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常用化学发光免疫分析技术比较
1、化学发光免疫分析
化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，
英音：[,kemi,lju:mi'nesəns] [,imju:nəuə'sei]
是将具备高敏捷度化学发光测定技术与高特异性免疫反映相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间辨别荧光免疫分析之后发展起来一项最新免疫测定技术。
CLIA是将具备高敏捷度化学发光测定技术与高特异性免疫反映相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间辨别荧光免疫分析之后发展起来一项最新免疫测定技术。
1.1、化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析包括两个某些，即免疫反映系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是运用化学发光物质经催化剂催化和氧化剂氧化，形成一种激发态中间体，当这种激发态中间体回到稳定基态时，同步发射出光子(hv) ，运用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反映系统是将发光物质(在反映剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上，或酶作用于发光底物。
1.2、化学发光免疫分析类型
化学发光免疫分析法以标记办法不同而分为两种:
(1)化学发光标记免疫分析法;
(2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂化学发光酶免疫分析法
1.2.1　化学发光标记免疫分析
化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) ，是用化学发光剂直接标记抗原或抗体免疫分析办法。惯用于标记化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester (AE) ，是有效发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2 ) 作用而发光，强烈直接发光在一秒钟内完毕，为迅速闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反映简朴、迅速、不必催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子结合不会减小所产生光量，从而增长敏捷度。
1.2.2　化学发光酶免疫分析
从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA ) ，应属酶免疫分析，只是酶反映底物是发光剂，操作环节与酶免分析完全相似：以酶标记生物活性物质(如酶标记抗原或抗体) 进行免疫反映，免疫反映复合物上酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。当前惯用标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) ，它们有各自发光底物。
12.2.1　HRP 标记CLEIA
惯用底物为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼,luminol) ，或其衍生物如异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰肼) ，是一类重要发光试剂。其构造如图4 所示。鲁米诺氧化反映在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧[过氧化阴离子(O2-) ，单线态氧(1O2) ，羟自由基(OH·) ，过氧化氢(H2O2) ]存在下,生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。
初期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体) ，但标记后发光强度减少而使敏捷度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反映后运用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂(N aOH-H2O2) 作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反映物中酶浓度。Kodak AmerliteTM 半自动分析系统就是运用这一体系专门设计。
1.2.2.2　增强发光酶免疫分析(enhanced luminescence enzyme immunoassay，ELEIA )
在发光系统中加入增强发光剂，如对2碘苯酚等，以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析敏捷度和精确性。在全自动分析仪上，还可通过计算机严密控制，进行自动操作，如加试剂，混合，温育，洗涤，加发光试剂，发光计数，数据解决，绘制原则曲线，直至完毕病人血清样品分析并打印出成果。Am erliteTM 发光增强酶免分析系统用荧光素、噻唑等增强剂，其发光时间可持续长达20min，试剂盒有甲状腺功能检测促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素，与性激素关于有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮，以及其她方面如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。
1.2.2.3　ALP标记CLEIA
所用发光底物为环1，2-二氧乙烷衍生物,,用于化学发光酶免分析底物而设计分子构造中包括起稳定作用金刚烷基，其分子中发光基团为芳香基团和酶作用基团，在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。最常使用底物AMPPD 3-[2-spiroadamatane]-4-methoxy -4-[3-phosphoryloxy]-phenyl-1,2-dioxetane) Dioxetane中文名为：3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷。在碱性磷酸酶(ALP) 作用下，磷酸酯基发生水解而脱去一种磷酸基，得到一种中档稳定中间体AMPD (半寿期为2-30min) ，此中间体经分子内电子转移裂解为一分子金刚烷酮和一分子处在激发态间氧苯甲酸甲酯阴离子，当其回到基态时产生470nm 光，可持续几十分钟(如图5)。AMPPD 为磷酸酯酶直接化学发光底物，可用来检测碱性磷酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其他配基结合物。可检测到碱性磷酸酯酶浓度为10-15mol/L 。
美国DPC公司Immulite全自动酶放大发光免疫分析仪，以碱性磷酸酶为标记物，以金刚烷作发光底物，测定敏捷度相称于10- 21mol/mL酶，采用聚苯乙烯珠作载体，其检测水平已能达到10- 12g/mL。
AMPPD是一种生物化学领域中最新超敏捷碱性磷酸酶底物，其特点：反映速度快，在很短时间内提供对的可靠成果。在它分子构造中有两个重要某些，一种是联接苯环和金刚烷二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一种是磷酸根基团，它维持着整个分子构造稳定。在普通状况下，这种化合物很稳定。但是当有碱性磷酸酶存在时，DioxetanePhosphate作为酶底物会在酶催化一脱去磷酸根基团，形成一种不稳定中间体。这个中间体随后自行分解（二氧四节环断裂），同步发射光子。
该试剂采用微粒子化学发光技术，采用最新磁性微粒，用以包被抗体。用碱性磷酸酶（ALP）标记抗原（抗体）。通过普通抗原抗体反映，碱性磷酸酶结合在微粒子上，碱性磷酸酶结合量同病人血清中待测物质成比例。通过洗涤（反映管两边有磁场，磁性微粒包被抗原抗体结合物被吸附在管子两边，别的游离某些被抽吸掉），最后加入发光底物DioxetanePhosphate，5分钟后，仪器通过光电倍增管检测反映发光强度。　　
AMPPD是碱性磷酸酶化学发光底物，在适当缓冲液中，随着酶催化水解作用，AMPPD分解成AMP-D，后者发出强度很高光信号，其发光速度取决于碱磷酶浓度。当碱磷酶偶合到杂交探针时，便可以通过此系统检测到杂交分子存在量。

2微粒体发光免疫分析
微粒体发光免疫分析(microparticle luminescence enzyme immunoassay,MLEIA ),该免疫分析技术有两种办法：一种是小分子抗原物质测定采用竞争法。另一种是大分子抗原物质测定采用双抗体夹心法。该仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0μm，这样大大增长了包被表面积，增长抗原或抗体吸附量，使反映速度加快，也使清洗和分离更简便，从而减少污染，减少交叉污染概率。反映中使用碱性磷酸酶（ALP）标记抗原或抗体，作用于其底物二氧乙烷磷酸酯，由其在激发态与基态动力学变化中发生发光反映。
2.1、竞争反映
其原理是：用过量包被磁颗粒抗体，与待测抗原和定量标记吖啶酯抗原同步加入反映杯温育，其免疫反映结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合成复合物；二是测定抗原与抗体结合形式。如受检标本中具有待测抗原，则与标记抗原以同样机会与磁颗粒包被抗体结合，竞争性地占去了吖啶酯标记抗原与磁颗粒包被抗体结合机会，使吖啶酯标记抗原与磁颗粒包被抗体结合量减少。由于磁颗粒包被抗体是过量，足以与待测抗原结合。
2.2、双抗体夹心法：
其原理是：标记抗体与被测抗原同步与包被抗体结合成一种反映形式，即包被抗体-测定抗原-发光抗体复合物。详细讲是以顺磁性微珠作为载体包被抗体，运用磁性微珠能被磁场吸引，在磁场作用下发生力学移动特性，迅速捕获到被测抗原，当加入标本后，标本中抗原与磁性抗体形成复合物，在磁力作用下，协助该复合物迅速地与其她非特异性物质分离，使抗原-抗体结合反映时间缩短，测定期间减少，减少了交叉污染几率，此时再加入碱性磷酸酶标记第二抗体，形成磁珠包被抗体-抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤去掉未结合抗体后，加入ALP发光底物环1，2-二氧乙烷衍生物AMPPD 。
AMPPD被复合物上ALP催化，迅速地去磷酸基团，生成不稳定中间体AMPD。AMPD迅速分解，从高能激发态回到低能量稳定态时，持续稳定地发射出光子（hv），发射光所释放光子能量被光量子阅读系统记录，通过计算机解决系统将光能量强度在原则曲线上转换为待测抗原浓度，并报告成果。其检测水平可达pg/ml水平，重复性好。
3、电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA )
ECLIA是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定后来新一代标记免疫测定技术，是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合产物。 它标记物发光原理与普通化学发光（CLA）不同，是一种在电极表面由电化学引起特异性化学发光反映，事实上涉及了电化学和化学发光二个过程。ECL与CLA差别在于ECLA是电启动发光反映，而CLA是通过化合物混合启动发光反映。ECLA 不但可以应用于所有免疫测定，并且还可用于DNA／RNA探针检测。
其检测原理（以TSH检测为例）：第一步：结合了活化三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)3]2+ +N羟基琥珀酰胺酯（NHS）TSH抗体和结合了生物素TSH抗体与待测血清同步加入一种反映杯中孵育9分钟。
第二步：将被链霉亲和素包被磁珠加入反映杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。
下一步，蠕动泵将形成 [Ru(bpy)3]2+-抗体-抗原-抗体-磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面磁铁吸附于电极表面。同步，游离TSH抗体（与生物素结合和与[Ru(bpy)3]2+结合抗体）也被吸出测量室。
紧接着，蠕动泵加入含三丙胺（TPA）缓冲液，同步电极加电压，启动ECL反映过程。发光剂 [Ru(bpy)3]2+和电子供体TPA在阳极表面可同步各失去一种电子而发生氧化反映，使二价[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA 被氧化成阳离子自由基TPA+●，后者很不稳定，可自发失去一种质子（H+），形成自由基TPA●，这是一种很强还原剂，可将一种电子给三价[Ru(bpy)3]3+，使其形成激发态[Ru(bpy)3]2+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激发态[Ru(bpy)3]2+通过荧光机制衰减，发射出一种波长620nm光子，重新生成基态[Ru(bpy)3]2+。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[Ru(bpy)3]2+浓度呈线性关系,故可测出待测抗原含量。
最后，终结电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一种样品测定。

4、时间辨别荧光免疫分析(timeresolved fluoroimmunoassay，TRFIA )
TRFIA以镧系元素作为标记物所建立免疫测定技术。因镧系元素(如Eu3+)所发射荧光寿命长，在测定特异性荧光时，可通过延迟检测时间而将标本或环境中非特异荧光扣除，使其具备良好信噪比。
时间辨别荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，依照镧系元素螯合物发光特点，用时间辨别技术测量荧光，同步检测波长和时间两个参数进行信号辨别，可有效地排除非特异荧光干扰，极大地提高了分析敏捷度。
在生物流体和血清中许多复合物和蛋白自身就可以发荧光，因而使用老式发色团进而进行荧光检测敏捷度就会严重下降。大某些背景荧光信号是短时存在，因而将长衰减寿命标记物与时间辨别荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间辨别荧光分析法（TRFIA）事实上是在荧光分析（FIA）基本上发展起来，它是一种特殊荧光分析。荧光分析运用了荧光波长与其激发波长巨大差别克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光影响，同步，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同始终线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析敏捷度。但是，当进行超微量分析时候，激发光杂散光影响就显得严重了。因而，解决激发光杂散光影响成了提高敏捷度瓶颈。
解决杂散光影响最佳办法固然是测量时没有激发光存在。但普通荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。但是有非常少稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）荧光寿命较长，可达1～2ms，可以满足测量规定，因而而产生了时间辨别荧光分析法，虽然用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度分析办法医学教|育网收集整顿。
平时惯用稀土金属重要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因而从测量办法学上看Tb较好，但不合用于生物分析，故Eu最为惯用。
4.1、时间辨别信号原理
普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选取荧光物质作为标记物时，必要考虑激发光谱和发射光谱之间波长差，即Stokes位移大小。如果Stokes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠，互相干扰，影响检测成果精确性。镧系元素荧光光谱有较大Stokes位移，最大可达290nm，激发光谱和发射光谱间不会互相重叠，加上其发射光谱信号峰很窄，荧光寿命长，铕荧光寿命可达730us，检测中只要在每个激发光脉冲过后采用延缓测量时间方式，待短寿命背景荧光衰变消失后，再打开取样门仪器记录长寿命铕鳌合物发射特异性荧光，可以避免本底荧光干扰，提高检测精密度。
TRFIA测量仪器是时间辨别荧光计，由三大某些构成：光源：脉冲光源：氙灯（每秒闪烁1000次）；小型N2激光器；输出脉冲波长：337nm荧光信号获取系统；数据解决系统医学教|育网收集整顿。
4.2、解离增强原理
解离增强镧系元素荧光免疫分析（DELFIA）是时间辨别荧光免疫分析中一种。它用品有双功能基团构造螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体/抗原分子上自由氨基连接，形成EU标记抗体/抗原，通过免疫反映之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中荧光强度非常弱，因而加入一种增强剂，使Eu从复合物上解离下来，自由Eu同增强剂中另一种螫合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光激发下能发出很强荧光，信号增强了百万倍。由于这种分析办法使用理解离增强环节，因而称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。这是当前在时间辨别荧光免疫分析中应用最多一种分析系统。