近红外荧光成像在肝细胞癌肝切除术中的应用_段彦亨.pdf

综述DOI:10 3969/j issn1001 5256 2023 03 031近红外荧光成像在肝细胞癌肝切除术中的应用段彦亨，安家泽空军军医大学第一附属医院 肝胆外科，西安 710032通信作者:安家泽，anjiaze68163 com(OCID:0000 0002 5839 4992)摘要:肝细胞癌(HCC)的治疗是以手术为主的综合治疗，肝切除术需要切除原发性肿瘤并最大限度地保留正常肝组织。然而，在临床手术中，肉眼和触诊难以精确识别肿瘤组织及其边界，往往导致切除不足或过度切除。近红外荧光(NIF)成像是一种实时、低成本、无创、高灵敏度的成像技术，在引导手术切除肿瘤的应用中得到了广泛的研究。随着荧光成像系统和荧光探针的发展，可以实现术中肿瘤定位和边界确定，使手术更加准确。本文回顾了用于 HCC 术中导航的各种 NIF 探针的发展，并讨论了这些探针的当前挑战和潜在机遇。关键词:谱学，近红外线;荧光光度测定法;癌，肝细胞;肝切除术基金项目:国家自然科学基金面上项目(81773177)Application of near infrared fluorescence imaging in hepatectomy of hepatocellular carcinomaDUAN Yanheng，AN Jiaze(Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital of Air Force Medical University，Xi an 710032，China)Corresponding author:AN Jiaze，anjiaze68163 com(OCID:0000 0002 5839 4992)Abstract:Multimodality therapy based on surgery is the main treatment method for hepatocellular carcinoma(HCC)，andhepatectomy requires the removal of primary tumor and the preservation of normal liver tissue to the maximum extent Howeverin clinical surgery，it is difficult to accurately identify tumor tissue and its boundary with visual inspection and palpation，whichoften results in under resection or over resection Near infrared fluorescence(NIF)imaging is a real time noninvasiveimaging technique with low costs and high sensitivity，and extensive studies have been conducted to investigate its applicationin guiding surgical resection of tumors With the development of fluorescence imaging system and fluorescence probe，intraop-erative tumor localization and boundary determination can be realized to make the surgery more accurate This article reviewsthe development of various NIF probes for intraoperative navigation in HCC and discusses current challenges and potential op-portunities of these imaging probesKey words:Spectroscopy，Near Infrared;Fluorophotometry;Carcinoma，Hepatocellular;Hepatectomyesearch funding:National Natural Science Foundation of China(General Program)(81773177)原发性肝癌在我国的发病率位居常见恶性肿瘤的第 4 位，是肿瘤致死的第 2 病因，严重威胁人民的生命和健康。其中，肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌的大部分(80%)1。目前，临床常用的治疗方法为手术切除，在 HCC 的治疗中疗效确切。肿瘤外科治疗的主要目标是实现肿瘤的完全切除，但是有些患者出现原发灶切除不完全(阳性切缘)，以及切除时未能切除肝脏中所有的病灶(隐匿性病灶)，并且与较低的生存率和较高的复发率密切相关2。因此，需要利用术前或术中的成像技术来定位 HCC，并保证完全切除。776段彦亨，等 近红外荧光成像在肝细胞癌肝切除术中的应用以往常基于磁共振成像(MI)或电子计算机断层扫描(CT)来帮助定位肿瘤，但这两种技术没有足够的分辨率来确定切除边缘。此外，在术中检测手术切缘的常用技术是冰冻切片，但这是一个耗时并且昂贵的方法，并且由于取材的位置会造成此项检测容易出现假阴性。另外，术中超声虽能很好反映肿瘤周围的结构并确定切肝线，但这种技术需要专业的超声科医师，而且超声探头频繁介入不仅影响手术连贯性，耽误时间，而且无法真正做到全程实时成像指导手术。因此，迫切需要一种实时、安全和可靠的成像技术来实现 HCC 的准确定位和完整切除。术中 近红外 荧光(near infrared fluorescence，NIF)成像技术是一种使用方便、安全、成本低的可视化成像技术，在指导外科手术中得到了广泛的研究。NIF 成像技术主要基于近红外一区(NI ，700 900 nm)和近红外二区(NI ，1000 1700 nm)光学波段3 5。与可见光相比，生物组织对近红外波段内光的吸收和散射较少，生物自发荧光较弱，这使得NIF 成像技术具有时空分辨率高、对生物组织损伤小、背景荧光干扰小等优点，在提供生理和病理信息方面具有显著的优势。本文总结了各种 NI 和NI 荧光探针在 HCC 肝切除术中的临床前研究和临床应用的最新进展，对这些探针在不久的将来在肝脏手术中的应用进行展望。1NI 荧光成像1 1用于临床的 NI 荧光探针1 1 1吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)ICG 是美国食品药品监督管理局(FDA)批准临床使用的 NIF染料。静脉注射 ICG 进入体循环后，ICG 与血浆中的白蛋白、脂蛋白等高分子蛋白结合，既不被代谢分解，也不会改变被结合蛋白的分子结构，具有良好的血管内稳定性。ICG 分子通过肝细胞活跃的主动转运系统被肝细胞特异性摄取，随后分泌至胆道系统最终通过肠道排出体外，不存在肠肝循环，使用较为安全6。实验研究表明，荧光在穿透生物组织的过程中，绝大多数光线被血红蛋白(波长 700 nm)和水分(波长 900 nm)吸收中和。ICG 分子被波长 750 810 nm 的光线激发后，发射峰值波长为 840 nm 的荧光，该荧光波长位于深红和近红外线光谱的“窗口”界限(700 900 nm)内，因而具有较大的组织穿透力。正常肝组织可在 12 24 h 内彻底清除 ICG，由于肿瘤组织的“高渗透长滞留效应”以及 HCC 组织中肝细胞的胆汁排泄功能受损，静脉注射后 ICG 在肿瘤组织中残留数周，在术中激发光照射下显示肿瘤组织荧光7。ICG 在 HCC 中聚集的现象在 2007 年被偶然发现，随后 Ishizawa 等8 开展的一项前瞻性研究发现ICG 荧光成像识别了所有 63 例术后病理确诊的HCC，其中，有 8 例术前被漏诊而被 ICG 成功识别。除了肝内 HCC，Satou 等9 在 2013 年报道，利用 ICG成功识别了包括腹膜、淋巴结、肺和肾上腺转移的病理证实为 HCC 的肝外转移灶。同年，Morita 等10 初步探讨了 ICG 荧光成像能否改善 HCC 患者的预后。通过对58 例接受术中 ICG 荧光引导切除术的 HCC 患者的随访发现，这些患者术后 12 个月内的短期复发率较对照组有降低的趋势。Ishizawa 等7 在 2014 年的进一步研究显示通过 ICG 荧光成像识别出 276 个HCC 中的 273 个，灵敏度为 99%。此外，研究11 还发现 ICG 的显像模式与 HCC 的分化程度密切相关。低分化的 HCC 呈环状荧光模式，而高分化和中等分化的 HCC 分别具有完全和部分荧光模式。分化型 HCC保留了摄取 ICG 的能力，但由于缺乏正常的胆管结构，使得 ICG 在肿瘤组织内积聚滞留，显示出部分荧光。低分化或转移性肝癌细胞虽不摄取 ICG，但肿瘤的压迫干扰癌旁肝脏组织 ICG 通过胆管分泌，在不同程度上影响癌旁肝组织 ICG 的正常清除，从而显示环形荧光。最近，Zhang 等12 证明了术中 ICG 近红外荧光检测对于识别体积小且难以肉眼观察到的 HCC 的巨大潜力，检测到的最小 HCC 结节直径约为 2 mm。解剖性肝切除术能显著降低 HCC 的术后复发率，改善患者预后13。术中肝段解剖界限的确定是解剖性肝切除术的技术关键，既往常用的技术是根据肝蒂阻断后肝表面缺血线，以及术中超声引导下穿刺门静脉分支内注射亚甲蓝使目标肝段蓝染来指导解剖性肝段切除术14。但这两种方法精确性较差、难以确定肝段的立体界面，且标记持续时间较为短暂。有研究15 16 报道在解剖性肝切除术中比较经门静脉注射ICG 荧光染料与亚甲蓝界定肝段、指导解剖性肝切除的实际应用效果，结果发现 ICG 荧光染料能更清楚、方便和持久地显示荷瘤肝段在肝实质的三维界限，认为 ICG 荧光导航可安全、有效地应用于解剖性肝切除术。ICG 给药途径的不同，对目标肝段的荧光标志效876临床肝胆病杂志第39 卷第3 期2023 年3 月J Clin Hepatol，Vol39 No3，Mar2023果也相应不同，因此将肝段荧光染色的方法分为“正染”和“负染”。“正染”是指在目标肝段的门静脉(或肝动脉)分支里注射 ICG，ICG 在该肝段肝实质内的近红外线激发后发出荧光，目标肝段的荧光染色可指导解剖性肝切除术;“负染”是指术中选择性阻断目标肝段的肝蒂血流后，从外周静脉内注射 ICG，使除目标肝段外的有血供肝脏实质内 ICG 荧光显影，而目标肝段无荧光染色获得反衬效果。近年来，越来越多的研究17 20 报道了涉及使用 ICG 近红外荧光成像的正染或负染方法开展的解剖性肝切除术。因此，ICG 荧光染色确定肝段解剖界限，实现术中实时肝段可视化，可极大地辅助肝解剖性切除的顺利实施。目前，ICG 荧光成像在 HCC 肝切除术中的应用仍存在两大局限。一是有限的组织穿透深度。据报道21，ICG 被激发后发射的荧光在组织内的穿透深度大约为 10 mm，距肝表面 10 mm 以上的肿瘤很难被识别。另一个局限性是 HCC 结节的高假阳性检出率。我国 HCC 患者大部分同时伴有肝硬化，而肝硬化的再生结节也可显示较强的荧光导致 40%50%的假阳性率22。1 1 25 氨基乙酰丙酸(5 aminolevulinic acid，5 ALA)另一个临床上用于肿瘤诊断的 NI 荧光染料是 5 ALA，5 ALA 是人体血红素生物合成途径中原卟啉的前体物质。正常情况下，体内 5 ALA 水平受到血红素合成的负反馈调节，保持动态平衡的状态，细胞内不会蓄积过多的 5 ALA。当大量外源性5 ALA进入机体时，这种负反馈平衡会被打破，导致细胞 中 原卟啉的过度 积 累。而原 卟啉在 波 长 为405 nm的蓝紫色光的激发下可在 630 nm 的可见光谱内检测到红色荧光。原卟啉在肿瘤细胞和正常细胞中的分解速度不同，在正常细胞中，原卟啉在 2 4 h可彻底降解，而在肿瘤细胞中则需要 12 24 h。因此经激发光激发后，原卟啉过度累积的肿瘤细胞在视觉上就可与原卟啉含量较少的正常组织区分开23。2002 年，Schneider 等24 首次报道了利用 5 ALA 发现了几个肉眼观察不到的 HCC 转移灶。2016 年，Kai-bori 等25 比较了 ICG 和 5 ALA 两种荧光染料在术中检测浅表肝肿瘤的应用。结果显示 5 ALA 和 ICG检测术前确定的主要肿瘤的敏感度分别为 57%和96%，特异度分别为 100%和 50%。据报道26 低血压和肝功能异常是口服 5 ALA 的潜在不良反应，因此ICG 与 5 ALA 相比的主要优势在于其安全性和商业可用性。1 2用于临床前研究的 NI 荧光探针由于靶向性不足，ICG 在 HCC 成像应用中存在一定的局限性。为了提高 HCC 的靶向性以及 NIF 对肿瘤和背景信号的比值(T/B 值)，越来越多的研究通过对常规 NIF 染料的结构修饰、偶联肿瘤的靶向配体以及纳米修饰等策略，研发了一些具有 HCC 诊断优势的 NI 荧光探针。由于需要从有效性、安全性和伦理学角度进行评估，新开发的 NI 荧光探针进入临床实践需要很长时间。大多数用于 HCC 成像的 NI 荧光探针仍处于临床前研究阶段。1 2 1有机染料由于肿瘤线粒体膜电位比正常细胞膜电位高，使得花青素类染料可以直接聚集于肿瘤部位，发 挥 肿 瘤 靶 向 作 用27。Shi 等28 研 究 了I 783在人肝癌细胞 HepG2 荷瘤小鼠中的成像应用。结果显示 I 783 特异性聚集在肿瘤部位，能够清晰地识别肿瘤边缘，并且 NIF 强度随肿瘤体积的增大而增强。2018 年，Shi 等29 又发现 MHI 148 染料可特异性集聚于体外培养的 HCC 细胞，肝癌皮下荷瘤鼠注射 MHI 148 染料 24 h 后 T/B 值逐渐增加，并在 24 h 达到峰值。但对于临床应用来说，肿瘤靶向NIF 染料的整体表现尚不理想，例如溶解性差，生物相容性等问题亟待解决。因此，研发水溶性好、毒性低和肿瘤特异性好的 NIF 染料将是 HCC 非侵入性诊断的方向。1 2 2偶联肿瘤靶向配体的荧光探针荧光染料的肿瘤靶向性对于肿瘤检测的特异性和敏感性至关重要。然而，大部分的 NIF 探针并不具备或仅有极低的靶向能力，这就限制了 NIF 染料在肿瘤显像中的应用。通常 NIF 染料需要与肿瘤特异性配体的结合实现对肿瘤的主动靶向性。这些特异性配体包括化学分子、肽、蛋白质、抗体和核酸适配体等，能够特异性地识别肿瘤细胞相关的生物标志物。2011 年，Li等30 首次证明精子蛋白 17 在 HCC 细胞系 SMMC 7721 中过表达，与 ICG 偶联的抗精子蛋白 17 单克隆抗体可用于体内 HCC 成像。已知 CD24 在包括 HCC在内的多种人类肿瘤中过表达，2015 年 He 等31 将CD24 靶向抗体 G7mAb 和 G7S 偶联 NIF 染料，并在HCC 异种移植组织中观察到特异性 NIF 成像。磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3(glypican 3，GPC3)的表达在976段彦亨，等 近红外荧光成像在肝细胞癌肝切除术中的应用HCC 中显著升高，但在胆管癌或正常肝组织或血清中没有显著升高。Zhu 等32 和 Qin 等33 将 NIF 染料Cy5 5 标记的 GPC3 结合肽静脉注射到 HepG2 荷瘤小鼠体内后，成功区分 HCC 组织与正常肝组织。1 2 3纳米探针随着纳米技术的进展，基于纳米材料的 NIF 分子探针可以通过增强肿瘤微血管系统的通透和滞留作用，或通过与肿瘤相关配体的特异性结合靶向到肿瘤34。2016 年，Zeng 等35 合成了一种精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸共轭介孔二氧化硅纳米颗粒，其高度负载 ICG，可以准确描绘肝癌边缘并在术中提供精确的肿瘤与正常组织荧光强度对比。增加的 ICG 负载能力和肿瘤特异性使得能够识别活体小鼠中 1 mm 的残留微肿瘤和卫星病变。虽然纳米颗粒是用于肿瘤特异性成像的较好方式，但由于其潜在的系统性毒性以及稳定性限制了其广泛应用，目前纳米 NIF 染料的应用仅限于细胞水平和实验动物。因此，开发具有可生物降解或表面包裹的纳米颗粒材料，如磷酸钙、低密度脂蛋白和聚合物等纳米粒子的NIF 将成为未来研究的方向。2NI 荧光成像2 1用于临床的 NI 荧光探针与传统的近红外窗口(NI ，750 900 nm)相比，NI 荧光利用其长波长的优势，减少了光子散射，减少了自发荧光，使光子能够穿透更深的生物组织，提高空间分辨率，可明显提高肿瘤成像的效果36。然而，由于缺乏合适的成像仪器和光学探针，NI 荧光成像尚未在临床实践中得到应用。最近研究37 发现 ICG 在NI 范围内也可显示荧光，并已被证明适用于小动物模型中的 NI 成像。Hu 等38 开发了一种集成的可见光和 NI /多光谱成像仪器，并表征了不同红外窗口下人类和动物研究的成像性能。此外，在 ICG 注射后的 23 例肝肿瘤患者中进行了可见光、NI 和 NI 多光谱成像的首次人体研究。对于所有 HCC 患者(n=11)，NI 成像比 NI 成像显著提高了肿瘤与正常组织荧光强度的比值以及更高的灵敏度和阳性预测值。值得注意的是，NI 成像需要避光，而 NI 成像则不需要。NI 成像与手术室照明环境兼容，为临床应用提供了便利性和可行性。2 2用于临床前研究的 NI 荧光探针尽管NI 荧光探针具有其显著优势，同时还丰富了在NI 生物成像领域的探索和应用，但目前的研究主要集中在基础研究上。Ding 等39 开发了一种自组装的 NI 荧光探针(SCH1 SCH4)，SCH4 在小鼠HCC 模型中显示出快速的肿瘤摄取和较高的肿瘤/正常组织的信号比(7)，能够促进精确的图像引导肿瘤手术，并且还首次展示了在 NI 窗口中检测肝纤维化。此外，en 等 40 报道了一种稀土掺杂的 NI 荧光探针(Gd Es Lips)。对 HCC 的人源肿瘤异种移植小鼠模型成像研究表明，Gd Es Lips 在体内表现出良好的 T2对比效果，NI 荧光成像在肝表面检测到最小病灶直径为 2 mm 的卫星病灶。最近，Zhang 课题组41 合成了一种肿瘤微环境中过氧亚硝酸盐(ONOO)响应的 NI 染料 MY 1057，它可以通过基于荧光寿命成像准确检测单个和多个 HCC。NI 荧光成像的研究仍处于起步阶段，有必要进一步开发发射波长可调、量子产率高、生物毒性低的新型 NI 荧光探针。然而，由于未见报道临床批准的 NI 荧光染料，因此尚无新的探针用于NI 临床手术导航。3当前挑战和未来展望ICG 和亚甲蓝是美国 FDA 批准的唯一可用的NI 荧光团42。亚甲蓝由于其非特异性和有限的量子产率，尚未于常规手术应用。虽然有报道 ICG 可以实现 HCC 的 NI /荧光成像，但作为非靶向探针，ICG 肿瘤显像的高假阳性率限制了其应用发展。目前限制其进一步临床应用的问题为 NIF 染料不具有靶向性以及水溶性差。靶向 NIF 探针需要 NI 荧光团和靶向分子稳定结合，才能实现靶向肿瘤细胞的荧光成像。目前还缺乏针对 HCC 的 NIF 成像的临床试验;更重要的是，对于 HCC 的最佳生物标志物尚无明确共识。HCC 的早期检测和新型靶向 NIF 探针的开发迫切需要分子靶标。与 NI 成像相比，NI 荧光成像具有更深的成像深度，并且具有较少的自发荧光的干扰。然而，在临床环境中实施 NI 成像之前，仍有一些障碍需要克服。首先，目前的 NI 荧光分子大部分生理稳定性差且具有疏水性，此外，其中一些分子是无机荧光团，毒性大，代谢缓慢，不针对特定组织;其次，各种分子相互作用导致猝灭，导致荧光分子发086临床肝胆病杂志第39 卷第3 期2023 年3 月J Clin Hepatol，Vol39 No3，Mar2023出的光减少;第三，目前只有少数 NI 成像系统可用，这些系统的开发成本非常高。最重要的是，目前只有临床前 NI 荧光探针可用，将临床前研究转化为临床环境是一个漫长的过程。因此，临床应用可能还很遥远。在肝切除术中，减少正常结构损伤和去除所有肿瘤组织对 HCC 患者至关重要。迄今为止，NIF 成像已显示出其应用于外科手术的巨大潜力以及改善临床预后的可行性。NI 荧光成像在 HCC 肝切除术中进展迅速，但仍缺乏靶向探针的临床试验。随着临床前研究的不断增加，NI 成像已经到了一个关键的转折点。伴随新的成像技术以及成像设备的不断发展，NIF 成像的研究范围将不断扩大，未来可能真正实现手术导航，帮助外科医生进行术中决策，为 HCC 的诊疗提供一种崭新的方法。利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。作者贡献声明:段彦亨负责收集文献，资料分析，撰写论文;安家泽负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。参考文献:1 General Office of National Health Commission Standardfor diagnosis and treatment of primary liver 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