干细胞特性以及培养关键技术交流.doc

干细胞1. 干细胞(stem cell)：干细胞是一类具备自我更新和分化潜能细胞。 2.干细胞分类(1)胚胎干细胞：指胚胎初期干细胞。此类干细胞分化潜能宽，具备分化为机体任何组织细胞能力。如囊胚期内细胞团细胞。(2)成体干细胞：指成体各组织器官中干细胞，成体干细胞具备自我更新能力，但分化潜能窄，只能分化为相应(或相邻)组织器官构成细胞。如神经干细胞，表皮干细胞。第一节 干细胞生物学 1. 组织自体稳定性：特定组织通过使自身细胞死亡和增生方式保持组织细胞数量动态平衡特性称组织自稳定性。2. 干细胞是个体发育和组织再生基本。 一、干细胞形态和生化特性 1干细胞形态特性干细胞形态共性：细胞呈圆形或卵圆形，体积小，核质比大，增殖力强。干细胞固定组织位置：有干细胞有固定存在部位与方式。如表皮干细胞与其周边子细胞形成增殖构造单元。但许多组织干细胞没有这种分布特点。2干细胞生化特性端粒酶活性高：如造血干细胞具癌细胞端粒酶活性，增殖能力强。随着增殖与分化，端粒酶活性下降。蛋白标志分子：不同干细胞有各异蛋白质标志分子，可作为拟定干细胞位置、分离提纯干细胞标志。如：巢素蛋白神经干细胞；角蛋白15表皮干细胞。 二、干细胞增殖特性（一）增殖缓慢性1干细胞增殖速度慢：细胞动力学研究表白，干细胞增殖速度较慢，组织中迅速分裂细胞是过渡放大细胞。如小肠干细胞分裂速度(Tc=11小时)比过渡放大细胞(Tc24小时)慢一倍。2过渡放大细胞：过渡放大细胞是介于干细胞和分化细胞之间过渡细胞，过渡放大细胞经若干次分裂产生分化细胞。通过这种方式，机体可用较少干细胞获得较多分化细胞。3干细胞增殖缓慢意义：(1)利于干细胞对外界信号作出反映，以决定细胞发展方向增殖或分化。(2)减少基因突变危险。增殖缓慢使干细胞有时间发现并纠正处在增殖周期过程中错误。（二）干细胞自稳定性1自稳定性：自稳定性是干细胞基本特性之一。指干细胞可在个体生命过程中自我更新并维持其自身数目恒定。干细胞自稳定性是区别肿瘤细胞本质特性。干细胞通过其特有分裂方式维持自稳定性。2干细胞分裂方式干细胞有对称与不对称两种分裂方式。不对称分裂成果使两个子细胞一种成为功能专一分化细胞；另一种保持干细胞特性。3. 不对称分裂发生因素：系列基因调控。细胞质物质不均等分派。4无脊椎动物通过不对称分裂维持自稳定性。如：果蝇Insc基因是感官前体细胞不对称分裂调控基因之一，通过三个途径进行调控：不对称分派质膜上细胞定向决定因子。不对称分派细胞内mRNA。决定细胞分裂时纺锤体取向。5哺乳动物种群不对称分裂。(1)种群不对称分裂：哺乳动物有几种不同干细胞群，分裂后产生不同细胞。(2)哺乳动物种群不对称分裂意义：使机体对干细胞调控更灵活，以适应机体生理变化。规定机体对干细胞分裂调控更精准，以保持干细胞数目恒定。如：正常肠腺有250个细胞构成，如果额外多一种干细胞，则也许多产生64128个子代细胞。 (3)哺乳动物种群不对称分裂调控。哺乳动物通过多层次多角度调控，保持自稳定性。正调控：增进与细胞增殖、生存关于基因表达。负调控：增进与细胞凋亡关于基因表达。如转基因小鼠长期造血干细胞高表达Bcl-2后，使长期造血干细胞数目明显增长。阐明细胞凋亡也是干细胞调控方式。 三、干细胞分化特性 （一）干细胞分化潜能 依照其分化潜能大小，干细胞可分为三类。1全能性干细胞(胚胎干细胞)：具备形成完整个体分化潜能。如胚胎干细胞(ES)具备很强分化能力，可无限增殖并分化为全身200各种细胞类型，及机体各种组织、器官。 (图 全能干细胞)2多能性干细胞：多能干细胞具备分化出各种细胞组织潜能，但失去了发育成完整个体能力。如骨髓多能造血干细胞，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外其他细胞。 (图 多能干细胞)3专能性干细胞(成体干细胞)：专能干细胞(也称单能、偏能干细胞)，此类干细胞只能向一种类型或密切有关两种类型细胞分化。如上皮组织基底层干细胞、肌肉中成肌细胞(卫星细胞)。(图，表皮干细胞)(二)干细胞转分化和去分化 1干细胞转分化：一种组织类型干细胞在恰当条件下分化为另一种组织类型细胞过程称干细胞转分化。实验：C57BL/6J成年小鼠 造血干细胞 WBB6F/J-KitW/KitW-V鼠(亚致死剂量同位素照射) 在鼠神经胶质细胞中检测到Y染色体.即鼠造血干细胞移植到鼠中分化为脑星形胶质细胞。2干细胞去分化：一种干细胞向其前体细胞逆向转化称干细胞去分化。实验：成体鼠造血干细胞 鼠卵泡内细胞团 表达胎鼠珠蛋白基因参加胚胎造血系统发育。 3. 干细胞可塑性(1)干细胞横向分化：在干细胞移植时，供体干细胞在受体中普通分化为与其组织来源一致细胞。但有时供体干细胞会分化出与其组织来源不一致其他细胞，这种现象称干细胞横向分化(trans-differentiation)。干细胞横向分化表白成体干细胞被移植入受体中具备很强可塑性。为干细胞治疗提供了也许。(2)实验：小鼠肌肉干细胞体外培养5天少量骨髓间质细胞 接受致死量辐射小鼠中 各种血细胞系。(3)横向分化调控机制：与干细胞微环境关于。干细胞进入新微环境后，对分化信号反映受到周边正在进行分化细胞影响，从而对新微环境中调节信号做出反映。四、干细胞增殖与分化微环境 干细胞巢(stem cell nich)：干细胞在组织中居所。干细胞生存微环境：指干细胞巢中控制干细胞增殖与分化外部信号。如：这些物质可以介导干细胞-干细胞互相作用，以及细胞与细胞外基质作用，影响干细胞增殖和分化。（一）分泌因子 分泌因子是由细胞自分泌或旁分泌生长因子，有分泌因子对维持干细胞增殖，分化和存活具备调节作用。如转化生长因子-和Wnt家族成员，在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用。 1转化生长因子TGF(transforming growth factor)是TGF超家族成员之一，具备调节细胞生长和分化作用。由于TGF能使正常成纤维细胞表型发生转化，即在EGF同步存在时，变化成纤维细胞贴壁生长特性而获得在琼脂中生长能力，并失去密度依赖抑制作用，故命名。TGF作用：TGF-对细胞生长、分化和免疫功能均有重要调节作用。普通对间充质来源细胞起刺激作用，而对上皮或神经外胚层来源细胞起抑制作用。 如TGF-家族成员Dpp可维持果蝇雌性生殖干细胞增殖。2Wnt家族分泌信号分子(1)Wnt基因：Wnt基因最初是在小鼠乳腺癌克隆出来原癌基因，因病毒基因在其旁边插入可激活该基因，称为Int基因，后发现其与果蝇无翅基因(Wingless,wg)高度同源，故合称为Wnt基因。(2)Wnt信号分子： 是Wnt基因编码长度为350400个氨基酸分泌型糖蛋白。它与细胞表面及细胞外基质有联系，在小范畴内(几种细胞直径)起信使作用。 (3)Wnt信号途径：是由Wnt参加将信号由细胞表面传至细胞核内信号传导途径。重要涉及Wnt信号蛋白，跨膜受体(Frizzled)，辅受体LRP(低密度脂蛋白受体关于跨膜蛋白)、Dishevelled、糖原合成酶激酶3(GSK3)、APC、Axin、-连环蛋白及T细胞因子/淋巴结增强因子(TCF/LEF)家族转录调节因子等。(4)Wnt信号途径作用：在生物正常发育中起重要作用，是组织发育、分化所必须核心信号通路。(5)Wnt信号途径作用机理：通过TCF/LEF和-cat对C-myc表达进行调控，即Wnt通路靶基由于c-myc。TCF/LEF是Wnt信号通路中间介质，可与-连环蛋白(-catenin，-cat)结合成复合物，将-catenin由胞浆核内。-cat是Wnt信号通路中最重要信号分子。-cat具备两种功能：细胞粘附及信号转导，其C-端参入信号转导，N-端参入细胞粘附。正常状况下，APC、GSK-3、Axin等调节下，胞浆内-catenin处在平衡状态；当Wnt因子与其受体结合，Wnt信号传导使GSK3被抑制，使-catenin不能正常水解而积累，过量-catenin与Lef/Tcf结合并入核，与DNA结合蛋白Tcf3结合，激活c-myc、cyclinD1等基因转录，增进细胞增殖分化。如Tcf/Lef转录因子家族对上皮干细胞分化：Tcf/Lef与-Catenin形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。（二）受体介导细胞-细胞互相作用 如果蝇Notch基因产物Notch受体。 Notch配体为Delta基因产物，两者均为细胞表面跨膜蛋白。两者结合后在果蝇刚毛器发育中起调节作用蛋白质。 (图，果蝇刚毛)Notch受体果蝇每个刚毛器由一种神经前体细胞发育成，而神经前体细胞又是从含各种神经原细胞细胞群分化出来，这种有选取地发育过程，依赖于Notch和Delta基因调节。Notch与其配体Delta结合后，通过细胞间互相作用，向细胞核传递抑制信号，对相邻细胞侧向抑制，只使某个神经原细胞获得较强竞争能力，被选取发育为神经前体细胞。即当Notch与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；当Notch活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。(三) 胞间基质和整合素1.胞间基质：即细胞外基质，指分布于细胞外空间，由细胞分泌蛋白和多糖构成网络构造。2.作用：细胞外基质可以将细胞粘连在一起，同步还提供一种细胞外网架维持组织构造，通过结合与传递信号分子对细胞存活、增殖、分化、迁移等具备重要影响。3.细胞外基质种类：(1) 胶原胶原是细胞外基质中重要框架构造。当前发现胶原至少19种。每种胶原构造特性均与其特定功能相适应。可形成胶原纤维(、型)、三维网络构造(型)片层胶原。胶原是构成基底膜重要成分之一，并与细胞基质中其他成分一起构成构造与功能统一体。为干细胞生存及生命活动提供微环境。(2) 层粘连蛋白(laminin，LN)层粘连蛋白是基膜重要功能成分。也是胚胎发育中浮现最早细胞基质成分。在成体，它存在于上皮下和内皮下紧靠细胞基底，以及肌细胞和脂肪细胞周边等。层粘连蛋白功能：作为基膜重要构导致分，增进基膜组装，介导细胞粘着胶原进而铺展，增进生长增殖；诱导细胞分化，是个体发生中浮现最早细胞基质。如成肌细胞分化为肌细胞、间质细胞分化为肾细胞、上皮细胞等。(3)纤粘连蛋白(fibronectin，FN)纤粘连蛋白分血浆FN和细胞FN。血浆FN存在于血浆及各种体液中；细胞FN存在于细胞外基质(涉及某些基膜)及细胞表面。细胞FN为多聚体，有20种以上。是同一基因编码产物，转录后由于RNA拼接不同形成各种异型分子，拼接方式依细胞类型及发育状态而定，从而使细胞产生适合组织需要FN形式。即细胞通过控制FN RNA拼接方式，使其与不同细胞结合及产生特异效应。FN功能：重要是介导细胞粘着，以此调节细胞形状和细胞骨架组装，增进细胞铺展、迁移，并可通过迁移途径决定细胞分化方向。如沿富含FN途径迁移神经脊细胞最后分化为肾上素能神经元，形成神经节。4.整合素(1)是一种通过辨认并结合相邻细胞粘附分子和细胞外基质成分，介导细胞-细胞以及细胞-细胞外基质间互相作用受体蛋白质。属于细胞粘连分子。(2)整合素对干细胞作用：是增进干细胞非分化增殖。(3) 作用机理：作为细胞外基质受体，与配体结合后，启动胞内信号传递连锁反映，最后影响基因表达，为增进干细胞非分化增殖提供微环境。将干细胞置于组织中对的位置，使干细胞维持非分化性增殖。整合素是由和两个亚单位形成异二聚体。已发既有16种和9种亚单位，可组合成20余种整合素。与细胞外基质成分结合整合素重要以1与9种亚单位分别构成异二聚体。如当1丧失功能时，上皮干细胞脱离微环境制约，分化成角质细胞。即细胞外基质通过调节1整合素表达和激活，影响干细胞分布和分化方向。(4)整合素对干细胞影响作用过程：需2步：一是整合素活化；二是活化整合素作用于干细胞。整合素活化：整合素普通不与配体结合，需要通过活化。活化因素是外部信号刺激，活化过程为胞内信号外传过程。整合素对细胞作用：作用过程为胞外信号内传：整合素活化后与配体(如纤粘连蛋白)结合 细胞内细胞发生反映。如粘着斑蛋白与骨架系统组装，激酶磷酸化等，使细胞发生分泌、增殖、分化、迁移等。 活化整合素又可失活，使粘附细胞彼此脱离。即整合素通过与细胞外基质弱结合，使细胞在不脱离粘附状况下依照微环境，通过可逆性结合与解离进行细胞迁移。第二节 胚胎干细胞 1胚胎干细胞：从囊胚期(受精后57天)胚胎分离到干细胞称胚胎干细胞。2胚胎干细胞特性：为全能性干细胞。有如下特性：3胚胎干细胞研究价值：是发育生物学基本研究抱负模型和有效工具。(图，胚胎干细胞应用) 一、人胚胎干细胞获得要研究胚胎干细胞，一方面要获得胚胎干 细胞。(一)获得途径：重要有：1从初期胚胎获得美国Thompson研究小组是从囊胚期胚胎内细胞团中获得胚胎干细胞 ：体外受精卵 囊胚期 去除滋养层内细胞团 得5株干细胞系 32代(8个月)保持未分化状态 。2从原始生殖细胞获得gearhart小组：流产胎儿性腺嵴 原始生殖细胞 获得5个多能干细胞系 7个月不分化 。(图，干细胞获得)思路：原始生殖细胞是未分化细胞。 3体细胞移植分化细胞核(乳腺、皮肤细胞) 去核卵细胞杂合细胞 发育成囊胚 胚胎干细胞 成体(如多利羊)。 (图，体细胞获得干细胞) 二、胚胎干细胞重要特性 （一）形态和生化特性 1.形态：细胞体积小，核大，1各种核仁。离体培养可产生密集多细胞克隆。2.生化特性：端粒酶活性高。3.干细胞物理特性：如干细胞对Hoechst33324和Rhodamine 123染料不着色。 4. 干细胞表面免疫原性：普通表达胚胎初期表面抗原，并且有种属差别。如小鼠胚胎干细胞表达胚胎阶段性特异抗原-1(SSEA-1)，不表达SSEA-3或SSEA-4；人胚胎干细胞表达SSEA-3或SSEA-4。(二)干细胞分离与纯化1. 借助细胞生化特性及物理特性，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。2. 干细胞理化特性与其分化调控关于，如上皮干细胞高表达1整合素，介导干细胞与细胞外基质粘附，抑制干细胞分化。(三)干细胞体外培养由于干细胞数目少，应用时需先在体外进行非分化性增殖，再进行诱导分化。不同组织来源干细胞培养条件不尽相似。1 培养条件：需要许多生长因子和间质细胞共培养。如Brustle等在体外培养了鼠ES细胞。分离ES细胞 培养 培养 生长增殖 保持分化潜能。 停止供应生长因子，ES细胞分化为寡树突细胞或星状细胞。2 分化诱导在应用前还需根据靶组织类型对培养干细胞进行定向分化诱导。分化诱导需理解：干细胞发育关于信号调节；干细胞发育微环境。（四）胚胎干细胞分化潜能 胚胎干细胞是全能(多能)性干细胞，具备分化为各种组织细胞潜能。实验1：移植实验人胚胎干细胞 小鼠体内 畸胎瘤(良性)有三个胚层产生组织：三、胚胎干细胞研究伦理挑战 胚胎干细胞研究在伦理、道德和宗教方面遇到很大障碍。避孕、流产和体外授精在西方国家引起很大争议。 (一)存在问题 1. 胚胎干细胞来源与否符合法律与道德？2.胚胎干细胞应用与否会引起伦理及法律问题？3.该项研究与否会导致人流泛滥？或导致医生刻意导致胚胎流产？4.如何看待克隆人研究？ （二）反对人观点 1.以为胚胎干细胞研究破坏人类生命，其观念基于人类生命起始于初期胚胎。2.天主教派极力反对胚胎干细胞研究，以为用人类胚胎干细胞进行研究是一种“邪恶”。 (三)支持者观点 科学界和病人组织强烈呼吁政府支持这项研究。4月，James Watson博士(DNA双螺旋构造创造人、冷泉港实验室主任)倡导发起了由80位诺贝尔奖获得者参加签名运动，呼吁政府支持干细胞研究。 (四)西方政府态度 1美国总统布什(1)当选总统前反对，当选后出于政治目，批准政府有限支持。8月9日，布什作出决定，美国政府资助对8月9日前得到人体胚胎干细胞研究，但不支持从新胚胎中获取干细胞研究。(2)同步，布什提出成立一种由科学家、医生、伦理学家、律师、神学家等构成总统生物伦理专家委员会，指引干细胞研究和管理。由芝加哥大学生物伦理学专家Leon Kass担任主席。2美国国立卫生研究院(NIH)(1)美国国立卫生研究院是美国联邦政府支持干细胞研究重要机构。(2)NIH年度经费为204亿美元，投入干细胞研究2.26亿美元，其中用于人体成年干细胞研究为1.41亿美元。(3)依照布什决定，NIH对现存人体胚胎干细胞系进行登记，认定世界上有64个人体胚胎干细胞系符合联邦政府资助原则。(4)64个人体胚胎干细胞系分布在6个国家10个机构中：瑞典24个，美国20个，印度10个，澳大利亚6个，以色列4个。NIH试图用这些人体胚胎干细胞系完毕关于人体胚胎干细胞基本研究工作。3其她国家态度(1)德国禁止运用人体胚胎干细胞进行研究。(2)澳大利亚开始仿效美国作法，有限支持人体胚胎干细胞研究。(3)法国、英国、日本容许运用多余胚胎和SCNT技术创造胚胎进行干细胞研究。第三节 精原干细胞 精原干细胞来自原始生殖细胞。胚胎外胚层 原始生殖细胞 双侧生殖腺嵴 生精索( 曲细精管) 生精母细胞(精原干细胞前体细胞) 成体精原干细胞 一、精原细胞增殖和干细胞再生 1精原细胞形态特性：精原细胞紧贴于曲细精管基膜，圆形或卵圆形，12m，核大，除核糖体外其他细胞器不发达。 2精原细胞增殖与类型：精原细胞分为A型和B型。A型：常染色质丰富，核仁常接近核膜，依照在曲细精管局部排列特性，又分为Asingle、Apaired和Aaligned三种类型。B型：分化型精原细胞。 其中Apr型即是进入精子分化第一步。A1型标志精原细胞开始定向分化。B型标志精子开始形成。 二、精原细胞分化及其控制 1分化Aal型精原细胞 A1型 精子A1型精原细胞是精子形成不可逆调控点。机体对这一调控点有相称严格控制。 2分化控制 (1)精原细胞分化抑制影响因素：动物模型研究表白，精子发生存在可逆性抑制，使A1型精原细胞不分化而增殖。其影响因素如sertoli细胞中毒、辐射损伤、维生素缺少甚至睾丸温度升高等。(1) 细胞毒性药物致分化抑制sertoli细胞毒性药物2，5-己二酮 小鼠A1型精原细胞不能分化。用促性腺激素释放激素激动剂治疗后，药物导致分化抑制得以缓和。阐明激素水平可以调节生殖细胞分化。 (2) Kit受体作用Kit受体：即干细胞生长因子受体。属于生长因子受体类原癌基因产物。作用：原始生殖细胞表达Kit受体，sertoli细胞分泌干细胞因子(SCF)。SCF通过与Kit受体结合增进细胞增殖。干细胞因子：有两种形式在已二酮(hexanedione)导致精子发生衰退大鼠中，sertoli细胞表达可溶性因子，经激素治疗后，膜包被型数量增长。表白Kit-SCF在精原细胞分化中作用。 (3) VitA作用VitA缺少精细胞退化，补充VitA或维甲酸分化重新开始推测：A型精原细胞中有维甲酸核内受体，因而维甲酸对A型精原细胞有作用，但这种作用依赖sertoli细胞。 三、精原细胞凋亡 精子发生过程中通过细胞凋亡调节分化型精原细胞密度。分化型精原细胞在曲细精管不同部位差别很大，但原始生殖母细胞密度变化很小，是由于分化型精原细胞在不同部位选取性地凋亡。精子发生过程中凋亡有关基因 （一）Bcl-2家族 1. bcl-2基因bcl-2基因：是1985年发现一种原癌基因，与Ced基因有23%同源性。Bcl-2蛋白：bcl-2基因编码26kd膜蛋白，存在于线粒体、核膜、内质网膜上。生理功能重要是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，对细胞增殖率和分化不产生影响。2. Bcl-2 家族(1)Bcl-2 家族：Bcl-2家族涉及Bcl-2结合蛋白和Bcl-2同源蛋白，它们在构造上有同源性，共同具备2个保守区域：即Bcl-2同源区BH1和BH2区段，功能有关，即诱导或抑制细胞凋亡。这些蛋白涉及Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-xs、Bax、Bad、Bad-1以及线虫CED-9等。(2) Bcl-2 家族在细胞内存在形式：由于它们同源构造，可以形成同源二聚体或异源二聚体。如：同源二聚体Bcl-2-Bcl-2；异源二聚体Bcl-2-Bax。 (3)Bcl-2蛋白家族重要成员及生理功能：Bcl-2：抑制细胞凋亡Bax ：诱导细胞凋亡bcl-x：通过mRNA不同剪切形成两种蛋白，Bcl-xl和Bcl-xs。3. Bcl-2抑制凋亡机制Bcl-2抑制凋亡作用是通过与促凋亡基因Bax形成异源二聚体来实现。(1)Bcl-2、Bax和Bcl-X凋亡控制系统：Bax同源二聚体Bax-Bax，诱导凋亡；Bcl-2与Bax形成Bcl-2-Bax异源二聚体，构造比Bax-Bax同源二聚体更稳定，可“中和” Bax-Bax二聚体诱导凋亡作用。即细胞内Bcl-2与Bax表达水平调节细胞生存或凋亡。当Bcl-xs存在时，优先与Bcl-2形成异源Bcl-xs-Bcl-2二聚体，而使游离Bax得以形成同源二聚体，诱导凋亡发生。此时Bcl-2表达并不抑制细胞凋亡。(2)Bcl-2家族蛋白抑制凋亡分子机理： Bcl-2家族蛋白形成异源二聚体，是依赖其同源构造域BH1和BH2。当Bcl-2中BH1和BH2区域特定氨基酸被转换后，不能与Bax形成二聚体，而自身形成同源二聚体Bcl-2-Bcl-2，其抑制凋亡功能丧失。(3)精原细胞中Bcl-2家族精原细胞不存在Bcl-2，但在Bcl-2转基因小鼠中，局部高密度诱导精原细胞凋亡消失。阐明虽然Bcl-2蛋白自身并不参加，但其家族成员控制着精子发生过程。即Bax和Bcl-X表达和作用平衡控制精原细胞密度有关性调亡。 睾丸中表达Bcl-X基因有两种变异体Bcl-Xs和Bcl-Xl，前者促凋亡，后者抑凋亡。Bax基因是控制精原细胞凋亡重要因素。剔除Bax基因小鼠无生育能力，其睾丸组化特性与Bcl-2和Bcl-Xl转基因小鼠相似，都体现出精细胞汇集。（二）P53蛋白 1P53蛋白是由p53基因编码由393个aa构成核磷蛋白。在许多组织中有表达，特别是在胸腺、脾、睾丸和卵巢中表达量很高。p53基因位于17q13。 2p53蛋白生物学功能 (1)p53蛋白与细胞中DNA损伤：DNA损伤严重p53蛋白表达水平急剧增长细胞停止在G1期，等待细胞对DNA进行修复。即p53通过监视DNA忠实性和稳定性而调节细胞增殖，防止肿瘤发生。(2)p53蛋白与细胞周期控制：野生型p53可以制止细胞转化，抑制细胞成瘤能力。p53是一种转录因子类蛋白，可以增进细胞内某些基因表达。如GADO-45，mdm-2和p21基因。p53蛋白抑制细胞分裂功能很也许与增进p21基因表达关于，由于p21蛋白是细胞周期增进因子CDK抑制剂。p21蛋白可通过与CDK结合而抑制CDK激酶活性，从而使细胞停止在G1期。即p53蛋白在细胞内通过增进p21基因表达而抑制细胞周期。(3)P53蛋白与癌蛋白作用：P53蛋白可被癌基因产物结合而失活。(4)P53蛋白对细胞凋亡作用：P53蛋白水平增长可使有些类型细胞发生凋亡，其机制之一就是当细胞中DNA损伤太严重时，细胞自身难以修复，选取凋亡以保证器官功能正常。 3P53蛋白与精原细胞凋亡 (1)p53缺陷型小鼠睾丸中A1型精原细胞比野生型小鼠多50%。p53缺陷导致A1型精原细胞多2种因素：一是正常p53蛋白参加不分化精原细胞周期调节，二是正常p53蛋白可诱导这些细胞凋亡。 (2)p53缺陷型小鼠细线期精母细胞数量与野生型小鼠相近，阐明p53缺陷型小鼠仍能精准控制精原细胞分化水平。 第四节 成体干细胞 成体组织或器官中，许多细胞仍具备自我更新及分化产生不同组织细胞能力，如血液细胞、皮肤细胞、受损肝组织细胞等。这些细胞即是成体干细胞. 一、造血干细胞 造血干细胞是第一种被结识组织特异性细胞。1961年Till和McCulloch初次通过小鼠脾集落形成实验证明造血干细胞在成体内存在。1形态：普通以为造血干细胞形态类似小淋巴细胞。2细胞表面标志：表面标志比较多，临床上应用最多是CD34。还可与KDR (kinase insert domain recepter)配合鉴定造血干细胞和造血祖细胞。实验：Zieglar用致死剂量照射小鼠后进行细胞移植实验。3造血干细胞胚胎发生中胚层细胞 造血环境(大动脉、性腺脊、中期肾区) 胎肝 髓系及淋巴系前体细胞 骨髓 4造血干细胞调控(1)维持造血干细胞数目恒定：干细胞因子(2)影响干细胞移行、数目维持、分化：成纤维细胞生长因子(FGF-1，FGF-1)、SDF-1、细胞外基质。 二、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC) 1间充质干细胞位置 间充质干细胞附着于骨髓窦内腔面，形成 一种包埋于窦状网络中三维细胞网络。(图，间充质干细胞) 2MSC分离与表面标志(1)分离：骨髓抽提物取1.073/ml密度界面上细胞，贴壁生长细胞中9598%为MSC。依照细胞表面抗原获得MSC。(2)MSC特异性表面标志通过流式细胞仪分析，间充质干细胞特异性表面抗原有：SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124。 3间充质干细胞分化方向间充质干细胞可分化为各种间充质组织。如骨、关节、脂肪、肌腱、肌肉、骨髓基质等。来源不同或在不同条件下，间充质干细胞可分化相应组织细胞。如骨髓中间充质干细胞可分化脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。在具有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、吲哚美辛培养基中，95%间充质干细胞分化为脂肪细胞。在含TGF-3无血清培养基中，间充质细胞会分化为软骨细胞。由于间充质细胞在体外可以相对容易地诱导出骨细胞、软骨细胞，可在骨损伤、先天性骨畸形有治疗中有广泛应用。三、神经干细胞 老式观点：神经细胞无再生能力。新发现：中枢神经系统中某些细胞仍具备自我更新及分化产生成熟脑细胞能力，这些细胞被称为神经干细胞。 1神经干细胞存在部位哺乳动物中脑侧室室管膜下区涉及室管膜细胞中存在有增殖能力干细胞。成体下脑室区、嗅球及海马区是神经干细胞存在部位。1992年Rynolds和Weiss一方面从成体小鼠脑旁侧室膜下神经组织中分离并培养了神经干细胞。Svendsen等用同样办法从人胚胎中分离出神经干细胞。神经干细胞持续分裂每周传代一次，可维持一年以上。2神经干细胞生化特性神经干细胞表达巢素蛋白，所有神经干细胞都巢素蛋白阳性。 巢素蛋白表达始于神经胚形成期，当神经细胞迁移基本完毕后，合成开始下降，神经细胞完毕分化，巢素蛋白表达停止。3神经干细胞维持与分化(1)增进细胞增殖因素：表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)，对干细胞存活、增殖和分化起重要作用。EGF重要作用是维持神经干细胞生存； FGF-2重要是以对细胞分化起作用。(2)增进神经干细胞分化因素：小牛血清。用小牛血清代替EGF培养神经干细胞，细胞分化为星形胶质细胞、少突状细胞和神经元；巢素蛋白逐渐减少，浮现神经元特有微管结合蛋白2及胶质细胞特性性神经胶质原纤维酸性蛋白。 四、表皮干细胞1表皮干细胞存在部位 (1)表皮干细胞位于表皮基底层。属于专能干细胞。能周期性进入分化程序，最后分化为角质细胞。(2)表皮增殖单位：位于基底层干细胞和分布在它周边由它分裂形成子细胞，共9个，构成一种柱状细胞群，称为一种表皮增殖单位。(3)表皮干细胞分化：表皮增殖单位边沿子细胞脱离基底膜后向上迁移通过棘细胞层和颗粒层细胞，最后形成角质化无核细胞。这层细胞不断脱落，由新生细胞不断补充。人体不同部位皮肤更新速度约24周。在细胞迁移过程中，角质化随着着分化过程。2毛囊干细胞 毛囊构成：由外根鞘、内根鞘和发干构成。毛囊球：涉及间充质细胞(团)构成毛乳头和基质细胞。基质细胞：产生内根鞘和发干活跃分裂细胞称为基质细胞。是存在于毛囊球中一群可分裂上皮细胞。毛乳头中间充质细胞即是毛囊干细胞。毛囊干细胞需在毛囊膨胀部位进行增殖。当基质细胞失去增殖能力时，毛囊退化，拉动毛乳头细胞团进入膨胀部位，毛乳头细胞团接受信号刺激后，膨胀部位干细胞增殖产生新毛囊。毛囊中干细胞同样可以产生表皮，特别在外伤或烧伤后能重建表皮毛发。3表皮干细胞生化标志 (1)表达角蛋白5(keratin 5，K5)和K14分子：同角细胞相似。产生角蛋白在成熟皮肤细胞中形成中间网络，使表皮细胞形成一种整体，并具备韧性。表达整合素：与型胶原和纤维粘合素粘附。以这种方式与基底膜相连。当这种粘附力下降时，干细胞易从干细胞巢脱落，向表皮分化。干细胞高表达整合素和粘附素，在维持干细胞增殖和存活信号传导途径中发挥重要作用。毛囊干细胞增殖潜能非常大，体外一单独毛囊干细胞在适当条件下产生子细胞数多达1.71038，大大超过了覆盖整个成体体表所需细胞数。五、肠干细胞 1肠干细胞位置肠表面由被肠腺环绕并根植于肠壁绒毛构成，每一肠腺大概有250个细胞，其中有肠干细胞，位于肠腺基部或近基部。 2肠干细胞增殖与分化 小肠绒毛上皮细胞更新是从隐窝底部干细胞分裂开始。分裂成一种子细胞保持增殖能力，返回增殖池，另一种子细胞向上迁移，并逐渐失去分裂能力，分化为上皮细胞，至绒毛顶部死亡脱落。肠干细胞增殖缓慢(Tc24小时)过渡放大细胞(Tc=11小时)迁移并分化死亡落入肠腔。3肠干细胞生化特性与分离 (1)肠干细胞表达中间纤维K8、K18、K19(2)肠干细胞体外培养至今未成功 4肠干细胞增殖分化调节 (1)转录因子调节-连环蛋白与 Lef/Tcf家族成员结合Tcf4，启动增进细胞增殖基因转录，细胞增殖。机制与皮肤干细胞调控一致。实验：Tcf4缺失小鼠肠干细胞发育缺陷。Lef/Tcf-catenin 有增进干细胞增殖，弱化干细胞在巢中附着重要功能。 (2)蛋白质调节肠干细胞合成角蛋白K8可增进细胞分化。缺少K8蛋白小鼠有大肠增生现象。表白角蛋白表达水平可影响干细胞增殖和迁移。(3)细胞分泌物调节小肠E-钙粘素高表达抑制肠腺增生并诱导凋亡。整合素及其胞间配体对肠干细胞数目维持也有重要调控作用。 第五节 干细胞应用研究重点 一、移植研究恢复器官功能 1细胞治疗。干细胞可恢复因重大疾病而损害细胞，这是干细胞潜在最大优势。由于丧失正常细胞功能疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化来特异组织细胞来治疗。(图，干细胞及其应用)如用神经细胞治疗神经变性疾病(帕金森氏综合征、享廷顿舞蹈症、老年痴呆症等)；用胰岛细胞治疗糖尿病；专心肌细胞修复坏死心肌等。由于成年人心脏和胰岛几乎没有干细胞，无法靠自身得到修复。可以用人体胚胎干细胞能直接分化成相应细胞进行移植。2基因治疗。即通过胚胎干细胞和基因工程技术，矫正缺陷基因。因干细胞能自我复制更新，是基因治疗抱负靶细胞。将治疗基因整合到干细胞，再将干细胞移植入人体中，可以持久地发挥作用，而不紧张像分化细胞那样，在细胞更新中也许丢失治疗基因成果。例如，对囊性纤维化病治疗。囊性纤维化病是一种基因缺陷遗传病，30岁此前致死。若在胚胎初期干细胞中将缺陷基因修正，再将修复后胚胎干细胞嵌入胚胎中， 将会生出一种健康婴儿。由于伦理和某些技术问题，当前尚未展开此类实验。二、基本研究 1运用干细胞研究解释先天缺陷产生因素和防治办法。2将发育生物学与干细胞生物学有关联，研究干细胞生长与分化遗传控制与环境条件等，便于在实验室中进行干细胞培养和分化。 三、癌症治疗 研究人员正试图设计各种办法，使特定细胞能击中特定癌细胞，直接破坏或变化癌细胞。 四、国内干细胞研究概况1. 需要：国内人口多，需要干细胞移植治疗疾病发病率与其她国家相似。2. 迫切：国内家庭构造以独生子女为主，能提供具备相似或有关基因组织器官也许性低，因而对干细胞及其衍生组织需求量大、迫切。 3. 研究与应用：国内干细胞研究和应用有一定基本，研究和应用最多是造血干细胞。如骨髓移植治疗血液病于20世纪70年代末开始，90年代以来已逐渐普及应用外周血和脐血干细胞移植治疗血液病和肿瘤。