微生物限度检验操作作业规程.doc

1　 目
规范微生物限度检查操作，保证检查成果精确、可靠。
2　 根据
《中华人民共和国药典》。
3　 范畴
本原则合用于微生物限度检查。
4　 责任
中心化验室负责人：对本规程实行负责。
中心化验室检查人员：严格按照本规程执行检查操作。
5　 程序
5.1　 执行原则：《中华人民共和国药典》。
5.2　 抽样：照《取样原则操作规程》进行。
6 内容
6.1 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数
计数办法涉及平皿法、薄膜过滤法和最也许数法（MPN法）。检查时，按已验证计数办法进行供试品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数测定。
6.1.1 设备、仪器及用品
6.1.1.1 设备
微生物限度检测室、净化工作台、生化培养箱（30～350C）、生化培养箱（20～250C）、电热恒温水浴锅、烘箱、脉动真空灭菌柜、紫外灯等。
6.1.1.2 仪器及器皿
显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、移液枪及吸头、薄膜过滤器等。
6.1.1.3 用品
大、小橡皮乳头，干净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.1.2 试液
6.1.2.1 消毒液
A．0.1% 新洁尔灭溶液
B．75%乙醇溶液
6.1.2.2 稀释液、试剂及配制
A．pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g，加纯化水1000ml，微温溶解，滤清，分装，1210C灭菌15分钟。
B．聚山梨酯80
C．无菌十四烷酸异丙酯
D．pH6.8无菌磷酸盐缓冲液
6.1.3 培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基
6.1.4 操作办法
6.1.4.1 实验前准备
6.1.4.1.1 将供试品及所有已灭菌平皿、锥形瓶、试管、移液枪吸头（1ml、10ml）、量筒、稀释液、培养基等移至传递窗内。每次实验所用物品必要事先筹划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。
6.1.4.1.2 启动微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。
6.1.4.1.3 操作人员进入一更，用洗手液或肥皂洗手，烘干。进入二更，用0.1% 新洁尔灭溶液洗手，穿戴干净无菌服、口罩、手套。
6.1.4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等开口处周边，待干后用灭菌手术镊或剪将供试品启封。
6.1.4.2 供试液制备
依照供试品理化特性与生物学特性，采用适当办法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检查用培养基，不得超过1小时。
惯用供试液制备办法如下。如果下列供试液制备办法经确认均不合用，应建立其她适当办法。
6.1.4.2.1 水溶性供试试品
取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合供试品原液作为供试液。
6.1.4.2.2 水不溶性非油脂类供试品
取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
6.1.4.2.3 油脂类供试品
取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与至少量并能使供试品乳化无菌聚山梨酯80或其她无抑菌性无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂温度普通不超过40℃（特殊状况下，最多不超过45℃），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热稀释液使成1：10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。
6.1.4.2.4 肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10g，加入pH6.8无菌磷酸盐缓冲液，置45℃水浴中，振摇，使溶解，制成1：10供试液。
6.1.4.3 供试液稀释
取1:10均匀供试液1ml，加入装有9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液试管中混匀，即为1:100供试液。以此类推，依照供试品污染限度，可稀释至1:1000、1:10000等适当稀释级。每递增1稀释剂，必要另换一支吸管。
6.1.4.4 检查法
6.1.4.4.1 检查量
检查量即一次实验所用供试品量（g、ml、cm2）。
普通应随机抽取不少于2个最小包装供试品，混合，取规定量供试品进行检查。
除另有规定外，普通供试品检查量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药物、微量包装药物检查量可以酌减。检查时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品。
6.1.4.4.2 平皿法
6.1.4.4.2.1 取规定量供试品，按办法合用性实验确认办法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养至少制备2个平板。
6.1.4.4.2.2 阴性对照 以稀释液代替供试液进行阴性对照实验，阴性对照实验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
6.1.4.4.2.3 倾注培养基
将预先配制好培养基（需氧菌总数计数用胰酪大豆胨琼脂培养基，霉菌和酵母菌总数计数用沙氏葡萄糖琼脂培养基）熔化，置45。C水浴中，备用。将45。C左右琼脂倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向迅速转动平皿（勿使培养基溢出）使供试液与培养基混匀，放置，待凝。
6.1.4.4.2.4 培养和计数
需氧菌总数计数平板倒置于30～35℃培养箱中培养3～5天。霉菌和酵母菌总数计数平板倒置于20～25℃培养箱中培养5～天，必要时可延长至7天。观测菌落生长状况，点计平板上生长所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片平板不适当计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板菌落平均数不不大于15，则两个平板菌落数不能相差1倍或以上。
6.1.4.4.2.5 菌数报告规则
需氧菌总数测定宜选用平均菌落数不大于300cfu稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选用平均菌数不大于100cfu稀释级，作为菌数报告根据。以最高平均菌落数，计算1g、1ml或10cm2供试品中所含微生物，取两位有效数字报告。
如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平板有菌落生长，但平均菌落数不大于1时，以＜1乘以最低稀释倍数值报告菌数。
6.1.4.4.3 薄膜过滤法
6.1.4.4.3.1 薄膜过滤法所采用滤膜孔径应不不不大于0.45µm，直径约为50mm，若采用其她直径滤膜，冲洗量应进行相应调节。选取滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适当办法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤先后完整性。水溶性供试液过滤前先将少量冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上微生物受损伤。
6.1.4.4.3.2 取相称于每张滤膜含1g或1ml供试品供试液，加至适量稀释剂中，混匀，过滤。若供试品所含菌数较多时，可取适当稀释级供试液1ml,过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其她适当冲洗液冲洗滤膜。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上是不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长。
6.1.4.4.3.3 阴性对照 取实验用稀释液1ml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。
6.1.4.4.3.4 培养和计数 培养条件和计数办法同平皿法，每片滤膜上菌落数应不超过100cfu。
6.1.4.4.3.5 菌数报告规则 以相称于1g或1ml供试品菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以<1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或<1乘以最低稀释倍数值报告菌数。
6.1.4.4.4 MPN法
MPN法精密度和精确度不及薄膜过滤法和平皿法，仅在供试品需氧菌总数没有适当计数办法状况下使用，本法不合用霉菌计数。
取供试液至少3个持续稀级，每一稀释级取3份1ml分别接种至3管装有9～10ml胰酪大豆胨液体培养基中。必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。
接种管置30～35℃培养3天，逐日观测各管微生物生长状况。如果由于供试品因素使得成果难以判断，可将该管培养物转种至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基，在相似条件下培养1～2天，观测与否有微生物生长。依照微生物生长管数从表1查被测供试品每1g或1ml中需氧菌总数最也许数。
表1 微生物最也许数检索表
生长管数
需氧菌总数最也许数
95﹪置信限
每管含样品g或ml数
MPN/g或ml
下限
上限
0.1
0.01
0.001
0
0
0
〈3
0
9.4
0
0
1
3
0.1
9.5
0
1
0
3
0.1
10
0
1
1
6.1
1.2
17
0
2
0
6.2
1.2
17
0
3
0
9.4
3.5
35
1
0
0
3.6
0.2
17
1
0
1
7.2
1.2
17
1
0
2
11
4
35
1
1
0
7.4
1.3
20
1
1
1
11
4
35
1
2
0
11
4
35
1
2
1
15
5
38
1
3
0
16
5
38
2
0
0
9.2
1.5
35
2
0
1
14
4
35
2
0
2
20
5
38
2
1
0
15
4
38
2
1
1
20
5
38
2
1
2
27
9
94
2
2
0
21
5
40
2
2
1
28
9
94
2
2
2
35
9
94
2
3
0
29
9
94
2
3
1
36
9
94
3
0
0
23
5
94
3
0
1
38
9
104
3
0
2
64
16
181
3
1
0
43
9
181
3
1
1
75
17
199
3
1
2
120
30
360
3
1
3
160
30
380
3
2
0
93
18
360
3
2
1
150
30
380
3
2
2
210
30
400
3
2
3
290
90
990
3
3
0
240
40
990
3
3
1
460
90
1980
3
3
2
1100
200
4000
3
3
3
〉1100

6.1.4.4.5 成果判断
需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长总菌落数（涉及真菌菌落数）；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长总菌落数（涉及细菌菌落数）。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长细菌使霉菌和酵母菌计数成果不符合微生物限度规定，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）沙氏葡萄糖琼脂培养基或其她选取性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。使用选取性培养基时，应进行培养基合用性检查。若采用MPN法，测定成果为需氧菌总数。
若供试品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查成果均符合该品种项上规定，判供试品符合规定；若基中任何一项不符合该品种项下规定，判供试品不符合规定。

控制菌检查
控制菌检查法系用于在规定实验条件下，检查供试品中与否存在物定物生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等与否符合相应微生物限度原则时，应按下列规定进行检查、涉及样品取样量和成果判断等。
供试品检出控制菌或其她致病菌时，按一次检出成果为准，不再复试。
供试液制备及实验环境规定同需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数应为内容，这个罗列成子项
。
如果供试品具备抗菌活性，应尽量去除或中种。供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生对无毒性。
供试液制备如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂相容性。
阳性对照实验办法同供试品控制菌检查，对照菌加量应不不不大于100cfu。阳性对照实验应检出相应控制菌。
阴性对照实验：以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照实验应无菌生长，如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
6.2 大肠埃希菌
6.2.1 设备、仪器及用品
6.2.1.1 设备
微生物限度检测室、阳性菌检测室、生物安全柜、净化工作台、生化培养箱（30～350C、42～440C）、电热恒温水浴锅、烘箱、灭菌柜、紫外灯等。
6.2.1.2 仪器及器皿
显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。
6.2.1.3 用品
大、小橡皮乳头，干净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.2.2 试液批示液
PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液、革兰染色液、碘液、95%乙醇。
6.2.3 培养基
胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基等。
6.2.4 操作办法
6.2.4.1 供试液制备和增菌培养 取供试品，照“6.1.4.2”制成1：10供试液。取相称于1g或1ml供试液，接种至适当体积（经办法合用性实验拟定）胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，在30～35℃培养18～24小时。
6.2.4.2 选取和分离培养 取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中， 42～44℃培养24～48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。
6.2.4.3 成果判断 若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适当鉴定实验，确证与否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定成果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
6.2.4.4 若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适当鉴定实验。
以接种针轻轻接触单个疑似菌落表面中心，沾取培养物，应挑选2～3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18～24小时，作如下检查。
6.2.4.4.1 革兰染色、镜检 以接种环沾取无菌水于干净载玻片上,取上述疑似菌落营养琼脂斜面新鲜培养物少量,制成均匀涂片,自然或微温干燥,再通过火焰2～3次(载玻片不烫手)固定。滴加结晶紫染液,染色1min,水洗,滴加碘液,媒染1min,水洗,以滤纸吸干余水。滴加95%乙醇,脱色20～30s,水洗。滴加沙黄染液,复染1min,待干后,镜检。
6.2.4.4.2 染色成果 革兰阳性菌呈蓝紫色;革兰阴性菌呈红色,大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌,或球杆菌状,亦有杆菌状。
6.2.4.4.3 注意事项
6.2.4.4.3.1 玻片必要干净，涂片菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连成片。染色反映难于判断，菌细胞形态难于观测。
6.2.4.4.3.2 培养物菌龄以16-24h为宜。培养时间过长革兰阳性菌易染成红色。
6.2.4.4.3.3 脱色是核心，脱色时间局限性，菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染成阴性。
6.3 耐胆盐革兰阴性菌
6.3.1 设备、仪器及用品
6.3.1.1 设备
微生物限度检测室、阳性菌检测室、生物安全柜、净化工作台、生化培养箱（30-350C）、电热恒温水浴锅、烘箱、灭菌柜、紫外灯等。
6.3.1.2 仪器及器皿
显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。
6.3.1.3 用品
大、小橡皮乳头，干净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.3.2 试液、批示液
PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液等。
6.3.3 培养基
胰酪大豆胨液体培养基、肠道菌增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基等6.3.4 操作办法
6.3.4.1 供试液制备和预培养 取供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂照“6.1.4.2”制成1：10供试液，混匀，在20～25℃培养，培养时间应使供试品中细菌充分恢复但不增殖（约2小时）。
6.3.4.2 定性实验 除另有规定外，取相称于1g或1ml供试品上述预培养物接种至适当体积（经办法合用性实验拟定）肠道菌增菌液体培养基中，30℃～35℃培养24～48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30℃～35℃培养18～24小时。如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。
6.3.4.3 定量实验
6.3.4.3.1 选取和分离培养 取相称于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml、0.001ml）供试品预培养物或其稀释液分别接种至适当体积（经办法合用性实验拟定）肠道菌增菌液体培养基中，30℃～35℃培养24～48小时。和述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养平板上，30℃～35℃培养18～24小时。
6.3.4.3.2 成果判断 若紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上有菌落生长，则相应培养管为阳性，否则为阴性。依照各培养管检查成果，从表2查1g或1ml供试品中具有耐胆盐革兰阴性菌也许菌数。
表2 耐胆盐革兰阴性菌也许菌数（N）
各供试品量检出成果
每1g（或1ml）供试品中也许菌数cfu
0.1g或0.1ml
0.01g或0.01ml
0.001g或0.001ml
＋
＋
＋
－
＋
＋
－
－
＋
－
－
－
N＞103
102＜N＜103
10＜N＜102
N＜10
注：（1）+代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长；—代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上无菌落生长。
（2）若供试品量减少10倍（0.01g或0.01ml，0.001g或0.001ml，0.0001g或0.0001ml），则每1g（或1ml）供试品中也许菌数（N）应相应增长10倍。
6.4 沙门菌
6.4.1 设备、仪器及用品
6.4.1.1 设备
微生物限度检测室、阳性菌检测室、生物安全柜、净化工作台、生化培养箱（30-350C）、电热恒温水浴锅、烘箱、灭菌柜、紫外灯等。
6.4.1.2 仪器及器皿
显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。
6.4.1.3 用品
大、小橡皮乳头，干净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.4.2 试液、批示液
PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液等。
6.4.3 培养基
胰酪大豆胨液体培养基、RV沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧酸盐琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基等。
6.4.4 操作办法
6.4.4.1 供试液制备和增菌培养 取10g或10ml供试品直接或解决后接种至适当体积（经办法合用性实验拟定）胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。
6.4.4.2 选取和分离培养 取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中， 30～35℃培养24～48小时。取少量RV沙门增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～48小时。
沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～48小时，或采用基她适当办法进一步鉴定。

6.4.4.3 成果判断 若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适当鉴定实验，确证与否为沙门菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定成果为阴性，或三糖铁琼脂培养基斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。
6.5 铜绿假单胞菌
6.5.1 设备、仪器及用品
6.5.1.1 设备
微生物限度检测室、阳性菌检测室、生物安全柜、净化工作台、生化培养箱（30-350C）、电热恒温水浴锅、烘箱、灭菌柜、紫外灯等。
6.5.1.2 仪器及器皿
显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。
6.5.1.3 用品
大、小橡皮乳头，干净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.5.2 试液、批示液
PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液等。
6.5.3 培养基
胰酪大豆胨液体培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基等。
6.5.4 操作办法
6.5.4.1 供试液制备和增菌培养 取供试品，照“6.1.4.2”制成1：10供试液。取相称于1g或1ml供试液，接种至适当体积（经办法合用性实验拟定）胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，在30～35℃培养18～24小时。
6.5.4.2 选取和分离培养 取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上， 30～35℃培养18～72小时。
取上述平板上生长菌落进行氧化酶实验，或采用其她适当办法进一步鉴定。
6.5.4.3 氧化酶实验 取干净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取上述平板上生长菌落涂于滤纸片上，滴加新配制 1%二盐酸N，N二-甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶实验阳性，否则为阴性。
6.5.4.4 成果判断 若溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶实验阳性，应进一步进行适当鉴定实验，确证与否为铜绿假单胞菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定成果为阴性，或氧化酶实验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。
6.6 金黄色葡萄球菌
6.6.1 设备、仪器及用品
6.6.1.1 设备
微生物限度检测室、阳性菌检测室、生物安全柜、净化工作台、生化培养箱（30-350C）、电热恒温水浴锅、烘箱、灭菌柜、紫外灯等。
6.6.1.2 仪器及器皿
显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。
6.6.1.3 用品
大、小橡皮乳头，干净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.6.2 试液、批示液
PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液等。
6.6.3 培养基
胰酪大豆胨液体培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基等。
6.6.4 操作办法
6.6.4.1 供试液制备和增菌培养 取供试品，照“6.1.4.2”制成1：10供试液。取相称于1g或1ml供试液，接种至适当体积（经办法合用性实验拟定）胰酪大豆胨液体培养基中，混匀。在30～35℃培养18～24小时。
6.6.4.2 选取和分离培养 取上述培养物划线接种于甘露醇氯化纳琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。
6.6.4.3 成果判断 若甘露醇氯化纳琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环白色菌落生长，应进行分离、纯化及适当鉴定实验，确证与否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特性相符或疑似菌落生长，或虽有相符或疑似菌落生长但鉴定成果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
6.7 白色念珠菌
6.7.1 设备、仪器及用品
6.7.1.1 设备
微生物限度检测室、阳性菌检测室、生物安全柜、净化工作台、电热恒温水浴锅、烘箱、、灭菌柜、紫外灯等。
6.7.1.2 仪器及器皿
显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。
6.7.1.3 用品
大、小橡皮乳头，干净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.7.2 试液、批示液
PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液等。
6.7.3 培养基
沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基等。
6.7.4 操作办法
6.7.4.1 供试液制备和增菌培养 取供试品，照“6.1.4.2”制成1：10供试液。取相称于1g或1ml供试品供试液，接种至适当体积（经办法合用性实验拟定）沙氏葡萄糖液体培养基中，混匀。在30～35℃培养3～5天。
6.7.4.2 选取和分离培养 取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24～48小时。
白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长菌落呈乳白色，偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱褶。挑取疑似菌落接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～48小时（必要时延长至72小时），或采用其她适当办法进一步鉴定。
6.7.4.3 成果判断 若沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长菌落呈阳性反映，应进一步进行适当鉴定实验，确证与否为白色念珠菌；若沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定成果为阴性，或疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长菌落呈阴性反映，判供试品未检出白色念珠菌。
6.8 检测周期：6-7个工作日。
7 修订履历
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