百合植物组织培养脱毒技术研究进展_柳玉晶.pdf

百合植物组织培养脱毒技术研究进展柳玉晶（辽宁农业职业技术学院，辽宁营口115009）摘要：百合是花卉市场上常见的花卉品种，应用于切花装饰、花坛、花境等，但由于长期田间无性繁殖，致使积累病毒，品种退化，品质下降，百合组培脱毒成为百合种球商品化生产的关键技术。本研究系统阐述了常见百合的病毒种类及发病症状、目前我国常采用的组培脱毒技术及未来发展趋势，旨在为百合种球的脱毒工厂化生产提供技术支持。关键词：百合；组织培养；病毒；脱毒技术下感染 23 个月后，植株叶片出现扭曲和白色条纹。如果与其他病毒复合感染，会出现明显症状，当与黄瓜花叶病毒同时感染时，百合叶片有坏死斑发生3。1.2黄瓜花叶病毒黄瓜花叶病毒（CMV）属于雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属，为正义单链 RNA病毒。病毒粒子为球状，直径为 2830nm。黄瓜花叶病毒寄主广泛，为害严重，是当前影响力较大的植物病毒之一，可致使多种植物感病，是世界公认的重要植物病害4。在自然界中，黄瓜花叶病毒通过棉蚜、桃蚜等非持久性传播，感染后引起百合花叶病，症状表现为花叶、斑驳，扭曲，最后变褐。轻症植株可开花，但花畸形、花瓣开裂；重症植株不开花，植株矮化，鳞片变短3。1.3郁金香碎色病毒郁金香碎色病毒（TBV）属于马铃薯 Y病毒科马铃薯 Y 病毒属，电镜下病毒粒体呈弯丝状，长约 750nm。该病毒寄主仅限百合科植物，如各品种百合、郁金香等。在自然界中，郁金香碎色病毒通过蚜虫、汁液非持久性传播，桃蚜传播速度最快，其次是棉蚜、大戟长管蚜、无网长管蚜等。感病的百合植株会有碎锦病发生，地下鳞茎有褐环斑发生3。1.4百合斑驳病毒百合斑驳病毒（LMoV）属于马铃薯 Y 病毒属，是感染百合的主要病毒之一。电镜下病毒粒体呈现线条状，长 750775nm，直径为 1416nm。在自然界中，百合斑驳病毒主要通过汁液、蚜虫传播。感病的百合植株呈现条斑褪绿，有时表现出叶畸形、褪色或坏死斑5。1.5百合丛簇病毒百合丛簇病毒（LRV）的病毒粒体有 2 种形态：一种为长条状，一种为杆状，长短不一。寄主仅限百合，该病毒通过棉蚜持久性传播，种球贮藏期间也可传播，土壤不传播3。染病百合植株呈丛簇状，叶片呈浅绿色或浅黄色，出现条斑或斑驳。幼叶染病向下反卷、扭曲，全株矮化。2组培脱毒技术百合植物组织培养脱毒技术研究最早报道为百合（Liliumspp.）是单子叶植物亚纲百合科（Lili-aceae）百合属（Lilium）多年生球根花卉，是国际上十分畅销的花卉之一。百合地下鳞茎是由多枚鳞片着生鳞茎盘上合抱生长，百合的花语为纯洁、忠贞、高雅、神圣，是人们特别钟爱的吉祥花卉，也是世界上花卉市场长期走俏、历久不衰的花卉产品。百合适应性强，应用性广，可在园林中作花坛、花境，也可作盆栽和切花观赏。近年来，我国百合栽培面积不断扩大，为保持其后代遗传性状一致，百合生产上主要采用扦插法、分球法进行种球扩繁，母体病毒通过鳞片等传播给后代仔球，多代的扦插、分球导致病毒积累，引发病毒病，影响开花质量。百合种球感染病毒后，其植株会终身带有病毒，破坏植株正常生理机能，严重影响百合花质量，体内病毒不能直接用化学药剂或生物制剂有效防治。因此，通过植物组织培养研究百合的脱毒技术，生产无病毒种苗，是当前百合种球商品化生产主要研究课题。1百合病毒种类目前已报道的侵染百合的病毒种类约有 18 种，其中百合无症病毒、黄瓜花叶病毒、郁金香碎锦病毒、百合斑驳病毒、百合丛簇病毒为主要为害病毒，还有南芥菜花叶病毒、烟草环斑病毒、百合丝状病毒、草莓浅隐环斑病毒、百合 X 病毒、蚕豆萎蔫病毒、水仙花叶病毒、烟草脆裂病毒等为害百合的种植和产业发展1。1.1百合无症病毒百合无症病毒（LSV）属于线形病毒科麝香石竹潜隐病毒属，是严重影响百合栽培的主要病毒，电镜下为细长弯曲的线状粒体，长度为 640nm，直径为1718nm2。自然界中，百合无症病毒通过桃蚜、百合西圆蚜及机械进行传播。百合无症病毒单独侵染百合时，一般无明显症状，只会导致鳞茎缩小，切花寿命变短。但有的品种有症状呈现，东方百合感病植物在 15以基金项目：2020 年辽宁省教育厅科学研究项目（LJKZ1217）；辽宁省“兴辽英才计划”项目（XLYC1906004）；2022 年院级自然科学课题（Lnz202214）。作者简介：柳玉晶（1980-），女，黑龙江人，讲师，研究方向：园林植物栽培与养护。试验研究现代园艺2023 年第 13 期輥輰訛DOI:10.14051/ki.xdyy.2023.13.050Philhps（1962 年）采用百合茎尖为外植体成功获得培养脱毒苗，随后多名学者相继也采用茎尖为外植体成功获得无病毒百合种苗。目前，多种脱毒方法在百合组培脱毒过程中得到应用，主要有茎尖培养脱毒、热处理脱毒、愈伤组组培养脱毒、化学处理脱毒、超低温处理脱毒等方法。2.1茎尖培养脱毒技术茎尖分生组织维管系统发育不完全、内源激素水平高、细胞代谢活性高，使茎尖生长点几乎不含或含病毒很少，因此，采用茎尖培养的方法可以脱除体内病毒，获得无病毒百合种苗。茎尖的大小对百合组培苗脱毒率的影响很大。孙明伟等6对不同大小的茎尖百合脱毒效果的影响研究表明，茎尖大小与百合脱毒率成反比例，茎尖越大，其脱毒率越低，当剥离的茎尖小于 0.4mm时，脱毒率达到 67%，而大于 1.0mm时，脱毒率只有 15%；同时茎尖大小也影响成活率，茎尖小于0.4mm 时，成活率仅为 30%，茎尖大于 1.0mm 时，其成活率可达到 98%。周晓波等7研究表明，不同茎尖大小外植体对成苗率和脱毒率影响较大，茎尖大小为0.1mm时，成苗率最低，仅为 22%，但脱毒率最高，可达100%；茎尖大小为 0.2mm时，成苗率为 58%，脱毒率为79.3%，茎尖大小为 0.3mm 时再生苗率较高，茎尖为0.40.5mm时成苗率达到 94%，但脱毒率只有 20%。王茯苓8进行了龙牙百合茎尖脱毒培养研究，结果表明，将茎尖大小控制在 0.20.5mm之间，可以成功地脱除龙牙百合植株中的黄瓜花叶病毒。可见，适宜的茎尖大小对于百合脱毒培养获得成功至关重要。钟海丰等9认为，茎尖培养在东方百合组培快繁脱毒中是较好的脱毒方法。2.2热处理与茎尖培养结合脱毒技术茎尖培养脱毒方法虽然脱毒率较高，能在短时间内获得较多的无毒原种繁殖母体，但是将热处理与茎尖培养 2 种方法相结合来进行脱毒快繁，会大大提高脱毒率。热处理脱毒的原理是因为病毒是蛋白质组成的，蛋白质在高温下会变性，利用病毒和植物细胞对温度忍耐力不同，使植物体内的病毒钝化，又不伤害或者轻微伤害植物细胞，达到控制病毒扩散和抑制病毒增殖目的；同时较高温度会使植物生理活动加剧，细胞分裂加快，病毒增殖速度慢于植物细胞分裂速度，使生长点位置不含有病毒，再进行分生组织培养获得无病毒苗木。周晓波等7研究卷丹百合脱毒快繁表明，当茎尖大小为 0.2mm 时，成苗率为 58%，脱毒率仅为 79.3%，但剥取茎尖的珠芽在 36恒温培养箱中进行 10d 预处理后进行茎尖培养，可使脱毒率达到 100%。热处理脱毒法影响因素为处理温度和时间，处理温度的高低和处理时间的长短都会影响脱毒效果，随着处理温度升高，处理时间延长，脱毒率会提高，但是外植体的存活率会降低。周晓波等10以感染 CMV、LSV和 LRV病毒的卷丹百合珠芽为试材进行脱毒试验，对于 LSV，经过 38热处理 20d 后，剥取 0.10.3mm 茎尖培养，脱毒效果最佳，脱毒率可达 90%以上，但延长热处理时间 30d 时，脱毒效率反而略微下降，外植体的存活率明显下降，低至 20%。在生产实践中，考虑到植物的耐受力受温度及持续时间的影响，当对百合试验材料处理温度较高时，则需要缩短处理时间，降低高温对试验材料的损伤；反之，当温度较低时，可适当延长处理时间，达到使病毒钝化的效果。罗丽萍等11以龙牙百合小鳞茎为试验材料进行热处理与茎尖培养结合脱毒研究表明，以白天4042、夜晚 3537交替热处理 60d，剥取茎尖大小为 0.20.3mm时脱毒效果最好，成活率高。田山君等 1 2 以贵州铜仁的卷丹百合鳞茎为外植体，经 26和45交替热处理 1 个月，然后剥取 0.20.8mm茎尖进行培养，抽取 2 个样品进行检测，2 号样品未观测到病毒颗粒，1 号样品在 5 万倍平均每视野 15 个病毒粒体，脱毒率为 50%。高慧卿等13采用东方百合 Tiber初代培养获得的组培苗，先经 65高温预处理 30min后，再进行茎尖脱毒，脱毒效果优于茎尖直接培养脱毒。也有学者采取先剥取茎尖进行培养获得组培苗，再对组培苗进行高温培养，从而达到脱毒的效果。热处理+茎尖培养相结合的脱毒技术可以有效提高脱毒效果，是因为在热处理过程中高温使病毒钝化、增殖和扩散速度减慢，使植物生长点无病毒区域增大，便于切取较大的茎尖进行培养，提高了外植体的成活率，更适合工厂化脱毒种球的生产。2.3热处理+茎尖培养+化学处理综合脱毒技术化学处理脱毒是在培养基中添加抗病毒药剂来抑制病毒的表达，从而使再生组培苗脱去病毒。目前化学处理脱毒常用的药剂有病毒唑、放线菌素 D、碱性孔雀绿、5-二氢尿嘧啶（DHT）等。化学处理法常与茎尖培养结合应用，可有效提高组培苗脱毒率和成活率。周晓波等10将试验百合珠芽 38高温条件下热处理 20d 后，剥取 0.40.6mm大小的茎尖为外植体，培养基中添加 510mg/L 病毒唑，诱导培养后，再生组培苗脱毒率在 90%以上。龙世平等14把经过热处理的百合小苗在解剖镜下剥取 0.50.8mm的茎尖生长点，接种到含有病毒唑 46mg/L 的愈伤组织诱导培养基上，在2530下暗培养 23 个月，诱导形成愈伤组织，脱毒效果较好。马平霞15将 23cm的西伯利亚百合组培苗置于 38光照 16h 和 25黑暗 8h 的人工培养箱中热处理 42d 后，切取茎尖大小 0.30.5mm，接种于添加5mg/L病毒唑的诱导培养基上，组培苗 CMV 脱毒率达2023 年第 13 期现代园艺试验研究輥輱訛（上接第 11 页）参考文献：1涂张焕,丰文庆,徐唐奇.土壤板结原因分析及其对作物吸水性的影响研究J.陕西农业科学,2020,66(12):71-73.2张文昭,孙祝兴.氧肥-过氧化钙的合成及其应用J.江苏化工,1996(2):443姜莹.土壤微生物多样性及发展前景J.黑龙江农业科学,2010,(7):174-1754张咏梅,周国逸,吴宁.土壤酶学的研究进展J.热带亚热带植物学报,2004,12,（1）:83-90.5李春楠,崔海瑞,王伟博.用 SRAP 标记研究根际土壤微生物的遗传多样性J.生物多样性,2011,19(4):485-4936刘涛,刁治民,祁永青,等.根际微生物及对植物生长效应的初步研究J.青海草业,2008,(17):41-47到 70%，成活率达到 66.7%。郑丽娜等16采用热处理+病毒唑处理+茎尖培养结合方法进行百合脱毒，结果表明，最佳组合为 38光照 16h 和 25黑暗 8h 热空气处理 15d、茎 尖 大 小 0.81.2mm、病 毒 唑 浓 度6mg/mL，组培苗脱毒率为 80%，成活率 79%。王超等17在对百合组培脱毒方法比较发现，2 种或 3 种脱毒方法结合，可以有效提高成苗率和脱毒率，5 个供试百合品种成活率均高于 85%，脱毒率均高于 70%。多名学者试验结果表明，热处理+茎尖培养+化学处理综合脱毒技术是对单一脱毒方法的创新，植物材料经过热处理后，可以采用更低浓度的病毒唑结合较大的茎尖大小，达到脱去百合病毒的目的。2.4超低温处理法超低温处理法是将植物材料采取一定的技术，置于极低温度条件下（通常用液氮，-196）长期保存，需要时再通过一定技术手段使其恢复到常温并能够正常生长的技术手段。超低温脱毒技术是在超低温保存技术的基础上建立起来的一种新型生物脱毒技术。Brison et al.（1997）首次以李砧木 Fereley-Jaspi（R）组培苗为试验材料，剥取茎尖进行玻璃化超低温冷冻处理后，再生苗得到 50%的脱毒率，超低温脱毒技术相继在多种植物的脱毒上应用。国内关于百合超低温处理法首次报道是张玉芹18应用玻璃化法对百合茎尖进行超低温保存试验，探索影响百合茎尖成活率的因素，得出茎尖大小以 23mm 为最佳。靳慧洁19以索邦百合、西伯利亚百合组培苗为材料，采用玻璃化超低温处理法对其所携带的 LSV、LMoV 进行脱毒，超低温处理的茎尖大小为 0.50.8mm，获得索邦 43.33%、西伯利亚40%的脱毒率，成活率皆为 50%。潘辰20以感染 CMV的 3 个品种百合采用玻璃化超低温处理茎尖，再生苗脱毒率初步检测最高为 85%，最低为 73%，均高于靳慧洁19试验结果。3展望百合花为花卉市场上的佼佼者，是大众喜爱的花卉，随着年销量不断上升，百合花的产量和品质也成为市场的关注点，但由于长时间的田间无性繁殖导致病毒积累、品质下降，这使得百合组培脱毒技术成为获得百合原种的关键技术。从国内 10 多年来百合植物组织培养脱毒技术研究综述来看，我国的百合植物组织培养脱毒技术还未形成成熟的标准化生产规程，一直处于科学研究阶段，试验成果未在百合种球生产中得到广泛推广与应用。国内的百合组培脱毒研究学者单方面针对科学研究，没有及时将科研成果转化为生产力，企业又苦于没有新技术支持，无法进行百合脱毒种球的标准化、工厂化生产。关于百合植物组织培养脱毒技术研究来看，采用 2 种或 3 种脱毒方法相结合更为有效，脱毒率更高，获得脱毒原种苗数量更多，因此建议学者们选择行之有效的脱毒法进行百合种球脱毒生产，例如采用热处理+茎尖培养、超低温+茎尖培养、热处理+化学药剂+茎尖培养等方法。因此，当前亟待解决的是我国百合种球依赖进口的问题，促进科研成果转化，制定百合种球组培脱毒生产技术标准，实现常用百合品种种球生产国产化。（收稿：2022-09-09）参考文献：1源朝政,陈海霞,吕长平,等.百合病毒病检测技术研究进展J.湖南农业科学,2013,(09):77-80.2明艳林,郑国华,李燕,等.百合无症病毒的研究进展J.植物检疫,2005,19(1):42-45.3邱艳红,王超楠,朱水芳.黄瓜花叶病毒致病性研究进展J.生物技术通报,2017,33(09):10-16.4沈淑琳.百合病毒病及其检验J.植物检疫,1996(04):223-226.5郑丽娜.百合种球病毒检测与脱除技术研究D.北京:北京林业大学,2009.6孙明伟,赵统利,邵小斌,等.百合组培球茎尖剥取技术研究J.安徽农业科学,2015,43(23):17-18+58.7周晓波,吴艺飞,丁茁荑.卷丹百合脱毒快繁技术研究J.中国农学通报,2012,28(31):201-205.8王茯苓.龙牙百合茎尖脱毒技术体系的初步研究D.长沙:湖南农业大学,2020.9钟海丰,黄宇翔,邓朝生.东方百合快繁培养基优化与脱毒技术研究J.中国农学通报,2009,25(17):168-173.10周晓波,吴艺飞,丁茁荑.卷丹百合 3 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