超声辅助复合酶法提取小龙虾虾壳蛋白及其性质研究_汪文青.pdf

第 14 卷 第 11 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.11 2023 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun.,2023 基金项目:国家重点研发计划项目(2019YFD0902000)、湖北省农业科技创新中心项目(2022-620-000-001-25)Fund:Supported by the National Key Research and Development Program of China(2019YFD0902000),and the Hubei Agricultural Scientific and Technological Innovation Center Project(2023-620-000-001-25)*通信作者:白婵,硕士,主要研究方向为生物物理学。E-mail: 王雅,副教授,主要研究方向为功能性食品。E-mail:*Corresponding author:BAI Chan,Master,Institute of Agro-products Processing and Nuclear Agricultural Technology,Huber Academy of Agricultural Sciences,No.5 Nanhu Avenue Hongshan District,Wuhan 430064,China.E-mail: WANG Ya,Associate Professor,Lanzhou University of Technology,No.36 Pengjiaping Road,Qilihe District,Lanzhou 730050,China.E-mail: 超声辅助复合酶法提取小龙虾虾壳 蛋白及其性质研究 汪文青1,2,廖 涛2,熊光权2,王炬光2,邱 亮2,白 婵2*,王 雅1*(1.兰州理工大学生命科学与工程学院,兰州 730050;2.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所/农业农村部农产品冷链物流技术重点实验室/湖北省农产品辐照工程技术研究中心,武汉 430064)摘摘 要要:目的目的 提高副产物虾壳中蛋白的提取率,并探究虾壳蛋白的功能活性。方法方法 以小龙虾虾壳为原料,在单因素的基础上,以加酶量、复合酶比例、酶解时间和超声时间为响应变量,蛋白提取率为响应值,采用响应面 Box-Behnken 试验设计优化超声辅助复合酶法提取小龙虾壳蛋白的最佳工艺。进一步比较复合酶解与单酶酶解制备的多肽的抗氧化活性、抗血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)活性和氨基酸成分组成,研究酶解虾壳蛋白多肽的功能性质。结果结果 加酶量 10200 U,复合酶比例 0.65,酶解时间 2.8 h,超声时间 30 min,该最优条件下的蛋白质提取率为 90.30%,与预测值相对误差为 1.2%。与单酶酶解液相比,复合酶解液的抗氧化能力和 ACE 抑制能力均显著增强,清除 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼和 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐的半最大效应浓度分别为 4.38 mg/mL 和 3.66 mg/mL,最大的 ACE 抑制率达(44.930.89)%,且具有竞争性抑制模式。氨基酸组分分析发现酶解制备的虾壳多肽中必需氨基酸和疏水性氨基酸含量丰富,分别占氨基酸总量的 43.06%和 33.52%,从而表现出抗氧化活性和抗 ACE 活性。结论结论 该研究有效提高了虾壳蛋白的提取率,得到的虾壳多肽中富含多种必需氨基酸和疏水性氨基酸,表现出良好的抗氧化活性和 ACE 抑制活性。关键词关键词:虾壳蛋白;超声波;复合酶;抗氧化活性;抗血管紧张素转化酶抑制活性 Extraction and characterization of Procambarus clarkii shell proteins by ultrasound assisted complex enzymatic hydrolysis WANG Wen-Qing1,2,LIAO Tao2,XIONG Guang-Quan2,WANG Ju-Guang2,QIU Liang2,BAI Chan2*,WANG Ya1*(1.School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China;2.Institute of Agro-products Processing and Nuclear Agricultural Technology,Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Cold Chain Logistics Technology for Agro-product,Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hubei Engineering Research Center for Agricultural Products Irradiation,Wuhan 430064,China)DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2023.11.048第 11 期 汪文青,等:超声辅助复合酶法提取小龙虾虾壳蛋白及其性质研究 53 ABSTRACT:Objective To improve the extraction rate of protein from Procambarus clarkii shells as a by-product,and investigate the functional activity of shrimp shell proteins.Methods Using Procambarus clarkii shell as raw material,the response surface Box-Behnken test design was used to optimize the optimal extraction process of Procambarus clarkii shell protein by ultrasound assisted complex enzyme with enzyme addition amount,ratio of complex enzyme,enzymatic hydrolysis time and ultrasonic time as response variables and protein extraction rate as response values on the basis of single factor.The antioxidant activity,the angiotensin converting enzyme(ACE)inhibition ability and amino acid composition of the proteins prepared by complex enzymatic digestion and single enzyme enzymatic digestion were further compared to investigate the functional properties of the enzymatically digested Procambarus clarkii shell protein proteins.Results The protein extraction under this optimal condition was 90.30%with a relative error of 1.2%from the predicted value by adding enzyme amount of 10200 U,ratio of complex enzyme of 0.65,enzymatic digestion time of 2.8 h and ultrasound time of 30 min.Compared with the single enzyme digestion solution,the antioxidant and ACE inhibition abilities of the complex digestion solution were significantly enhanced,and the scavenging of 1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine and 2,2-diazo-di(3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic acid)diamiammonium salts showed the concentration for 50%of maximal effect of 4.38 mg/mL and 3.66 mg/mL,respectively.The largest ACE suppression rate was(44.930.89)%,and there was a competitive suppression mode.The amino acid fraction analysis revealed that the enzymatically prepared Procambarus clarkii shell proteins were rich in essential and hydrophobic amino acids,accounting for 43.06%and 33.52%of the total amino acids,respectively,thus exhibiting antioxidant activity and anti-ACE activity.Conclusion proteinsThis study effectively improves the extraction rate of Procambarus clarkii shell protein,and the obtains shrimp shell proteins are rich in many essential amino acids and hydrophobic amino acids,and shows good antioxidant activity and ACE inhibitory activity.KEY WORDS:Procambarus clarkii shell proteins;ultrasound;complex enzymatic;antioxidant activity;angiotensin converting enzyme inhibitory activity 0 引 言 小龙虾,又被称为克氏原螯虾(Procambarus clarkii),蛋白质含量为 18.9%,肉质鲜美,易消化,广受消费者欢迎。2021 年,小龙虾全国产量达 263.36 万 t,加工量约为85 万 t,然而虾壳在国内小龙虾加工产业中一般按废弃物处理,虾头、虾壳等废弃物约占整虾质量的 40%左右1,这造成了巨大的资源浪费和环境污染2。因此,合理利用虾壳副产物可以提高相关产业的附加值,有较大的经济意义。小龙虾虾壳中富含蛋白质、甲壳素、虾青素、矿物质等3。其中,蛋白质约占 20%30%,其必需氨基酸模式与世界卫生组织/联合国粮食及农业组织(World Health Organization/Food and Agriculture Organization of the United Nations,WHO/FAO)推荐的模式十分相近4。虾壳蛋白还表现出一定的清除 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、超氧阴离子(O2)等能力,具有一定的抗氧化活性、抗菌活性和抗高血压活性5,是动物饲料的优质蛋白源,也是当前食品、医疗等领域具有开发前景的功能分子6。传统化学方法提取蛋白质耗时久,会造成一定的环境污染,并对肽的结构和生物活性造成损伤7。近年来新兴的发酵法虽污染较小,能大幅降低成本,但仍存在发酵时间长、操作复杂、脱蛋白效率较低等问题8。酶解法可以最大程度保护功能性物质的活性,酶可以使高分子量蛋白质分解成低分子量的肽从而被提取。近年来,关于小龙虾单酶酶解的相关研究较多,贾存江等9使用中性蛋白酶对小龙虾虾壳蛋白进行提取,提取率为 43.58%。胡川等10分别研究了胃蛋白酶和碱性蛋白酶对小龙虾的最佳水解条件,蛋白质提取率分别为 53.9%和 61.9%。利用单酶酶解法虽然可以从虾壳中将虾壳蛋白提取出来,但该方法耗时较久、能耗较高,且小龙虾虾壳中的蛋白提取不完全,仍有很大的发展空间。复合酶解可以使更多的活性氨基酸残基暴露出来,强化酶解效果11。李玉芬等12以海蜇加工下脚料为原料制备胶原蛋白肽,发现风味蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解时的水酶解效果高于单一酶水解。丁琳等13使用复合蛋白酶酶解河蚬肉,发现与单一酶相比,复合酶解不但能够提高产品得率,还能够改善河蚬蛋白质的功能特性。目前复合酶解在小龙虾虾壳上的应用鲜有报道,对复合酶解之后得到的虾壳多肽的功能活性及氨基酸组分分析的研究也相对较少。54 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第 14 卷 本研究以小龙虾虾壳为原料,采用超声波辅助复合酶解的方法同步酶解小龙虾虾壳提取虾壳中的蛋白,研究并比较了不同处理条件下的酶解液的抗氧化和血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性,以期提高副产物虾壳中蛋白的提取率,实现低值虾壳的高值化利用。1 材料与方法 1.1 材料与试剂 加工后去肉的小龙虾虾钳和虾尾于 2022 年 4 月 20 日由武汉梁子湖水产品加工有限公司友情提供,在低温下(4)2 h 内运至湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所,置于 4冰箱中留待进一步处理,虾壳色泽鲜红略微发黑,质地坚硬。风味蛋白酶(20 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、碱性蛋白酶(200 U/mg)(南宁庞博生物科技有限公司);ACE(2 U/mg)、N-3-(2-呋喃基)丙烯酰-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘 氨 酸(N-3-(2-furyl)acryloyl-L-phenyalanyl-glycyl-glycine,FAPGG)(纯度95%)、过硫酸钾(纯度 99%)、碘化钾(纯度 99.5%)、马尿酸(hippuric acid,HHL)(纯度98%)(上海麦克林生化科技有限公司);羟乙基哌嗪乙磺酸2-4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinylethanesulfonic acid,HEPES(纯度 99%)、维生素 C(纯度99%)(北京索莱宝科技有限公司);DPPH(纯度97%)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐2,2-diazo-di(3-ethyl-benzothiazol-6-sulfonic acid)diamiammonium salt,ABTS)(纯 度 98%)(合肥博美生物科技有限责任公司);无水乙醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。1.2 仪器与设备 ME303E 分析天平(精度 0.0010 g,瑞士 METTLER TOLEDO 公司);YR-8 超微粉碎机(济南银润包装机械有限公司);K9860 全自动凯氏定氮仪(山东海能科学仪器有限公司);HH-S6 水浴锅(郑州杜甫仪器厂);3K15 高速冷冻离心机(美国 SIGMA 公司);SPARK 酶标仪(瑞士 TECAN 公司);FD5-2.5 冷冻干燥机(美国 GOLD SIM 公司);L8900 氨基酸分析仪、色谱柱(200 mm4.6 mm)、阳离子树脂层析柱(日本 Hitachi 公司)。1.3 实验方法 1.3.1 虾壳粉的制备 参考朱继国等14的方法制备虾壳粉。将新鲜虾壳用自来水流水进行冲洗,冲去表面泥土残渣及残留物,煮沸消毒 30 min,沥干水分,于 80烘箱中烘干 12 h 至恒重,初步粉碎后再超微粉碎 30 min,得到粒径为 1025 m 的虾壳粉备用。1.3.2 单因素实验 采用双缩脲方法测定蛋白质提取率15,以蛋白质提取率为评价指标,根据预实验结果选择碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合,进行酶量(8000、10000、12000、14000、16000 U)、复合酶比例(碱性蛋白酶:胰蛋白酶=1:3、1:2、1:1、2:1、3:1)、酶解时间(1、2、3、4、5 h)、超声时间(5、10、15、20、25 min)、超声温度(15、25、35、45、55)的单因素实验,确定最佳酶解方案。1.3.3 响应面实验 在单因素实验基础上,利用 DesignExpert 13 中的Box-Behnken Design 设计原理,选取酶量(A)、复合酶比例(B)、酶解时间(C)、超声时间(D)这 4 种对酶解效果影响较显著的因素,设计 4 因素 3 水平响应面实验。实验因素及水平设计见表 1。表 1 Box-Behnken 设计的因素编码和水平 Table 1 Codes and levels of test factors in Box-Behnken 因素 水平 1 0 1 A 酶量/U 8000 10000 12000 B 复合酶比例 1:3 1:2 1:1 C 酶解时间/h 2 3 4 D 超声时间/min 20 30 40 1.3.4 虾壳多肽性质分析 分别将经过碱性蛋白酶、胰蛋白酶、未超声的复合酶和经超声的复合酶酶解得到的酶解液冻干,得到的小龙虾虾壳多肽记作 UCSP-A、UCSP-T、CSP-AT、UCSP-AT,研究其抗氧化和 ACE 抑制能力。1)氨基酸组分分析 样品前处理:将多肽溶液以 1:1(V:V)加入分析纯盐酸4 mL,氮吹仪氮吹 15 min 后封管,置烘箱中 110水解2224 h,取出冷却开管,定容至 100 mL,取定容后的样品2 mL,置 60氮吹仪上脱酸至干燥,加入 0.02 mol/L HCl于旋涡器上混匀,过 0.22 m 过滤小柱,上机。色谱条件:检测器为紫外,显色剂为茚三酮,缓冲液系统为钠盐,缓冲液流速 0.2 mL/min,柱温 55,反应室温 138。为了得到肽对 ACE 的抑制机制,根据 ADLER-NISSEN 等16的研究方法,在反应混合物中加入不同浓度的 ACE 抑制肽,使用 Lineweaver-Burk 图确定存在该抑制剂时的 ACE 抑制模式。2)抗氧化活性 根据赵静等17研究方法并略做修改,DPPH,ABTS 自由基清除率分别按式(1)(2)计算:DPPH自由基清除率/%=11j11()100%-AAA(1)第11期 汪文青,等:超声辅助复合酶法提取小龙虾虾壳蛋白及其性质研究 55 ABTS自由基清除率/%=2221()100%j-AAA (2)式(1)中吸光度均在517 nm处测得,A1、A1、A1j分别代表为试样、空白对照、吸收校正的吸光度;式(2)中吸光度均在420 nm处测得,A2、A2、A2j分别代表为试样、空白对照、吸收校正的吸光度。3)ACE抑制活性及其抑制动力学 根据陈冰冰等18研究方法并略做修改,采用FAPGG法测定ACE抑制率,按式(3)计算:ACE抑制率/%=ab1100%（）-AA (3)式(3)中Aa,Ab分别为加入抑制剂和缓冲液后,340 nm处吸光度30 min 内的变化。1.4 数据处理 实验设置3组重复(平行),实验数据使用Origin 2019和Design-Expert 13软件对数据进行分析处理。2 结果与分析 2.1 单因素实验 随着酶量的增加,虾壳中的蛋白被逐渐提取出来,但过量的酶减少了酶和底物之间的碰撞机会,导致反应速率降低19。当复合酶的酶量为10000 U时,酶解效果最好,蛋白质提取率最高,为77.12%。随着复合酶比例逐渐增大,蛋白质提取率先增大后减小,这可能是因为引起了酶之间的竞争性抑制20,两种酶分别与蛋白质形成复合体系,使另一种酶不能与底物充分结合,影响酶解效果21。当复合酶比例1:2(m:m,下同)时,蛋白质提取率最高,为88.60%,最佳复合酶比例为1:2。在12 h内,蛋白质提取率上升速度较快,在第3 h达到峰值后逐渐减小。随着酶解时间的延长,酶活力变低,酶解速率逐渐变低,这符合酶解的一般规律22,故酶解3 h最佳。经复合酶解,蛋白质提取率在超声处理30 min时最高,这是因为超声处理会对底物蛋白的空间构象产生一定影响,进一步使酶切位点暴露,促进底物与酶结合23。但是过长时间的超声处理会产生热效应和剪切力,不仅会使部分底物的活性部位受到破坏,还会使反应体系的温度升高,从而对整个反应起负面作用24。当超声温度为25时,蛋白质提取率最高,为89.98%。在适宜的温度范围内,超声波的加热效应可以加速底物和酶作用位点的释放,促进水解反应25。但蛋白质提取率的变化较为平缓,与其他因素相比,超声温度对蛋白质提取率的影响不大。2.2 响应面实验 2.2.1 响应面实验设计和结果 利用软件 DesignExpert 13,在单因素实验基础上,以蛋白质提取率为响应指标,设计4因素3水平实验,共计29组,响应面设计方案及结果见表2。表 2 响应面设计方案与结果 Table 2 Response surface design scheme and results 实验号A 酶量/U B 复合 酶比例C 酶解 时间/h D 超声 时间/min蛋白质 提取率/%1 1 1 0 1 75.22 2 1 1 0 0 79.01 3 1 0 0 1 69.46 4 0 0 1 1 81.56 5 0 1 1 0 84.52 6 0 1 0 1 80.21 7 0 1 0 1 76.68 8 0 0 0 0 90.22 9 0 0 1 1 77.32 10 0 1 1 0 74.91 11 0 0 0 0 89.32 12 0 1 0 1 81.64 13 1 0 1 0 78.78 14 1 0 1 0 73.16 15 1 1 0 0 78.79 16 1 0 1 0 70.31 17 0 1 1 0 78.64 18 0 0 0 0 88.27 19 1 0 0 1 75.52 20 1 1 0 0 74.28 21 0 0 1 1 80.28 22 1 1 0 0 78.05 23 0 0 0 0 89.57 24 1 0 1 0 75.96 25 0 0 1 1 75.86 26 1 0 0 1 72.89 27 0 0 0 0 90.03 28 1 0 0 1 75.56 29 0 1 1 0 77.71 2.2.2 模型方程的建立及显著性分析 经DesignExpert 13进行多元回归拟合得到的蛋白质提取率(Y)关于酶量(A)、比例(B)、酶解时间(C)、超声 时 间(D)的 回 归 方 程 为:Y=234.16124+0.043453A 10.93565B+42.11783C+2.84823D+1.48881103AB7.0875104AC+1.09125104AD+7.86567BC+0.74254BD0.21650CD2.23744106A237.54511B25.54475C20.063960D2。式中各项系数的绝对值代表单因素对蛋白质提取率的影响程度,正负代表影响方向。由表3可知,模型P0.05,不显著,表明模型拟合良好,56 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第14卷 表 3 回归模型的方差分析 Table 3 Analysis of variance of the regression model 方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性 模型 890.82 14 63.63 14.22 0.0001*A 34.04 1 34.04 7.61 0.0154*B 0.02 1 0.016 0.00 0.9530 C 2.97 1 2.97 0.66 0.4288 D 3.48 1 3.48 0.78 0.3928 AB 3.98 1 3.98 0.89 0.3616 AC 8.04 1 8.04 1.80 0.2015 AD 19.05 1 19.05 4.26 0.0581 BC 27.77 1 27.77 6.21 0.0259*BD 24.75 1 24.75 5.53 0.0338*CD 18.75 1 18.75 4.19 0.0599 A2 519.79 1 519.79 116.19 0.0001*B2 115.27 1 115.27 25.77 0.0002*C2 199.57 1 199.57 44.61 0.0001*D2 265.52 1 265.52 59.35 0.0001*残差 62.63 14 4.47 失拟项 51.10 10 5.11 1.77 0.3057 误差 11.53 4 2.88 总和 953.45 28 注:*表示影响极显著(P0.001);*表示影响高度显著(P0.01);*表示影响显著(P0.05);R2=0.9434。能较好地解释响应中的变异。模型R2=0.9434,说明此方程对该模型的拟合度良好,误差较小。一次项A,交互项BC、BD对蛋白质提取率的影响显著(P0.05),二次项A2、C2、D2对蛋白质提取率的影响极显著(P0.001),二次项B2对蛋白质提取率的影响高度显著(P超声时间酶解时间复合比。2.2.3 响应面曲面分析 影响显著的几个交互项因素对蛋白质提取率影响的响应面如图1所示。响应面坡度越陡,说明该因素对蛋白质提取率的影响越大。等高线是响应面在水平方向的投影,椭圆等高线表示两因素交互作用显著,圆形等高线表示两因素交互作用不显著。图中几组等高线显示出较为明显的坡度和较为完整的椭圆形,说明这几个因素的交互作用最显著,与表3中显著性检验结果一致。2.2.4 响应面优化结果 经Design-Expert 13进行响应面优化,优化后的最佳工艺参数为:酶量10219.30 U,复合酶比例0.65,酶解时间2.8 h,超声时间30.23 min,该条件下的蛋白质提取率预测值为90.41%。采用优化后的条件进行验证,为方便操作,取酶量10200 U,超声时间30 min,复合酶比例0.65,酶解时间2.8 h,平行实验3次,平均值为(90.300.25)%,与预测值相对误差为1.2%,与预测值接近,说明该模型较为稳定。2.3 虾壳多肽性质分析 2.3.1 虾壳多肽的氨基酸组成 4种多肽的氨基酸组分见表4,4组样品均检出16种氨基酸成分,包括除色氨酸以外所有的人体必需氨基酸。UCSP-AT检出的氨基酸总量和各氨基酸组分高于其他3组样品,其中必需氨基酸含量占氨基酸总量的43.06%,这表明经过复合酶超声处理能够有效提高虾壳多肽的氨基酸含量。UCSP-AT中含量最高的氨基酸为Glu、Arg、Asp,分别占氨基酸总量的13.23%、10.30%和9.24%,而氨基和羧基不仅有螯合金属离子能力,还能够作为质子供体,所以Glu对抗氧化性的增强有积极意义,Asp属于酸性氨基酸,有助于增强样品的抗氧化能力26。UCSP-AT检出的疏水氨基酸占氨基酸总量的33.52%,疏水氨基酸包括Phe、Val、Leu、Ile、Ala、Met等,可以为抗氧化肽提供疏水环境,有利于对细胞中DNA氧化损伤的修复,也是虾壳多肽具有抗氧化性的原因。研究表明,在降血压肽分子中,相较于其他氨基酸,疏水性氨基酸更为重要,其侧链可与ACE受体紧密结合,从而增强ACE抑制能力27。第11期 汪文青,等:超声辅助复合酶法提取小龙虾虾壳蛋白及其性质研究 57 图 1 各因素交互作用对蛋白质提取率影响的响应面图 Fig.1 Response surface plot of the effect of the interaction of factors on protein extraction rate 2.3.2 虾壳多肽抗氧化能力测定 以VC作为阳性对照,UCSP-A、UCSP-T、CSP-AT、UCSP-AT对DPPH和ABTS的清除能力如图2所示。由图2(a)可知,各样品的DPPH清除率随浓度的增加而增大,在同一浓度下,UCSP-AT较其他3种样品的DPPH清除能力更强,表现出更强的抗氧化活性,其DPPH清除率达到峰值(54.170.37)%后趋于稳定。VC和UCSP-AT对DPPH自由基的半最大效应浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC50)分别为0.0097 mg/mL和4.38 mg/mL,虽然UCSP-AT的DPPH清除率低于VC的DPPH清除率,但其对DPPH的清除仍然表现良好,这说明在超声辅助的复合酶的作用下,虾壳中的蛋白质充分展开,不仅优化了酶解效果,还能够增强虾壳蛋白的功能特性28。58 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第14卷 表 4 虾壳多肽的氨基酸组成 Table 4 Amino acid composition of Procambarus clarkii shell proteins 呈味特性 氨基酸 UCSP-A/(mg/g)UCSP-T/(mg/g)CSP-AT/(mg/g)UCSP-AT/(mg/g)酸鲜 天冬氨酸(Asp)0.288 0.299 0.278 0.331 谷氨酸(Glu)0.432 0.430 0.157 0.474 苏氨酸*(Thr)0.169 0.163 0.160 0.186 丝氨酸(Ser)0.168 0.168 0.409 0.189 甜鲜 甘氨酸(Gly)0.190 0.183 0.177 0.213 丙氨酸(Ala)0.210 0.220 0.208 0.230 胱氨酸(Cys-Cys)0.019 0.014 0.015 0.021 蛋氨酸*(Met)0.133 0.130 0.158 0.130 缬氨酸*(Val)0.169 0.147 0.114 0.176 异亮氨酸*(Ile)0.176 0.157 0.160 0.184 苦 亮氨酸*(Leu)0.252 0.242 0.236 0.276 酪氨酸(Tyr)0.186 0.180 0.171 0.213 苯丙氨酸*(Phe)0.190 0.176 0.172 0.205 组氨酸(His)0.237 0.251 0.220 0.257 苦略甜 赖氨酸*(Lys)0.119 0.119 0.106 0.129 精氨酸(Arg)0.302 0.356 0.312 0.369 合计 3.240 3.235 3.054 3.583 由图2(b)可知,各样品的ABTS清除率随着浓度的增加而增大,UCSP-AT同样相较于其他样品表现出更高的ABTS清 除 率,在 质 量 浓 度 为26 mg/mL时,UCSP-AT的ABTS清除率随着样品浓度增加而增大,在质量浓度为610 mg/mL趋于稳定。CSP-AT和UCSP-AT对ABTS的清除率在2 mg/mL时分别为(72.591.94)%和(80.291.49)%,明显高于UCSP-A和UCSP-T的(55.69 1.31)%和(56.792.26)%(P0.05),这说明低浓度下,经复合酶处理比只经单酶处理的样品对ABTS的清除能力更强,也有研究证明,复合酶解的效果显著优于单酶酶解,这是因为复合酶解过程中,可以进一步减小肽链的长度,优化酶解效果29。CSP-AT和UCSP-AT对ABTS自由基的EC50值分别为4.51 mg/mL和3.66 mg/mL,这说明经过超声后的样品相较于未超声的样品对ABTS自由基的清除率更高,这也表明UCSP-AT中含有更多与抗氧化相关的活性肽成分,这与祁兴普等30的研究结果一致。注:不同大写字母表示同一处理组不同样品质量浓度间具有显著差异,P0.05;不同小写字母表示同一样品质量浓度 不同处理组间具有显著差异,P0.05,下同。图 2 样品的抗氧化能力 Fig.2 Oxidation ability of sample 第11期 汪文青,等:超声辅助复合酶法提取小龙虾虾壳蛋白及其性质研究 59 2.3.3 酶解液多肽抗ACE能力及其抑制动力学 4种多肽对ACE的抑制效果如图3所示。随着样品浓度增加,几种多肽的ACE抑制率均呈现逐渐增大的趋势,在同一浓度下,对ACE的抑制率从大到小依次为UCSP-AT、CSP-AT、UCSP-T、UCSP-A,当质量浓度为10 mg/mL时,几种样品对ACE抑制率均达到最高,分别为(44.930.89)%、(39.030.31)%、(25.791.59)%和(11.310.35)%,说明经过复合酶处理后的样品的ACE抑制率明显高于只经过单酶处理的样品的ACE抑制率,这是由于两种蛋白酶分别作用于不同位点,且共同作用比单一作用所得到的酶解产物更为复杂,导致酶解产物的空间结构和生物活性改变,所以ACE抑制率得到提高31。同样的,经过超声后的样品相较于未超声的样品ACE抑制率更高,这可能是因为超声波的空化作用疏散了蛋白质结构,展现出隐藏在蛋白质里面的ACE活性部位32。研究表明,C末端Arg或Lys的存在能增强ACE抑制效价33,而超声处理和复合酶的协同作用可能使蛋白酶的酶切位点优先在Arg和Lys处裂解,使水解产生的肽段C末端位置为Arg或Lys,从而增强ACE抑制效价。图 3 样品的 ACE 抑制率 Fig.3 ACE inhibition rate of samples 图 4 UCSP-AT 的 ACE 抑制的 Lineweaver-Burk 图 Fig.4 Lineweaver-Burk plot of ACE inhibition of UCSP-AT UCSP-AT对ACE的抑制动力学曲线如图4所示,随着UCSP-AT浓度的增加,反应的Michaelis-Menten常数(Km)减小,而反应的最大速度(Vmax)不变,这是竞争抑制模式的特征。这一结果表明UCSP-AT能够竞争性地与ACE活性位点相互作用,阻碍ACE与底物的结合34,这意味着无论底物分子是否结合,肽都可以与ACE结合产生一个终端复合体。3 结 论 在复合酶作用下对虾壳进行酶解,在单因素实验基础上用响应面回归模型优化虾壳蛋白提取,得到最佳工艺条件为:酶量10200 U,复合酶比例0.65,酶解时间2.8 h,超声时间30 min,在该最优条件下,蛋白质提取率最高可以达到90.30%。该条件下制备的虾壳多肽具有明显的抗氧化活性、抗ACE等能力,DPPH清除率和ABTS清除率最高分别达(54.170.37)%,(97.850.80)%,显著高于单酶酶解得到的蛋白多肽。得到的虾壳多肽中富含多种必需氨基酸和疏水性氨基酸,表现出良好的抗氧化活性和ACE抑制活性,且具有竞争性抑制模式,超声处理可以显著提高活性成分的含量。本研究可以为虾壳蛋白的高效提取提供技术参考,提高小龙虾废弃物的附加值,也为虾壳多肽进一步纯化和应用提供基础。参考文献 1 龚钢明,顾慧,蔡宝国.鱼类加工下脚料的资源化与利用途径J.中国资源综合利用,2003,(7):2324.GONG GM,GU H,CAI BG.Resourcefulness and utilization of fish processing offal J.China Res Compr Util,2003,(7):2324.2 高秀君