸胁迫,因此沙门氏菌会自身突变以适应环境。耐酸性反应(acid stress response,ATR)被定义为低 pH 条件下生长或短期暴露于弱酸性条件下对正常致死低 pH 的诱导抗性。然而,低 pH 对细菌来说也是一个重要的信号,表明它已经进入了潜在的宿主环境,触发了许多毒力基因的诱导52。沙门氏菌 ATR的分子机制已经被证实,包括调节 pH 动态平衡系统、产生酸休克蛋白和改变细胞膜流动性53(图 554)。(1)动态平衡系统 革兰氏阴性菌在生长过程中即使外部环境 pH 发生变化,细胞内部 pH 仍旧稳定在 7.67.8 之间,ATR 系统产生可诱导的 pH 动态平衡功能。pH 动态平衡机制似乎涉及膜结合的质子泵55,这些泵协同工作,为细菌提供中等水平的耐酸能力。AUDIA 等56研究发现在鼠伤寒沙门氏菌中,诱导型赖氨酸脱羧酶和精氨酸脱羧酶系统在维持细胞内pH方面起着重要作用。此外,赖氨酸在鼠伤寒沙门氏菌pH动态平衡中也起到作用。赖氨酸脱羧酶系统由钙调节蛋白操纵子(a transcriptional regulator of the cadBA operon,CadC)、赖氨酸脱羧酶(a lysine decarboxylase enzyme,CadA)和赖氨酸-身体逆向转运蛋白(a lysine-cadaverine antiporter,CadB)组成。LEE 等57描述了 CadC 作为与 OmpR-EnvZ TCS 相连的调节系统在沙门氏菌暴露期间控制超过 36 个蛋白表达,这表明赖氨酸脱羧酶系统对于细菌在正常致命的酸胁迫条件下的生存至关重要。(2)酸休克蛋白 在过去的几十年里,人们已经做了大量的研究来鉴定沙门氏菌中的这些应激蛋白,已经描述了几个控制酸休克蛋白(acid shock protein,ASP)不同亚群表达的调控基因,包括替代 Sigma因子 rpoS,铁调节因子 Fur,双组分信号转导系统 Phop-PhoQ 和 OmpR 反应调节因子5859。对数期和 图 5 酸适应下各因子对沙门氏菌的调节作用54 Fig.5 Modulation of Salmonella by factors under acid adaptation54 136 食品安全质量检测学报 第 14 卷 静止期沙门氏菌的ATR有一定差异,如对数期细胞的ATR诱导了 51 个酸性休克蛋白,稳定期细胞诱导了 15 个,只有 5 个酸性休克蛋白同时被两个系统诱导60。沙门氏菌的LP ATR(对数期耐酸反应)受几种调节蛋白的调节,包括:S、Fur、PhoP 和 OmpR。还有研究证明 rpoS 参与了沙门氏菌的酸诱导对数期 ATR,控制着至少 10 个 ASP 的表达,这些 ASP 保护细胞免受酸胁迫和其他胁迫条件的影响61。BEARSON 等62发现适中的酸性 pH 促进了参与沙门氏菌对数期 ATR 的几个 Phop 调节基因的转录,主要是对无机酸胁迫的保护。在 LP ATR 过程中诱导的 50 个 ASP 中,至少有 10 个是依赖 S的,包括 OsmY 和 SodC 63。酸性 pH诱导的 SP ATR(固定相耐酸反应)不同于 LP ATR,它是不依赖 S、Fur 和 PhoP 的64。但 OmpR 也是 SP ATR 的关键调节因子。沙门氏菌对酸胁迫存在复杂的细菌反应,涉及大量具有不同细胞功能的 ASP,从调节细胞代谢到修复大分子损伤,并受各种调控基因的控制。(3)细胞膜流动性 较高的温度(2542)和较高的 pH(7.08.0)以及较低的温度(410)和较低的 pH(4.06.0)更有利于生物膜的形成65。生物膜的形成还可以增强包括致病沙门氏菌在内的病原体在环境中生存和持续生存的能力66。膜结构和动力学特性通过酶的脂质环境的改变来影响膜蛋白的功能,并且可能参与细胞应激的反应。膜脂肪酸(membrane fatty acid,FA)的组成负责维持膜流动性,研究表明,沙门氏菌的膜流动性与抗逆性之间存在一定关系67。KIM 等23提出,细胞膜中环丙烷脂肪酸(cyclopropane fatty acid,CFA)的形成是保护鼠伤寒沙门氏菌免受致命酸暴露的主要因素,并且已有研究证明 CFA通过减少细胞氧化损伤来发挥其对致命酸暴露的保护作用68。暴露在酸性 pH中的沙门氏菌细胞经历了一种膜适应,如不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率降低,十八碳烯酸的相对浓度降低,环状脂肪酸的含量随之增加,亚甲基十八烯酸相对浓度的上升69。细胞膜 FA 的组成变化可能导致细胞膜流动性降低,对致死酸和热处理表现出更强的生存能力。2.3 交叉保护 面对不同的胁迫条件,沙门氏菌应对环境产生的适应性反应还以诱导产生交叉保护,从而增强病原体对不同胁迫的抗性。德尔卑沙门氏菌经过质量分数 4%NaCl 驯化会诱导产生高渗适应性,还会协同提高对低温和过氧化氢等胁迫环境的交叉抗性70。食源性细菌能够通过阻隔蛋白质的表达和诱导必需的蛋白质的合成去应对压力环境,有研究表明这些蛋白质在交叉保护中发挥重要的作用48。酸胁迫下会抑制沙门氏菌其在土壤中的迁移,从而降低酸性环境中沙门氏菌的传播风险71。乙醇胁迫后的沙门氏菌对冷冻和过氧化氢产生了交叉抗性,其对冷冻交叉抗性的形成是基础代谢、ABC 转运子、铁载体吸收、调控子、蛋白质合成和毒力岛多个网络调控的结果72。此外,包括抗生素、贫营养、酸、热和渗透压产生的应激反应也会调节伴侣蛋白和蛋白酶的表达,从而产生交叉保护。交叉保护的产生可能是因为一些应激反应基因产生重叠作用。已有研究证明在酸适应后沙门氏菌的耐热性提高以及对耐药性有不同程度的影响73。耐酸(SEN1564A、cfa)、耐热(rpoH、uspB、htrA)、盐(proP、proV、osmW)和冷(cspA、cspC、cdsA)胁迫相关基因在酸适应后普遍上调74。其中 uspB 和 htrA 在热应激的调控下修复受损和错误折叠的蛋白。uspB 基因还通过改变细胞膜组成使细菌在热应激下存活75。Sigma 因子 32/H受到 rpoH 的翻译以及蛋白质错误折叠的影响的同时,又通过调节热休克蛋白的转录来提供对细胞质热胁迫的保护。转运蛋白基因位点 prop 与proV 属于 prop-prou 膜转运系统,此系统能够将许多不同的相容溶质输送到细胞内使细胞在渗透胁迫下生存76。cspA 和 cspC 是冷应激的主要表达基因之一77,它们可以调节许多生物膜发生和转录基因的表达。rpoS 是调控沙门氏菌体内稳定压力的因子,在酸胁迫时 rpoS 表达,对高渗透压、热胁迫的交叉保护反应也有调节作用。同时,rpoE基因在应对贫营养应激、氧化应激、抗菌肽应激、渗透应激和冷应激中也是必不可少的。由于存在共同的调节机制,可以诱导沙门氏菌对其他胁迫产生交叉保护,这些可能部分解释了沙门氏菌环境适应后对其他胁迫的交叉保护。3 结束语 当沙门氏菌暴露在更高的潜在致命水平胁迫时,相关反应会增加沙门氏菌的存活率。沙门氏菌的应激反应不是单个基因、蛋白质或代谢通路单独作用的结果,而是多个基因、多个蛋白质和多个代谢物协调作用的综合表现,涉及多个网络系统的调控。沙门氏菌的应激反应受多种调节因子的控制,这些重叠的网络系统同时也受一系列的蛋白和系统的调控,如各种休克蛋白中,酸休克蛋白质、热休克蛋白质和冷休克蛋白质分别可以促进沙门氏菌在酸性环境、高温条件和低温胁迫下的存活能力;Sigma 因子中选择性 因子 rpoS、rpoH 和 rpoE 分别调控酸休克蛋白和热休克蛋白质的合成;双组分系统中 OmpR-EnvZ 双组分系统在酸、乙醇、渗透胁迫下起到关键调节作用;PhoP-PhoQ双组分系统在贫营养和酸胁迫时被激活从而产生调节作用。这些双组分系统又是沙门氏菌毒力所需的,它们通过调节毒力岛 SPI-1、SPI-2 及其 T3SS 从而增加致病潜能,使它在面对不同环境时快速感知并生存。由于沙门氏菌在不同胁迫下存在共同的调节机制,因此可以诱导沙门氏菌对其他胁迫产生交叉保护从而增加自身的生存能力。总体而言,沙门氏菌产生不同策略以应对环境胁迫,这些策略对沙门氏菌毒力有不同影响,这可能会增加沙门氏菌的致病能力。因此,了解沙门氏菌在环境中的适应性及其致病机第 11 期 郑 凡,等:环境胁迫下沙门氏菌应激反应及抗性机制研究进展 137 制,有助于开发针对该细菌的治疗方法,有助于在食品加工过程中对沙门氏菌污染进行有效防治。参考文献 1 SPLICHALOVA A,DONOVAN SM,TLASKALOVA-HOGENOVA H,et al.Monoassociation of preterm germ-free piglets with Bifidobacterium animalis Subsp.lactis 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