酶的生产与分离纯化ppt课件.ppt

第二章第二章酶的生的生产与分离与分离纯化化第一第一节 酶的的发酵生酵生产第二第二节 酶的的纯化化第三第三节 酶纯度的度的评价价第四第四节 酶的的剂型与保存型与保存 1.第一第一节 酶的的发酵生酵生产p一、一、产酶菌株的菌株的获得得p二、二、酶生生产的的发酵技酵技术2.一、一、产酶菌株的菌株的获得得p1.产酶菌株菌株p用于用于发酵生酵生产的的细胞需具胞需具备条件：条件：p酶产量高。通量高。通过各种育种。各种育种。p容易培养和管理。培养条件易于容易培养和管理。培养条件易于实现和控制。和控制。p产酶稳定性好。不易退化。定性好。不易退化。p利于利于酶的分离的分离纯化。化。细胞及其他胞及其他杂质可分离。可分离。p安全可靠。使用的安全可靠。使用的细胞及其代胞及其代谢产物安全无毒。物安全无毒。3.产酶微生物微生物枯草芽枯草芽孢杆菌杆菌应用最广的用最广的产酶微生物微生物。-淀粉淀粉酶、蛋白蛋白酶、-葡聚糖葡聚糖酶、碱性磷酸、碱性磷酸酶等。等。大大肠杆菌杆菌一般都属于胞内一般都属于胞内酶。谷氨酸脱。谷氨酸脱羧酶、用于、用于测定谷氨酸含量定谷氨酸含量；-半乳糖苷半乳糖苷酶，用于分解乳糖等。，用于分解乳糖等。黑曲霉黑曲霉糖化糖化酶、-淀粉淀粉酶、酸性蛋白、酸性蛋白酶、果胶、果胶酶、葡萄糖氧化、葡萄糖氧化酶、过氧化氧化氢酶、核糖核酸、核糖核酸酶、脂肪脂肪酶、纤维素素酶、橙皮苷、橙皮苷酶、柚柑、柚柑酶等。等。米曲霉米曲霉糖化糖化酶、蛋白、蛋白酶酿酒；生酒；生产氨基氨基酰化化酶、磷酸二、磷酸二酯酶、核酸、核酸酶P2、果胶、果胶酶等。等。青霉青霉产黄青霉用于生黄青霉用于生产葡聚糖氧化葡聚糖氧化酶、果胶、果胶酶、纤维素素酶CX等；橘青霉用于生等；橘青霉用于生产5-磷酸二磷酸二酯酶、脂肪、脂肪酶、葡萄糖氧化葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白凝乳蛋白酶等。等。木霉木霉是生是生产纤维素素酶的重要菌株。有的重要菌株。有纤维素素C1酶、CX酶和和纤维素二糖素二糖酶等。木霉中含有等。木霉中含有较强的的17-羟化化酶，用于甾体，用于甾体转化。化。根霉根霉糖化糖化酶、-淀粉淀粉酶、转化化酶、酸性蛋白酸性蛋白酶、核糖核酸、核糖核酸酶、脂肪、脂肪酶、果胶、果胶酶、纤维素素酶、半、半纤维素素酶等。等。毛毛酶蛋白蛋白酶、糖化、糖化酶、-淀粉淀粉酶、脂肪、脂肪酶、果胶、果胶酶、凝乳、凝乳酶等。等。链霉菌霉菌纤维素素酶、碱性蛋白、碱性蛋白酶、中性蛋白、中性蛋白酶、几丁几丁质酶等。等。17-羟化化酶，用于甾体，用于甾体转化。化。啤酒酵母啤酒酵母啤酒、酒精、啤酒、酒精、饮料酒和面包制作。生料酒和面包制作。生产转化化酶、丙丙酮酸脱酸脱羧酶、醇脱、醇脱氢酶等。等。假假丝酵母酵母脂肪脂肪酶、尿酸尿酸酶、尿囊素、尿囊素酶、转化化酶、醇脱、醇脱氢酶等。等。17-羟化化酶，用于甾体，用于甾体转化。化。4.一、一、产酶菌株的菌株的获得得p2.产酶菌株的菌株的选育育p微生物微生物发酵的酵的优点点（1）种）种类多，并可根据需求多，并可根据需求筛选最佳的最佳的产酶菌株；菌株；（2）繁殖快，利于生）繁殖快，利于生产进行；行；（3）培养易，生）培养易，生产成本成本经济；（4）可操控，）可操控，连续化、自化、自动化降低生化降低生产成本；成本；（5）能改良，微生物具有很）能改良，微生物具有很强的适宜能力，可通的适宜能力，可通过遗传变异手段培育异手段培育新的、更好的菌株，增加新的、更好的菌株，增加产品开品开发；微生物微生物育种的方法育种的方法诱变育种育种杂交育种交育种原生原生质体融合体融合基因工程育种基因工程育种5.二、二、酶生生产的的发酵技酵技术p工工艺流程流程保藏保藏细胞胞固定化原固定化原生生质体体细胞活化胞活化培养基培养基发酵酵无菌空气无菌空气预培养培养原生原生质体体细胞胞扩大培养大培养固定化固定化细胞胞分离分离纯化化酶6.二、二、酶生生产的的发酵技酵技术p1.培养基制培养基制备p碳源碳源p氮源氮源p无机无机盐p生生长因子因子p微量元素微量元素p生生产培养基与菌种培养基有很大区培养基与菌种培养基有很大区别。7.（1）工）工业上常用的碳源上常用的碳源8.（2）有机氮源）有机氮源p来源：来源：工工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生花生饼p 粉、黄豆粉、黄豆饼粉、棉子粉、棉子饼粉、玉米粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋、玉米蛋白粉、蛋p 白白胨、酵母粉、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、粉、蚕蛹粉、尿素、废菌菌丝体和酒体和酒p 糟。糟。p成分复成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机提供大量的无机p 盐及生及生长因子。因子。p例例 玉米玉米浆：可溶性蛋白、生可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸因子（生物素）、苯乙酸p 较多的乳酸多的乳酸p 硫、磷、等微量元素等硫、磷、等微量元素等9.工工业上常用的氮源及含氮量（上常用的氮源及含氮量（质量分数）量分数）%氮源含氮量氮源含氮量大麦1.52.0花生粉8.0甜菜1.52.0燕麦粉1.52.0甘蔗糖蜜1.52.0大豆粉8.0玉米浆4.5乳清粉4.510.（3）无机）无机盐及微量元素及微量元素p大量元素：大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe等。等。p （微生物生（微生物生长所需所需浓度在度在10-310-4mol/L）p微量元素：微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等。等。p （微生物生（微生物生长所需所需浓度在度在10-610-8mol/L）p一般微生物生一般微生物生长所需要的无机所需要的无机盐有：硫酸有：硫酸盐、磷酸、磷酸盐、氯化物以及含化物以及含有有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。等金属元素的化合物。p以上物以上物质作作为其生理活性物其生理活性物质的的组成和生理活性作用的成和生理活性作用的调节物。物。11.（4）生）生长因子因子p从广从广义上上讲，凡是微生物生，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物不可缺少的微量的有机物质，如如氨基酸、氨基酸、嘌呤、呤、嘧啶、维生素生素等均称等均称生生长因子因子。p功能：功能：构成构成细胞的胞的组成分，促成分，促进生命活生命活动的的进行。行。p 生生长因子不是所有微生物都必需的，因子不是所有微生物都必需的，对于于营养缺陷养缺陷p 型才是必不可少的。型才是必不可少的。p有机氮源是有机氮源是这些生些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的多的B族族维生素和微量元素及一些微生物生生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少不可缺少的生的生长因子因子.12.B1核黄素B6CoA13.二、二、酶生生产的的发酵技酵技术p2.细胞活化与胞活化与扩大培养大培养斜面菌种培养斜面菌种培养摇瓶或茄子瓶培养瓶或茄子瓶培养一一级种子的培养种子的培养二二级种子的培养种子的培养 发酵罐培养酵罐培养 14.15.二、二、酶生生产的的发酵技酵技术p3.发酵工酵工艺调节ppH调节p首先需要考首先需要考虑和和试验发酵培养基的基酵培养基的基础配方，使它配方，使它们有个有个适当的配比，使适当的配比，使发酵酵过程中的程中的pH值变化在合适的范化在合适的范围内。内。p（1）调节好基好基础料的料的pH。p基基础料中若含有玉米料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必呈酸性，必须调节pH。若要。若要控制消后控制消后pH在在6.0，消前，消前pH往往要往往要调到到6.56.8。16.二、二、酶生生产的的发酵技酵技术p（2）在基）在基础料中加入料中加入维持持pH的物的物质。p如代如代谢产酸物酸物质：葡萄糖（：葡萄糖（产酮酸）、（酸）、（NH4)2SO4p 代代谢产碱物碱物质：NaNO3、尿素、尿素p 缓冲冲剂：CaCO3、磷酸、磷酸缓冲液等冲液等p生理酸、碱性物生理酸、碱性物质：p(NH4)2SO4 2NH3+2H2SO4 pNaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH 17.二、二、酶生生产的的发酵技酵技术p（3）、通）、通过补料料调节pHp在在发酵酵过程中根据糖、氮消耗需要程中根据糖、氮消耗需要进行行补料。在料。在补料与料与调pH没有矛没有矛盾盾时采用采用补料料调pHp如如 调节补糖速率；消泡糖速率；消泡剂(如豆油如豆油)的个的个别情况下，情况下，p 还可采用提高空气流量来加速脂肪酸的代可采用提高空气流量来加速脂肪酸的代谢，以，以p 调节pHp 当当NH2-N低，低，pH低低时补氨水；氨水；p 当当NH2-N低，低，pH高高时补(NH4)2SO4p 当当补料与料与调pH发生矛盾生矛盾时，加酸，加酸p 碱碱调pH 18.二、二、酶生生产的的发酵技酵技术p3.发酵工酵工艺调节p温度温度调节控制控制p温度温度对发酵的影响酵的影响p影响微生物的生影响微生物的生长p影响各种影响各种酶的反的反应速率速率p改改变菌体代菌体代谢的合成的方向的合成的方向p影响影响发酵液的物理性酵液的物理性质19.温度影响微生物的生温度影响微生物的生长20.温度影响反温度影响反应速率速率发酵酵过程的反程的反应速率速率实际是是酶反反应速率，速率，酶反反应有一个有一个最适温度。最适温度。阿累尼阿累尼乌斯方程式斯方程式 k-反反应速度常数，速度常数，1/s；A-阿累尼阿累尼乌斯常数，斯常数，1/s;R-气体常数（气体常数（1.987x4.187J/K mol);T-热力学温度，力学温度，K （0=273K);E-活化能，活化能，J/mol ;e-2.718 则：随着温度升高：随着温度升高酶反反应速度增加速度增加21.温度温度对合成的方向合成的方向的影响的影响例：四例：四环素素发酵中金色酵中金色链霉菌同霉菌同时能能产生金生金 霉素。霉素。n低于低于30 合成金霉素能力合成金霉素能力较强。n温度提高温度提高合成四合成四环素的比例也提高。素的比例也提高。n达到达到35则只只产生四生四环素而金霉素合成几乎停止。素而金霉素合成几乎停止。又如：赭曲霉又如：赭曲霉10 20 发酵酵时，有利于合成青霉素，有利于合成青霉素28 时，则有利于合成赭曲霉素。有利于合成赭曲霉素。22.温度温度对发酵液的物理性酵液的物理性质产生影响生影响影响影响发酵液的酵液的p黏度黏度p氧在氧在发酵液中的溶解度和酵液中的溶解度和传递速率速率p某些基某些基质的分解速率的分解速率进而影响而影响发酵酵动力学特征和力学特征和产物的生物合成物的生物合成23.发酵酵过程中最佳温度的程中最佳温度的选择p发酵前期：酵前期：由于菌量少，由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍稍 高的温度高的温度，促使菌的呼吸与代，促使菌的呼吸与代谢，使菌生，使菌生长迅速；迅速；p发酵中期：酵中期：菌量已达到合成菌量已达到合成产物的最适量，物的最适量，发酵需要延酵需要延长中期，从中期，从 而提高而提高产量，因此量，因此温度要稍低一些温度要稍低一些，可以推，可以推迟衰老。因衰老。因 为在稍低温度下氨基酸合成蛋白在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关和核酸的正常途径关 闭得比得比较严密有利于密有利于产物合成。物合成。p发酵后期：酵后期：产物合成能力降低，延物合成能力降低，延长发酵周期没有必要需提高温酵周期没有必要需提高温 度，刺激度，刺激产物合成到放罐。物合成到放罐。24.发酵酵热和温度的控制和温度的控制p发酵热pQ发酵酵=Q生物生物+Q搅拌拌 Q蒸蒸发 Q辐射射p产热因素：生物因素：生物热、搅拌拌热p散散热因素：蒸因素：蒸发热、辐射射热p温度的控制 通通过冷却将冷却将显热进行行热交交换，以保持最佳，以保持最佳发酵温度酵温度 发酵罐的冷却装置：酵罐的冷却装置：夹套（套（10M10M3 3以下以下）盘管（蛇管）管（蛇管）列管列管 喷淋淋冷媒：冷媒：冷水冷水 冷冷盐水水 氨氨建立冷建立冷冻站站25.二、二、酶生生产的的发酵技酵技术p3.发酵工酵工艺调节p溶解氧的溶解氧的调节控制控制p12,p16p微生物的需氧微生物的需氧p氧在水中的溶解度比葡萄糖要小氧在水中的溶解度比葡萄糖要小约6000倍左右倍左右(氧在水氧在水中的中的饱和度和度约为0.25mmol/L)。许多多发酵的生酵的生产能力能力受到氧利用限制，因此氧成受到氧利用限制，因此氧成为影响影响发酵效率的重要因素。酵效率的重要因素。26.描述微生物需氧的物理量描述微生物需氧的物理量p12pKO2好氧速率（好氧速率（摄氧率），氧率），单位位时间内内单位位 体体积的的发酵液所需要的氧量；酵液所需要的氧量；mmol O2/（Lh）。pQO2 细胞呼吸胞呼吸强度，度，单位重量位重量细胞在胞在单位位时间耗氧量；耗氧量；mmol O2/（g细胞胞h）。）。pC0 细胞胞浓度，度，单位体位体积培养液中培养液中细胞的量；胞的量；g细胞胞/L KO2=QO2.C0 27.28.临界界溶氧溶氧浓度度pCr:临界溶氧界溶氧浓度度,指不影响呼吸所允指不影响呼吸所允许的最低溶氧的最低溶氧浓度。度。CrQO2CL微微 生生 物物温度温度（C）临界氧界氧浓度度（mmol/L）固固 氮氮 菌菌300.018大大肠杆菌杆菌370.008酵酵 母母300.004产黄青霉黄青霉240.022p发酵液中有酵液中有0.22 mmol/L29.氧氧饱和度和度p定定义：氧氧饱和度和度发酵液中氧的酵液中氧的浓度度/临界溶氧溶度界溶氧溶度p对于微生物生于微生物生长，只要控制，只要控制发酵酵过程中氧程中氧饱和度和度1p问题：一般微生物的：一般微生物的临界溶氧界溶氧浓度很小，是不是度很小，是不是发酵酵过程中氧很容易程中氧很容易满足？足？p例：例：某微生物的某微生物的摄氧率氧率0.052 mmol/（LS），），p 发酵液中有酵液中有0.22 mmol/Lp 0.22/0.052=4.8秒秒p由于由于产物的形成和菌体最适的生物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一条件，常常不一样：p 头孢菌素菌素 卷卷须霉素霉素p生生长 5%(相相对于于饱和和浓度）度）13%p产物物 13%8%30.溶氧溶氧对发酵的影响酵的影响例：天冬例：天冬酰胺胺酶的的发酵酵p前期好气培养，后期前期好气培养，后期转为厌气培养。气培养。p时机：当溶氧机：当溶氧浓度降到度降到45%时，从好气，从好气转为厌气，气，酶活力可提高活力可提高6倍。倍。31.溶氧曲溶氧曲线谷氨酸谷氨酸p每种每种产物物发酵的溶氧酵的溶氧浓度度变化都有自己的化都有自己的规律律32.发酵酵过程中溶氧程中溶氧变化异常原因化异常原因p（1）污染好气性染好气性杂菌，大量溶氧被消耗，反之下降。菌，大量溶氧被消耗，反之下降。p（2）菌体代）菌体代谢发生异常，需氧要求增加。生异常，需氧要求增加。p（3）搅拌功率拌功率变小，小，搅拌速度拌速度变慢或停止。慢或停止。p（4）消泡）消泡剂加入加入过多、多、闷罐等。罐等。p污染烈性噬菌体：影响最染烈性噬菌体：影响最为明明显，生，生产菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，菌尚未裂解前，呼吸已受到抑制，溶氧上升，直到菌体破裂后，完全失去呼吸能力，溶氧直溶氧上升，直到菌体破裂后，完全失去呼吸能力，溶氧直线上升。上升。33.微生物需氧与供氧微生物需氧与供氧p需氧需氧pKO2好氧速率（好氧速率（摄氧率），氧率），单位位时间内内单位位 体体积的的发酵液所需要的氧量；酵液所需要的氧量；mmol O2/（Lh）。p供氧供氧pOTR=kLa(c-c)pkLa体体积溶氧系数，溶氧系数，单位：位：1/h;p或或kdp经验公式：公式：34.供氧的控制供氧的控制p16p16(1)改改变通气速率（增大通气量）通气速率（增大通气量）p氧氧传递系数系数kLa是随空气量是随空气量(空气的空气的线速率速率)的增加而增大的。在低通气量的增加而增大的。在低通气量的情况下，增大通气量的情况下，增大通气量对提高溶氧提高溶氧浓度有十分度有十分显著的效果。著的效果。p在空气流速已在空气流速已经十分大的情况下，再增加通气速率，作用便不明十分大的情况下，再增加通气速率，作用便不明显，反而，反而此此时会会产生某些副作用。比如：泡沫的形成、水分的蒸生某些副作用。比如：泡沫的形成、水分的蒸发、罐温的增加以、罐温的增加以及及杂菌几率增加等。菌几率增加等。(2)改改变搅拌速度拌速度p增大增大搅拌拌转速，可以增大（速，可以增大（PV），即），即搅拌功率，可以提高拌功率，可以提高kLa；当；当搅拌拌转速增加到一定程度速增加到一定程度时，将不会增加，若，将不会增加，若搅拌拌转速速过大，大，还会由于剪切力会由于剪切力作用，打碎菌体，促使菌体自溶，增加泡沫等。作用，打碎菌体，促使菌体自溶，增加泡沫等。35.(3)改改变气体气体组成中的氧分成中的氧分压p用通入用通入纯氧方法来改氧方法来改变空气中氧的含量，提高了空气中氧的含量，提高了C*值，因而提高了供氧能力。因而提高了供氧能力。p纯氧成本氧成本较高，但高，但对于某些于某些发酵需要酵需要时，如溶氧低于，如溶氧低于临界界值时，短，短时间内加入内加入纯氧是有效而可行的。但有可能造成氧是有效而可行的。但有可能造成细胞氧中毒。胞氧中毒。供氧的控制供氧的控制36.(4)改改变罐罐压p增增加加罐罐压实际上上就就是是改改变氧氧的的分分压pO2来来提提高高C*，从从而而提提高高供供氧氧能能力力，但此法并不十分有效。主要原因是：但此法并不十分有效。主要原因是：p提高罐提高罐压就要相就要相应的增加空气的增加空气压缩机的出口机的出口压 力，也就是增加了力，也就是增加了动力消耗。力消耗。p发酵罐的酵罐的强度也要相度也要相应增加增加p提高罐提高罐压后，后，产生的生的CO2溶解量也要增加，会溶解量也要增加，会 使培养液的使培养液的pH值发生生变化，化，这些些对菌体生菌体生产都都 极极为不利。不利。供氧的控制供氧的控制37.(5)改改变发酵液的理化性酵液的理化性质p在在发酵酵过程程中中,菌菌体体本本身身的的繁繁殖殖及及代代谢可可引引起起发酵酵液液性性质不不断断改改变,因因而而显著著地地影影响响到到氧氧的的溶溶解解速速率率，而而且且由由于于发酵酵液液中中菌菌丝浓度度所所引引起起的的表表观粘粘度度的的增增加加，可可使使通通气气速速率率下降。下降。p如果培养基性如果培养基性质为限制氧限制氧传递因素因素时，就根据具体情况，就根据具体情况对培养液的某一物理性培养液的某一物理性质所作改造，例如所作改造，例如补加无菌水，改加无菌水，改变培养基的成分等都可以改善通气效果，以适培养基的成分等都可以改善通气效果，以适应菌的正常生菌的正常生长。供氧的控制供氧的控制38.（6）加入加入传氧中氧中间介介质氧氧载体体p向向发酵酵液液中中加加入入少少量量的的水水不不溶溶性性另另一一相相，氧氧在在这一一液液相相中中具有比水中高得多的溶解度具有比水中高得多的溶解度.p如如常常用用的的正正十十二二烷，这类物物质又又称称氧氧载体体：作作为非非连续相相，在在搅拌拌的的气气液液体体系系中中被被分分散散成成比比气气泡泡小小得得多多的的微微滴滴，附附着着在在气气泡泡表表面面并并在在气气泡泡水水界界面面之之间形形成成一一层薄薄膜膜，使使氧氧气气通通过水水膜膜溶溶入入水水相相主主流流的的推推动力力（氧氧浓度度差差）增增大大，相相应提高了提高了传氧速率。氧速率。供氧的控制供氧的控制39.二、二、酶生生产的的发酵技酵技术p4.提高提高酶发酵酵产量的方法量的方法p（1）酶的合成的合成调节机制机制p诱导合成合成调节p酶合成的反合成的反馈阻遏阻遏p分解代分解代谢对酶合成的阻遏作用合成的阻遏作用p酶合成的合成的细胞膜通透性胞膜通透性调节p（2）通）通过育种提高育种提高酶产量量p自然自然选育育p诱变育种育种p基因重基因重组p（3）其他提高）其他提高酶产量的方法量的方法p改改变碳氮比碳氮比p添加添加产酶促促进剂p添加阻遏物添加阻遏物40.（1）酶的合成的合成调节机制机制p12p1)诱导合成合成调节p乳糖缺乏乳糖缺乏时p乳糖存在乳糖存在时 Z y aZ-半乳糖苷半乳糖苷酶 y-渗透渗透酶 a-转乙乙酰基基酶41.p1961年，法国科学家莫年，法国科学家莫诺（JLMonod，1910-1976）与雅可布）与雅可布（FJacob）发表表“蛋白蛋白质合成中的合成中的遗传调节机制机制”一文，提出操一文，提出操纵子学子学说，开，开创了基因了基因调控的研究。控的研究。p四年后的四年后的1965年，莫年，莫诺与雅可布即荣与雅可布即荣获诺贝尔生理学与医学生理学与医学奖。p 1969年，年，贝克克维斯（斯（JRBeckwith）从大）从大肠杆菌的杆菌的DNA中分离出中分离出乳糖操乳糖操纵子，完全子，完全证实了雅可布和莫了雅可布和莫诺的模型。的模型。42.乳糖操乳糖操纵子子对指指导酶生生产应用的用的实际意意义p采用采用现代代诱变技技术使使细胞中的胞中的调节基因基因发生突生突变，致使，致使调节基因不能基因不能转录翻翻译产生生阻遏蛋白阻遏蛋白，诱导酶变成成组成成酶，RNA聚合聚合酶便能起作用、操便能起作用、操纵子便能持久地开启，并子便能持久地开启，并连续产生生-半乳糖苷半乳糖苷酶。p另一种另一种组成突成突变体体为变异的异的操操纵基因，基因，它不易因阻遏蛋白它不易因阻遏蛋白的作用而失活，从而的作用而失活，从而导致操致操纵基因开放而基因开放而连续产生生酶。p在在诱导酶合成合成时加入加入诱导物物以利于以利于诱导酶的合成，食品的合成，食品工工业应用的用的酶包括淀粉包括淀粉酶、蛋白、蛋白酶、纤维素素酶、葡萄糖异、葡萄糖异构构酶、-半乳糖苷半乳糖苷酶等均属等均属诱导酶，根据上述原理，在，根据上述原理，在合成合成时最好的最好的诱导物物为该酶的的作用底物或其作用底物或其结构构类似物似物。43.结构构类似物似物p乳糖的乳糖的结构构类似物似物p1,6-半乳糖半乳糖p异丙基异丙基-D-硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTG）p甲基甲基-D-半乳糖等半乳糖等p如：如：葡萄糖异构葡萄糖异构酶（或称木糖异构（或称木糖异构酶），若在培养基中加入），若在培养基中加入0.02%木糖木糖能能诱导合成合成该酶。p实际生生产上，上，为降低成本也可采用廉价的降低成本也可采用廉价的玉米芯的降解玉米芯的降解产物物来代替。来代替。44.（1）酶的合成的合成调节机制机制p2）酶合成的反合成的反馈阻遏阻遏 是指是指酶作用的作用的终产物物对酶合成合成产生阻遏作用。生阻遏作用。p当有当有终产物或共阻遏物存在物或共阻遏物存在时，使它与立体阻遏物使它与立体阻遏物结合并与操合并与操纵基因基因结合，致使合，致使RNA聚合聚合酶停止停止作用，使操作用，使操纵基因关基因关闭，酶合成合成受阻。受阻。立体阻遏物RNA聚合酶共阻遏物RPODNASDNA45.反反馈阻遏机制阻遏机制实践意践意义p设法从培养基中除去法从培养基中除去终产物，以消除反物，以消除反馈阻遏。阻遏。p如如:生生产蛋白蛋白酶的枯草芽的枯草芽孢杆菌杆菌培养基培养基中含有氨基酸中含有氨基酸时产生很少量的生很少量的蛋白蛋白酶，除去氨基酸，便可大大提高蛋白，除去氨基酸，便可大大提高蛋白酶的的产量。量。p此外，限制培养基中此外，限制培养基中氨氨的含量或限制末端的含量或限制末端产物在物在细胞内的胞内的积累，也可累，也可增加增加酶的的产量。量。p向培养基中加入代向培养基中加入代谢途径的某个抑制因子切断代途径的某个抑制因子切断代谢途径通路。途径通路。p例：例：组氨酸氨酸对组氨酸合成途径中的氨酸合成途径中的10种种酶的生物合成均起反的生物合成均起反馈作用。作用。如果加入抑制物如果加入抑制物-噻唑丙氨酸，便能使丙氨酸，便能使酶合成合成产量提高量提高30倍。倍。46.（1）酶的合成的合成调节机制机制3）分解代）分解代谢对酶合成的阻遏作用（中合成的阻遏作用（中间产物阻遏）物阻遏）p指被菌体迅速利用的底物或其分解指被菌体迅速利用的底物或其分解产物物对许多多酶（降解（降解酶、合成、合成酶）合成的抑制作用。）合成的抑制作用。p根据分解根据分解产物的不同，又分物的不同，又分为碳分解碳分解产物阻遏物阻遏和和氮分解氮分解产物阻遏物阻遏，如，如“葡萄糖效葡萄糖效应”和和“铵阻遏阻遏”。47.葡萄糖效葡萄糖效应p葡萄糖和乳糖同葡萄糖和乳糖同时存在，存在，细菌菌便会自便会自动优先利用葡萄糖。先利用葡萄糖。p启启动基因由基因由环腺苷酸启腺苷酸启动，而而环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。腺苷酸能被葡萄糖所抑制。RNA聚合聚合酶-环腺苷酸腺苷酸结合不合不到位点上，使无法到位点上，使无法转录。p由此可知，由此可知，结构基因同构基因同时受两受两个开关基因个开关基因操操纵基因与启基因与启动基因的基因的调控。只有当控。只有当这两个两个开关都开关都处于开启状于开启状态时，结构构基因才能活化。基因才能活化。48.降解物降解物活化蛋白活化蛋白49.p葡萄糖的大量存在，降低了胞内葡萄糖的大量存在，降低了胞内 cAMP 浓度：度：p葡萄糖抑制葡萄糖抑制腺苷酸腺苷酸环化化酶活性，降低活性，降低 cAMP 生成：生成：ATP cAMP+Pii？p葡萄糖降解物引起葡萄糖降解物引起 消耗胞内消耗胞内 cAMP：cAMP+H2O ADP AMPp结果，启果，启动子上没有子上没有cAMPCRP复合物复合物结合，使得合，使得RNA聚合聚合酶也无法也无法结合到启合到启动子的位点上，子的位点上，结构基因不构基因不能能转录和表达。和表达。50.铵阻遏阻遏p氮分解氮分解产物的物的调节作用指的是被菌体迅速利用的作用指的是被菌体迅速利用的氮源（特氮源（特别是是铵）能阻抑某些参与含氮化合物代）能阻抑某些参与含氮化合物代谢的的酶的合成。的合成。p如：在初如：在初级代代谢中，它能阻遏中，它能阻遏许多多芽芽孢杆菌的蛋杆菌的蛋白白酶的合成的合成p通常受到通常受到 NH4+阻遏的阻遏的酶有：有：亚硝酸硝酸还原原酶、硝、硝酸酸还原原酶、固氮、固氮酶、乙、乙酰胺胺酶、脲酶、黄、黄嘌呤脱呤脱氢酶、组氨酸氨酸酶、天冬、天冬酰胺胺酶等。等。51.（1）酶的合成的合成调节机制机制p诱导型操型操纵子；子；p阻遏型操阻遏型操纵子；子；p阻遏型操阻遏型操纵子形式子形式p末端末端产物或物或终产物阻遏；物阻遏；p分解代分解代谢产物阻遏（中物阻遏（中间产物）；物）；52.（1）酶的合成的合成调节机制机制p4）酶合成的合成的细胞膜通透性胞膜通透性调节p微生物的微生物的细胞膜胞膜对于于细胞内外物胞内外物质的运的运输具有高度具有高度选择性。性。采取生理学或采取生理学或遗传学方法，可以改学方法，可以改变细胞膜的透性，使胞膜的透性，使细胞内的代胞内的代谢产物迅速渗漏到物迅速渗漏到细胞外，胞外，这种解除末端种解除末端产物反物反馈抑制作用的菌株，可以提高抑制作用的菌株，可以提高发酵酵产物的物的产量。量。pa.生物素生物素亚适量适量p机制：机制：生物素生物素是合成脂肪酸的关是合成脂肪酸的关键酶-乙乙酰CoA 羧化化酶的的辅酶，亚适量的生物素适量的生物素直接抑制膜的合成直接抑制膜的合成或或使膜缺使膜缺损。乙乙酰CoA 丙二酸丙二酸单酰CoA 脂肪酸脂肪酸 CO2生物素生物素53.pb.油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型p油酸是一种含有一个双油酸是一种含有一个双键的不的不饱和脂肪酸（和脂肪酸（C18），是），是细胞膜磷脂中胞膜磷脂中的重要脂肪酸。的重要脂肪酸。油酸缺陷型因不能合成油酸而使油酸缺陷型因不能合成油酸而使细胞膜缺胞膜缺损，细胞膜胞膜的通透性加大。的通透性加大。p甘油缺陷型菌株的甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。即使是在生物素或油酸大量渗漏。即使是在生物素或油酸过量的情况下，也可以量的情况下，也可以获得大量谷得大量谷氨酸。氨酸。pc.控制控制细胞壁胞壁p如：加青霉素，抑制如：加青霉素，抑制细胞壁胞壁肽聚糖合成中聚糖合成中肽链的交的交联，从而改，从而改变细胞胞壁的通透性。壁的通透性。54.二、二、酶生生产的的发酵技酵技术p4.提高提高酶发酵酵产量的方法量的方法p（1）酶的合成的合成调节机制机制p诱导合成合成调节p酶合成的反合成的反馈阻遏阻遏p分解代分解代谢对酶合成的阻遏作用合成的阻遏作用p酶合成的合成的细胞膜通透性胞膜通透性调节p（2）通）通过育种提高育种提高酶产量量p自然自然选育育p诱变育种育种p基因重基因重组p（3）其他提高）其他提高酶产量的方法量的方法p改改变碳氮比碳氮比p添加添加产酶促促进剂p添加阻遏物添加阻遏物55.4.提高提高酶发酵酵产量的方法量的方法p（2）通）通过基因突基因突变（育种）提高（育种）提高酶产量量pA.自然自然选育育pB.诱变育种育种pC.基因重基因重组pD.其他方法其他方法56.A.自然自然选育与育与诱变育种育种pa.自然自然选育育根据菌种的自根据菌种的自发突突变而而进行菌种行菌种筛选过程。程。突突变频率低。率低。pb.诱变选育育通通过诱变剂处理，突理，突变频率提高，随机性大，如果率提高，随机性大，如果 筛选方法得当，也有可能方法得当，也有可能获得好的得好的变异株。异株。p目的：目的：提高提高产量量 提高提高质量量 增加品种增加品种 改善工改善工艺条件条件 57.自然自然选育育确定出确定出发菌株菌株 菌种的菌种的纯化化选优 出出发菌株的性能菌株的性能鉴定定同步培养同步培养 制制备单细胞（或胞（或单孢子）子）悬液液 活菌活菌浓度度测定定诱变剂的的选择与确定与确定诱变剂量的量的预试验 诱变处理理 计形形态变异的菌落数，异的菌落数，计算突算突变率率 平板分离平板分离 挑取疑似突挑取疑似突变菌落菌落纯培养培养 突突变体的初步体的初步筛选 用用简单快捷的方法快捷的方法重复重复筛选 摇瓶瓶发酵酵试验选出突出突变体（根据情况体（根据情况进行生行生产试验或或重复重复诱变处理）理）诱变育种育种58.诱变剂物理物理诱变剂化学化学诱变剂烷化化剂碱基碱基类似物似物吖啶化合物化合物紫外紫外线X射射线射射线快中子快中子激光激光射射线诱变剂的种的种类及及选择诱变剂处理理方式可分方式可分为:单因子因子处理和复因子理和复因子处理，复因理，复因子子处理一般理一般先用弱先用弱诱变因子，后用因子，后用强诱变因子因子59.诱变剂诱变剂的的浓度度处理理时间缓冲液冲液终止反止反应亚硝酸硝酸.mol/lminPH4.51mol/l醋醋酸酸缓冲液冲液Ph8.6,0.07mol/l磷酸磷酸二二氢钠硫酸二乙硫酸二乙酯（DES）minPH7.0,0.1mol/l磷酸磷酸缓冲液冲液硫代硫酸硫代硫酸钠或大量稀或大量稀释甲基硫酸乙甲基硫酸乙酯（EMS）mol/lminPH7.0,0.1mol/l磷酸磷酸缓冲液冲液硫代硫酸硫代硫酸钠或大量稀或大量稀释亚硝基胍硝基胍（NTG）mg/mlminPH7.0,0.1mol/l磷酸磷酸缓冲液冲液大量稀大量稀释亚硝基甲基硝基甲基胍（胍（NMU）mg/mlminPH7.0,0.1mol/l磷酸磷酸缓冲液冲液大量稀大量稀释氮芥氮芥mg/mlmin碳酸碳酸氢钠大量稀大量稀释氯化化锂加入培养基，在加入培养基，在生生长过程中程中进行行大量稀大量稀释秋水仙碱秋水仙碱加入培养基，在加入培养基，在生生长过程中程中进行行大量稀大量稀释60.1）高）高产突突变株的株的选育育出出发菌株菌株绝大多数个体死亡大多数个体死亡少数存活少数存活多数未多数未变少数突少数突变多数多数负变少数正少数正变多数多数变幅小幅小少数少数变幅大幅大多数不宜投多数不宜投产少数宜投少数宜投产存活率存活率 突突变率率 正正变率率 高高产率率 投投产率率诱变平板分离平板分离纯培养培养初初筛重重筛变异幅度广异幅度广 产量高的出量高的出发菌株菌株 对诱变剂敏感性大敏感性大61.产酶高高产菌初菌初筛p透明圈法透明圈法p显色圈法色圈法p摇瓶培养瓶培养62.透明圈法透明圈法p在平板培养基中加入在平板培养基中加入溶解性溶解性较差的底物，差的底物，使培养使培养基混基混浊。能分解底物的微生物会在菌落周。能分解底物的微生物会在菌落周围产生生透明圈。透明圈。p该法在分离法在分离水解水解酶产生菌生菌时采用采用较多，多，产有机酸有机酸菌也可用。菌也可用。p如：脂肪如：脂肪酶、淀粉、淀粉酶、蛋白、蛋白酶、核酸、核酸酶产生菌都生菌都会在含有底物的会在含有底物的选择性培养基平板上形成透明圈。性培养基平板上形成透明圈。p圈的大小初步反圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。菌株利用底物的能力。63.-淀粉淀粉酶的的筛选64.应用用含含酪酪蛋蛋白白的的培培养养基基65.p筛选半半纤维素素酶 划划线产透明圈的透明圈的细菌菌点种点种66.变色圈法色圈法p对于一些于一些不易不易产生透明圈生透明圈产物的物的产生菌，生菌，可在底物平板中加可在底物平板中加入指示入指示剂或或显色色剂，使所需微生物能被快速，使所需微生物能被快速鉴别出来。出来。p如：如：筛选果胶果胶酶生生产菌菌时，用含有，用含有0.2%果胶果胶为唯一碳源唯一碳源的培养基平板，待菌落的培养基平板，待菌落长成后，加入成后，加入0.2%刚果果红染色液染色液4h，具有分解果胶能力的菌落周，具有分解果胶能力的菌落周围便会出便会出现绛红色水解圈。色水解圈。p刚果果红的的变色范色范围为pH35。在在pH5时，它以磺酸，它以磺酸钠形式存在，形式存在，显红色；色；在在pH3时，它以，它以邻醌式内式内盐的的结构存在，构存在，显蓝色。色。果胶果胶酶水解果胶形成游离的半乳糖水解果胶形成游离的半乳糖醛酸酸 67.68.产酶高高产菌复菌复筛p经初初筛后可后可简便快速淘汰便快速淘汰8590%不符合要求不符合要求的微生物，剩下的微生物，剩下较好菌株好菌株进行行摇瓶复瓶复筛。p通常一株要重复通常一株要重复35个瓶，培养后的个瓶，培养后的发酵液采用酵液采用精确分析方法精确分析方法测定：定：p蛋白蛋白酶用分光光度用分光光度计；p脂肪脂肪酶用用NaOH滴定等。滴定等。p最后最后选出出23株。株。69.70.2）组成型突成型突变株的株的选育育p组成型突成型突变株：株：p是指操是指操纵基因或基因或调节基因突基因突变引起引起酶合成合成诱导机制失灵。机制失灵。p菌株不菌株不经诱导也能合成也能合成酶；p或不受或不受终产物阻遏的物阻遏的调节突突变型。型。p突突变株特性：株特性：p有的是有的是调节基因突基因突变，致使不能形成活性化的阻抑物；，致使不能形成活性化的阻抑物；p有的是操有的是操纵基因突基因突变，丧失了和阻抑物失了和阻抑物结合的合的亲和力。和力。p目的：目的：p可以利用一些易可以利用一些易同化碳源同化碳源或或价廉易得的碳源价廉易得的碳源为基基质，生，生产所需的所需的诱导酶类。71.组成型成型选育方法：育方法：pa.限量限量诱导物恒化培养物恒化培养p野生型的菌种野生型的菌种经诱变后移接到低后移接到低浓度度诱导物的恒化器中物的恒化器中连续培养。培养。p由于由于该培养基中底物培养基中底物浓度低到度低到对野生型菌株不野生型菌株不发生生诱导作作用，所以用，所以诱导型的野生型菌株不能生型的野生型菌株不能生长，而突，而突变株由于不株由于不经诱导就可以就可以产生生诱导酶而利用底物，因而很快得以生而利用底物，因而很快得以生长成成为组成型菌株。成型菌株。p培养培养过程正确控制培养程正确控制培养时间，使，使组成型突成型突变株得以繁殖，株得以繁殖，而而诱导型菌株型菌株则被淘汰。被淘汰。p例如在低例如在低浓度乳糖恒化器上度乳糖恒化器上连续培养大培养大肠杆菌，其中杆菌，其中组成成型突型突变株不要加株不要加诱导物也能合成物也能合成-半乳糖苷半乳糖苷酶。72.组成型成型选育方法：育方法：pb.循循环培养培养p要解除要解除诱导的菌株，移接到含有的菌株，移接到含有诱导物和不含物和不含诱导物的培养基上交替物的培养基上交替连续循循环培养。培养。p由于由于组成型突成型突变株在两个培养基上都能株在两个培养基上都能产酶，生，生长逐逐渐占占优势。p例如把例如把诱导型的野生菌株型的野生菌株经诱变剂处理后，先移接到含葡萄糖培养基理后，先移接到含葡萄糖培养基中中进行培养。行培养。这时，野生型菌株和，野生型菌株和组成型突成型突变体都能生体都能生长。将此培养。将此培养物移接到含物移接到含诱导物培养基中培养，物培养基中培养，此此时组成型菌株立即开始生成型菌株立即开始生长，而而诱导型野生菌株型野生菌株须经一段停留一段停留时间(诱导酶合成合成时间)才开始生才开始生长，只，只要要细