微生物限度检查操作作业规程中国药典四部通则.doc

标 题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页 第 1 页起 草 人审 核 人批 准 人起草日期审核日期批准日期起草部门质量管理部颁发部门办公室生效日期一、范畴：本原则规定了微生物限度检查办法和操作规定；合用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌检查。二、引用原则：中华人民共和国药典(通则1105-1106)三、目录 1微生物限度原则2设备、仪器及用品3消毒液、稀释剂、试液及培养基4检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5微生物计数法检查6控制菌检查法7实验技术 8. 附件1微生物限度原则非无菌药用原料及辅料微生物限度原则需氧菌总数(cfu/g 或 cfu/ml)霉菌和酵母菌总数(cfu/g 或 cfu/ml)控制菌药用原料及辅料103102*未做统一规定。1.1成品微生物限度原则品 名法 定 标 准内 控 标 准需氧菌总数(cfu/g 或 cfu/ml)霉菌和酵母菌总数(cfu/g 或 cfu/ml)控制菌需氧菌总数(cfu/g 或 cfu/ml)霉菌和酵母菌总数(cfu/g 或 cfu/ml)控制菌大肠埃希菌沙门菌大肠埃希菌沙门菌乳糖1000100 无10050无水乳糖10010/10g/100g10010/10g/100g蔗糖无无无无10050(1)“”为不得检出。(2)目测霉变者以不合格论。(3)“无”为原则根据或无相应规定。标 题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页 第 2 页1.2工艺用水微生物限度原则品 名法 定 标 准内 控 标 准需氧菌总数(cfu/ml)控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）需氧菌总数(cfu/ml)控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）生活饮用水100不得检出100不得检出纯化水lOO不得检出80不得检出1.3内包装材料微生物限度原则品 名 (单位)需氧菌总数霉菌和酵母菌总数控制菌需氧菌总数霉菌和酵母菌总数控制菌药用聚乙烯烃塑料袋(100cm2)1000cfu100cfu100cfu10cfu阐明：1“”为每100 cm2中不得检出。2目测霉变者以不合格论。3“无”为原则根据或无相应规定。2设施、仪器及用品2.1、设施：2.1.1微生物限度检查室及有关设施：微生物计数实验环境应符合微生物限度检查规定。检查全过程必要严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染办法不得影响供试品中微生物检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。2.1.2其她设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（3035）；霉菌培养箱（2528）；电炉（或其她适当加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250300）；电冰箱。生化试剂储存箱。2.2仪器及器皿2.2.1菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。2.2.2玻璃器皿：锥形瓶（250300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，1012cm）、培养皿（9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01， 10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。2.2.3新购玻璃器皿清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%2%盐酸（工业用）液中约26小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。用于化学分析玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗23次，晾干备用。2.3用过玻璃器皿：2.3.1未被病原微生物污染器皿：可随时洗涤。用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外，可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗23次。标 题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页 第 3 页2.3.2已被病原微生物污染器皿：需先通过灭菌解决后再按常法洗涤。试管及培养皿：先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内，经121灭菌30 分钟。趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮净。吸管：所有直立浸没于清洁液长筒形容器中，筒底应衬有棉或橡皮垫，以防管尖损坏。24小时后，逐支用流水重复冲洗干净，晾干后包扎灭菌备用。载、盖玻片：应分别浸泡于清洁液1224小时后，取出用流水冲洗，再放入3%5%肥皂水或5%碳酸钠液内煮沸1015 分钟，待自然冷却后，再用流水冲洗。沥干后置95%乙醇中浸泡，晾干备用。2，3，3玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5 cm处塞入约2cm适当疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞（以免振荡时供试液污染瓶塞），再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于160干热灭菌2小时或高压蒸汽121灭菌30 分钟，烘干备用。2.4用品2.4.1大、小橡皮乳头（放于干净带盖容器中，并应定期用70%75%乙醇溶液浸泡）。2.4.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。2.4.3接种环（白铱金或镍铬合金，环径45mm、长度610cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12 cm）、实验记录纸等。3消毒液、稀释剂、试液及培养基3.1消毒液、稀释剂及试液。3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液：供洗手、擦拭操作台面用。3.1.2 5%石碳酸溶液：配制后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用，抑或选用其她适当消毒液。3.1.375%乙醇溶液：配好后制乙醇棉球，供擦手、擦拭操作工具用。3.1.40.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121灭菌20分钟。3.1.5司盘-80、单硬脂酸甘油酯、吐温-80：供非水溶性供试品供试液制备用。3.1.6无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）：取氯化三苯四氮唑0.1g，加水使溶解成10 ml。3.1.7甲基红批示液：取甲基红0.1g，加入95%乙醇300ml，水适量，使溶解，再加水至500ml。3.1.8V-P试液：氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g，加水使溶解成100ml；-萘酚乙醇试液：取-萘酚6.0g，加无水乙醇使溶解成100ml。3.1.9革兰染色液：沙黄染液：取沙黄0.25g，加95%乙醇10ml，使完全溶解后，加水至100ml；结晶紫染液：取结晶紫1.0g，加95%乙醇20ml，使溶解，加1%草酸铵溶液80ml，混匀。静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存；碘试液：取碘化钾2.0g，加水35ml使溶解，加入碘片1.0g，使所有溶解后，加水稀释至300ml，置密标 题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页 第 4 页闭棕色瓶中储存。3.1.10中性红批示液：取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml，使溶解，再加水到100ml。变色范畴 pH6.88.0（红黄）。 3.1.11亚甲蓝批示液：取亚甲蓝0.5g，加水使溶解成100ml。3.1.12溴麝香草酚蓝批示液：取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。变色范畴 pH6.07.6（黄蓝）。3.1.13酸性品红批示液：以酸性品红0.5g，加水100ml使溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置2小时，滤过，即得。长处：无色，在倒管内初期发酵易观测，不易被还原。变色范畴 pH6.07.4（红黄）。3.1.14曙红钠批示液：取曙红钠2.0g，加水使溶解成100ml。3.1.15靛基质试液：取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。3.2培养基3.2.1培养基制备及储存3,2,1,1溶化：普通应放在玻璃器皿或搪瓷器内。加入纯化水，隔水加热以促其溶解，加热时应经常搅拌，防止焦结，待其溶解后补足水分。3.2.1.2在使用干燥培养基时，先将纯化水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中，静置1015 分钟，搅拌，振荡，或延长时间以增进溶解，普通不要加热，必要时加热，但时间不适当过长，温度不适当过高，避免某些营养成分被破坏。3.2.1.3校正酸碱度：培养基必要有恰当pH值。测定pH值是培养基配制过程中重要环节之一，干燥培养基普通已校正过pH值，用时也必要再验证。pH值测定期，普通用批示剂滴入培养基中观测其颜色变化，或用pH计校正，如与所需pH值不符，可用酸或碱液加以校正。普通用氢氧化钠校正弱碱性培养基，高压灭菌前培养基pH值高0.2左右，灭菌后基本适当。调节pH值后要加热过滤，使培养基澄清。3.2.2培养基分装：3.2.2.1液体、半固体培养基普通在高压灭菌前分装，约装试管容积1/3，在灭菌后还要加入成分液体、半固体培养基，灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。3.2.2.2固体培养基普通分装在250 ml、500 ml锥形瓶中，高压灭菌后依照需要分装平皿或试管。平皿：如倾注平皿，应在无菌室中放置34小时，如用塑料平皿须在35培养箱中倒置3060 分钟。水蒸气会自然蒸发。斜面：制备低层斜面分装于试管，约占容积1/5，灭菌后趁热斜放于细玻璃棒和木杆上，使成斜度，分装时注意管口和瓶塞上勿沾有培养基，避免污染。制备高层斜面分装于试管，约占试管容积1/3，灭菌后趁热放置成高层短斜面，待其凝固后应用。3.2.3培养基灭菌：培养基灭菌多采用高压蒸汽灭菌，各种培养基灭菌时间和压力，按其成分不同而定。普通培养基多采用121、103.42kPa灭菌 15 分钟，但容器和装量较大时，可延长至20 分钟。高压灭菌应严格按照操作规程进行，必要逐渐加热，彻底排除灭菌器内冷空气，再逐渐升压保持预定压力和时间，达到全杀灭微生物目。标 题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页 第 5 页3.2.4培养基储存：保存培养基时间需视培养基中水分蒸发限度及有无污染而定，已制备好培养基要保存于冷暗处或冰箱中，但由于各种培养基性质不同，不也许固定一种保存期限。制备好平板或试管培养基，为防止水分蒸发，应置于塑料袋内，4保存，可延长有效期限。微量生化反映管熔封于细玻管内，室温下可保存1年左右。3.3注意事项：3.3.1采用干燥培养基时，按阐明配制，应对灭菌后培养基pH值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以拟定配制时琼脂用量。试剂规格规定应为化学纯（CP）以上规格，其中不能具有对细菌、霉菌、大肠杆菌生长有害抑制物。3.3.2配制培养基不应当有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，并应于2小时内灭菌，避免细菌繁殖。3.3.3培养基分装量不得超过容器2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必要塞紧，以免松动或脱落导致染菌。3.3.4配制培养基pH值测定期，其波动范畴应在规定pH0.2之内，还需注意高压灭菌后pH值变化。3.3.5每批培养基均应有配制记录，涉及名称、配制量（各种成分用量）、配制者、校对者、配制日期以及性能和无菌实验。3.3.6每批培养基在用于样品分离鉴定之前均应作性能实验，以保证微生物检查质量。性能实验须用已知原则菌株进行预试，符合规定方可应用。3.3.7棉塞以普通棉花制作，棉塞松紧应适当，过松易污染杂菌，过紧影响透气性；每次用后需高压灭菌并随后烘干，要防尘、防霉；变硬无弹力时需更换。3.3.8各种试管应先配上适当棉塞，待高压灭菌后再分装培养基，可防止污染。3.3.9培养基配制时，应先将有沉淀物原料如蛋白胨、牛肉膏、盐类和琼脂配好，经调节pH值、加热并煮沸溶化后再滤清；滤清时注意趁热过滤，滤除异物、沉淀后，应将蒸发失去溶液量按原溶液量加纯化水补足。3.3.10应严格遵守各种培养基规定灭菌温度和时间，灭菌后培养基不得有混浊现象，每瓶配制并灭菌后培养基、稀释剂均应在外表清晰标明灭菌日期。3.3.11每批稀释剂、培养基均应有空白实验，合格后方能使用。3.3.12灭菌后培养基在冷暗处保存，放置时间不能过长，普通在两周内用完。久存培养基失水过多、固体干涸变形、液体浮现沉淀、棉塞松弛或脱落者均不得使用。已熔化培养基应一次用完，启动后不适当再用。3.3.13勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏，应用水浴或微波炉加热。4. 检查总则（1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）4.1微生物计数法合用范畴：系用于能在有氧条件下生长嗜温细菌和真菌计数。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等与否符合相应微生物限度原则时，应按下述规定进行检查，涉及样品取样量和成果判断等。除另有规定外，本法不合用于活菌制剂检査。如供试品有抗菌活性，应尽量去除或中和。供试品检査时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂相容性。标 题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页 第 6 页4.2微生物计数法4.2.1 合用性实验用菌株(表1)实验菌株实验菌液制备计数培养基合用性检查计数办法合用性实验需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数金黄色葡萄球菌( Staphylococcus a u reus) C C M C C (B )26 003胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3 0 3 5 C ，培养时间1824小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35培养时间不超过3 天，接种量不不不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（M P N 法），培养温度30-35，培养时间不超过3 天，接种量不不不大于100cfu铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCMCC ( B )10 104胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35，培养时间1824小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35培养时间不超过3天，接种量不不不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（M P N 法），培养温度30-35，培养时间不超过 3天，接种量不不不大于100cfu枯草芽孢杆菌.Bacillus subtilis)CMCC(B)63 501胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35培养时间18-24小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35培养时间不超过3天，接种量不不不大于lOOcfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（M P N 法），培养温度30-35，培养时间不超过3天，接种量不不不大于lOOcfu白色念珠菌(Candida albicans)CCMCC(F)98 001沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20-25培养时间2-3天胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30-35培养时间不超过5 天，接种量不不不大于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20-25培养时间不超过5 天，接种量不不不大于lOOcfu胰酪大豆胨琼脂培养基（M P N 法不合用）培养温度3 0 3 5 C，培养时间不超过5 天，接种量不不不大于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20-25培养时间不超过5 天，接种量不不不大于lOOcfu标 题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页 第 7 页黑曲霉（Asper君山wsniger) C C M C C (F )98 003沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度20-25培养时间57 天，或直到获得丰富孢子胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30-35培养时间不超过5 天，接种量不不不大于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20-25培养时间不超过5天，接种量不不不大于lOOcfu胰酪大豆胨琼脂培养基（M P N 法不合用）培养温度30-35培养时间不超过5 天，接种量不不不大于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20-25培养时间不超过5天，接种量不不不大于lOOcfu注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基合用性检查，检査办法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。4.2.2 计数办法：涉及平皿法、薄膜过滤法和最也许数法（Most-Probable-Number Method，简称 MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精准度较差，但对于某些微生物污染量很小供试品，M P N法也许是更适合办法。供试品检查时，应依照供试品理化特性和微生物限度原则等因素选取计数办法，检测样品量应能保证所获得实验成果可以判断供试品与否符合规定。所选办法合用性须经确认。计数培养基合用性检査和供试品计数办法合用性实验供试品微生物计数中所使用培养基应进行合用性检查。供试品微生物计数办法应进行办法合用性实验，以确认所采用办法适合于该产品微生物计数。若检查程序或产品发生变化也许影响检查成果时，计数办法应重新进行合用性实验。4.2.3 菌种及菌液制备4.2.3.1菌种实验用菌株传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得干燥菌种为第0 代），并采用适当菌种保藏技术进行保存，以保证明验菌株生物学特性。4.2.3.2计数培养基合用性检查和计数办法合用性实验用菌株见（表1）。菌液制备按(表1)规定程序培养各实验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适当浓度菌悬液；取黑曲霉新鲜培养物加人35ml含0. 05% (m l/m l)聚山梨酯8 0pH7_0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适当办法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适当浓度黑曲霉孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在28，可在2 4小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28 ,在验证过贮存期内使用。4.2.4阴性对照为确认实验条件与否符合规定，应进行阴性对照实验，阴性对照实验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。4.2.5培养基合用性检査微生物计数用成品培养基、由脱水培养基或按处方配制培养基均应进行培养基合用性检查。按(表1) 规定，接种不不不大于lOOcfu菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1 规定条件下培养。每一实验标 题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页 第 8 页菌株平行制备2 管或2 个平皿。同步，用相应对照培养基代替被检培养基进行上述实验。被检固体培养基上菌落平均数与对照培养基上菌落平均数比值应在0.52 范畴内，且菌落形态大小应与对照培养基上菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，实验菌应生长良好。4.3计数办法合用性实验4.3.1供试液制备依照供试品理化特性与生物学特性，采用适当办法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均勻加热，且温度不应超过45。供试液从制备至加入检查用培养基，不得超过1 小时。惯用供试液制备办法如下（如果下列供试液制备办法经确认均不合用，应建立其她适当办法）4.3.1.1水溶性供试品取供试品，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7. 2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1 ：1 0供试液。若需要，调节供试液p H值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步1 0倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合供试品原液作为供试液。4.3.1.2水不溶性非油脂类供试品取供试品，用pH7. 0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7. 2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1 ：1 0供试液。分散力较差供试品，可在稀释液中加人表面活性剂如0.1 %聚山梨酯80,使供试品分散均匀。若需要，调节供试液p H 值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步1 0倍系列稀释。4.3.1.3油脂类供试品取供试品，加人无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与至少量并能使供试品乳化无菌聚山梨酯8 0或其她无抑菌性无菌表面活性剂充分混勻。表面活性剂温度普通不超过4 0 t：(特殊状况下，最多不超过45C) ，小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加人预热稀释液使成1 ：1 0 供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂稀释液进一步10倍系列稀释。4.3.1.4需用特殊办法制备供试液供试品膜剂供试品取供试品，剪碎，加P H 7 .0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或P H 7 .2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡，振摇，制成1 ：1 0供试液。若需要，调节供试液p H 值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品，加人P H 6 .8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或PH7. 6 无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂），置45水浴中，振摇，使溶解，制成1:10 供试液。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。4.3.1.5气雾剂、喷雾剂供试品取供试品，置一20C或其她适当温度冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品启动部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓所有释出。供试品亦可采用其她适当办法取出。用无菌注射器从每一容器中吸出药液于无菌容器中混合，然后取样检査。4.3.1.6贴剂供试品取供试品，去掉防粘层，将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上，在粘贴面上覆盖一层适当无菌多孔材料(如无菌纱布），避免贴膏剂粘贴在一起。将解决后贴膏剂放入盛有适当体积并具有表面活性剂（如聚山梨酯8 0或卵磷脂）稀释液容器中，振荡至少3 0分钟。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。标 题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页 第 9 页4.3.2. 接种和稀释 按下列规定进行供试液接种和稀释，制备微生物回收实验用供试液。所加菌液体积应不超过供试液体积1%。为确认供试品中微生物能被充分检出，一方面应选取最低稀释级供试液进行计数办法合用性实验。4.3.2.1实验组取上述制备好供试液，加入实验菌液，混勻，使每lm l供试液或每张滤膜所滤过供试液中含菌量不不不大于lOOcfu。4.3.2.2供试品对照组取制备好供试液，以稀释液代替菌液同实验组操作。4.3.2.3菌液对照组取不含中和剂及灭活剂相应稀释液代替供试液，按实验组操作加人实验菌液并进行微生物回收实验。4.3.2.4若因供试品抗菌活性或溶解性较差因素导致无法选取最低稀释级供试液进行办法合用性实验时，应采用适当办法对供试液进行进一步解决。如果供试品对微生物生长抑制作用无法以其她办法消除，供试液可通过中和、稀释或薄膜过滤解决后再加人实验菌悬液进行办法合用性实验。4.4抗菌活性去除或灭活供试液接种后，按下列“微生物回收” 规定办法进行微生物计数。若实验组菌落数减去供试品对照组菌落数值不大于菌液对照组菌落数值50% ,可采用下述办法消除供试品抑菌活性。4.4.1增长稀释液或培养基体积。4.4.2加入适当中和剂或灭活剂。中和剂或灭活剂（表2 )可用于消除干扰物抑菌活性，最佳在稀释液或培养基灭菌前加入。若使用中和剂或灭活剂，实验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量稀释液代替供试品同实验组操作，以确认其有效性和对微生物无毒性。中和剂或灭活剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数比值应在0 .52 范畴内。表2 常用干扰物中和剂或灭活办法干扰物可选用中和剂或灭活办法戊二醛、汞制剂酚类、乙醇、醛类、醛类季铵化合物、对羟基苯甲酸、双胍类化合物季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸水银水银、汞化物、醛类EDTA、唆喏酮类抗生素磺胺类内酰胺类抗生素亚硫酸氢钠吸附物稀释法甘氨酸卵磷脂聚山梨酯巯基醋酸盐硫代硫酸盐镁或钙离子对氨基苯甲酸内酰胺酶4.4.3采用薄膜过滤法4.4.4上述几种办法联合使用。若没有适当消除供试品抑菌活性办法，对特定实验菌回收失败，表白供试品对该实验菌具备较强抗菌活性，同步也表白供试品不易被该类微生物污染。但是，供试品也也许仅对特定实验菌株具备抑制作用，而对其她菌株没标 题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页 第 10 页有抑制作用。因而，依照供试品须符合微生物限度原则和菌数报告规则，在不影响检查成果判断前提下，应采用能使微生物生长更高稀释级供试液进行计数办法合用性实验。若办法合用性实验符合规定，应以该稀释级供试液作为最低稀释级供试液进行供试品检査。4.5供试品中微生物回收表1所列计数办法合用性实验用各实验菌应逐个进行微生物回收实验。微生物回收可采用平皿法、薄膜过滤法或M PN法。4.5.1平皿法平皿法涉及倾注法和涂布法。表1 中每株实验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数成果。倾注法：取照上述“ 供试液制备” “ 接种和稀释”和“抗菌活性去除或灭活” 制备供试液lml，置直径90mm无菌平皿中，注入1520ml温度不超过45熔化胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。若使用直径较大平皿，培养基用量应相应增长。按表1规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各实验组平均菌落数。涂布法：取1520ml温度不超过45胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注人直径90mm无菌平皿，凝固，制成平板，采用适当办法使培养基表面干燥。若使用直径较大平皿，培养基用量也应相应增长。每一平板表面接种上述照“供试液制备” “接种和稀释” 和“抗菌活性去除或灭活” 制备供试液不少于0.1ml。按表1规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各实验组平均菌落数。4.5.2薄膜过滤法薄膜过滤法所采用滤膜孔径应不不不大于0.45pm，直径普通为50mm，若采用其她直径滤膜，冲洗量应进行相应调节。供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物截留。滤器及滤膜使用前应采用适当办法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤先后完整性。水溶性供试液过滤前先将少量冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量普通为100ml。总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上微生物受损伤。取照上述“供试液制备” “ 接种和稀释” 和“抗菌活性去除或灭活” 制备供试液适量（普通取相称于lg 、lm l或10cm2供试品，若供试品中所含菌数较多时，供试液可酌情减量），加至适量稀释液中，混匀，过滤。用适量冲洗液冲洗滤膜。若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。按表1 规定条件培养、计数。每株实验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。4.5.3MPN法M P N法精密度和精确度不及薄膜过滤法和平皿计数法，仅在供试品需氧菌总数没有适当计数办法状况下使用，本法不合用于霉菌计数。若使用M P N法，按下列环节进行。取照上述“供试液制备” “ 接种和稀释” 和“ 抗菌活性去除或灭活” 制备供试液至少3 个持续稀释级，每一稀释级取3 份lm l分别接种至3 管装有910ml胰酪大豆胨液体培养基中，同法测定菌液对照组菌数。必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。接种管置3035C培养3 天，逐日观测各管微生物生长状况。如果由于供试品因素使得成果难以判断，可将该管培养物转种至胰标 题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页 第 11 页酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基，在相似条件下培养12 天，观测与否有微生物生长。依照微生物生长管数从表3 查被测供试品每l g 或每lm l中需氧菌总数最也许数。表3 微生物最也许数检索表生长管数需氧菌总数最也许数95%置信限每管含样品g 或m l数M P N /g 或 m l下限上限0. 10. 010.0010001100注：表内所列检查量如改用l g (或m l )、0. l g ( 或m l )和O.Olg(或m l )时，表内数字应相应减少1 0 倍；如改用O .O lg ( 或m l)、O.OOlg( 或m l )和O.OOOlg( 或m l )时，表内数字应相应增长1 0 倍，别的类推。5. 微生物计数法检查5.1计数办法合用性实验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，实验组菌落数减去供试品对照组菌落数值与菌液对照组菌落数比值应在0 .52 范畴内；采用M P N法时，实验组菌数应在菌液对照组菌数95%置信限内。若各实验菌回收实验均符合规定，照所用供试液制备办法及计数办法进行该供试品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。办法合用性确认时，若采用上述办法还存在一株或多株实验菌回收达不到规定，那么选取回收最接近规定办法和实验条件进行供试品检査。5.2供试品检查5.2.1检查量：检查量即一次实验所用供试品量(g、m l或cm2) 。普通应随机抽取不少于2 个最小包装供试品，混合，取规定量供试品进行检查。除另有规定外，普通供试品检查量为10g或10ml;膜剂为100cm2；贵重药物、微量包装药物检查量可以酌减。检查时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4 丸，膜剂还不得少于4 片。5.2.2供试品检査按计数办法合用性实验确认计数办法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数测定。胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数阴性对照实验以稀释液代替供试液进行阴性对照实验，阴性对照实验应无菌生长，如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调査。5.3平皿法平皿法涉及倾注法和涂布法。除另有规定外，取规定量供试品，按办法合用性实验确认办法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2 个平板。培养和计数除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在3035C培养35 天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在2025C培养57 天，观测菌落生长状况，点计平板上生长所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片平板不适当计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板菌落数平均值不不大于15，则两个平板菌落数不能相差1 倍或以上。菌数报告规则需氧菌总数标 题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页 第 13 页测定宜选用平均菌落数不大于300cfu稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选用平均菌落数不大于lOO