间充质干细胞在小型猪重组牙...种异体移植中的免疫调节作用_吴志芳.pdf

北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.112近年来，牙科领域里，牙再生组织工程取得了突破性进展，人类再生出具有类似于天然牙的美学和功能的第三副牙齿有望成为可能1,2。已有研究证明，将胚胎期小鼠牙胚细胞解离重组后，移植到成年小鼠牙槽骨内或肾囊膜内，可再生出与天然牙齿结构和功能相似的全牙3,4。相对于小鼠，小型猪不但在免疫和生理等方面与人类更接近；而且牙齿数量、大小、形态、牙型、发育周期、萌出、替换及发育机制等方面跟人类更为相似；因此，小型猪是目前研究牙齿发育和再生的理想模式动物5,6。然而，在小型猪体内实现同种异体组织或器官移植，需要克服免疫排斥等问题。间充质干细胞最初在骨髓中发现，具有低/无免疫原性和免疫调节功能7,8，可通过调节 T、B淋巴细胞等免疫细胞发挥免疫抑制功能9,10，是一种非常有效且相对安全的免疫抑制剂，已被用于自身免疫疾病的临床治疗和降低重要脏器移植的免疫排斥反应的研究和临床11,12。他克莫司（tacrolimus），又名 FK506，是一种强力的新型免疫抑制剂，是目前器官移植的常用免疫抑制剂之一。本实验研究骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）单独使用或与FK506 联合应用，对小型猪重组牙胚同种异体移植的免疫调节作用，为后续大型动物牙再生研究，探索一种可靠的、可克服同种异体种子细胞移植排斥的免疫干预方法。间充质干细胞在小型猪重组牙胚同种异体移植中的免疫调节作用吴志芳 徐亿普 王福 夏登胜【摘要】目的 探索在小型猪重组牙胚同种异体移植实现颌骨内牙再生过程中，间充质干细胞 BMMSCs 的免疫调节作用。方法 将胚胎小型猪帽状期牙胚解离重组后，移植至成年小型猪拔牙区，BMMSCs 经分离鉴定后，单独或与他克莫司 FK506 联合应用，进行同种异体移植免疫干预；评估受体小型猪的免疫状况和牙再生小型猪百分比。结果 BMMSC 组受体小型猪 CD3+细胞和 CD3+CD8+细胞比例均显著下降（P 0.05），Tregs 细胞比例显著上调（P 0.05），有牙再生的小型猪百分比为 75%；而 BMMSC+FK506 组 CD3+和 CD8+T 细胞比例均显著下调（P 0.05），但 Tregs 比例与空白对照组无显著差异，该组 25%小型猪有牙再生；空白对照组的免疫排斥相关指标上调，未发现牙再生。结论 相对于与 FK506 合用，单独使用 BMMSCs 更有利于同种异体重组牙胚移植。【关键词】间充质干细胞；同种异体移植；小型猪；重组牙胚；免疫调节【中图号】R739.8【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.01.003Immunomodulatory effects of mesenchymal stem cells on allogenic re-associated tooth germ transplantation in sus scrofa WU Zhi-fang,XU Yi-pu,WANG Fu,ZHOU Jian,XIA Deng-sheng.Department of Integrated Emergency Dental Care,Capital Medical University School of Stomatology,Beijing 100050,China【Abstract】Objective To explore whether MSCs can be applied to reduce immune rejection in allogenic tooth germ transplantation for tooth regeneration in Sus scrofa.Methods In the present study,the allogeneic re-associated tooth germs at cap stage were transplanted into the jawbones of host minipigs.After isolation and identification,allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells(BMMSCs)alone or with FK506 were administrated to reduce immune rejection.Immune condition of the host minipigs was evaluated and numbers of minipigs with successfully regenerative teeth were counted.Results Immunological assessment of host minipigs suggested that percentage of CD3+T or CD3+CD8+T cells significantly decreased,whereas that of CD25+FoxP3+Tregs exhibited a significant increase in the peripheral blood after administration of BMMSCs,and the percentage of minipigs with regenerative teeth was 75%in BMMSC group.Allogeneic re-associated tooth germs were all rejected in the negative control group,without tooth regeneration.Conclusions BMMSCs are more beneficial for allogenic re-associated tooth germ transplantation to regenerate tooth in Sus scrofa.【Key words】Mesenchymal stem cells;Allogenic transplantation;Sus scrofa;Re-associated tooth germ;Immunomodulatory effect 作者单位：100050 北京 首都医科大学口腔医学院急诊综合诊疗中心（吴志芳、徐亿普、夏登胜）；大连医科大学附属口腔医院综合科（王福）通信作者：夏登胜，E-mail:，电话：[phone]北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.113材料和方法1.实验动物骨髓间充质干细胞来源于 1 头 18 月龄实验用小型猪。牙胚细胞供体为 9 头 50 天胚胎小型猪（E50），后者由 1 头妊娠 50 天实验用小型孕猪经术前 B 超验证后剖腹产获得。受体为 12 头 16 20月龄实验用小型猪。实验用小型猪均由中国农业大学动物研究所提供。所有动物实验经首都医科大学伦理委员会批准。2.试剂和主要设备-MEM、胎牛血清、成脂诱导培养基（Gibco，美国）；谷氨酰胺、维生素 C、青-链霉素、0.25%胰蛋白酶（Trypsin-EDTA 0.25%）（InvitroGen，美国）；I 型胶原酶、Dispase、阿司匹林（Sigma，美国）；胶原凝胶（Nitta gelatin，日本）；淋巴细胞分离液（Sigma-Aldrich，美国）；成骨诱导培养基（Cyagen，美国）；麻醉试剂（氯胺酮、速眠新）（聖鑫，中国）；流式抗体（BD Biosciences，加拿大）。常规妇产科手术器械、显微外科器械、便携式 B 超仪（CSBT/B-51，中国）；体式显微镜 DP71（OLYMPUS，日 本）；Transwell 三 维 培 养 装 置（Corning，美国）；种植机（NOUVAG AG，MD20，瑞士）；流式细胞仪（BD，美国）。3.研究方法骨髓间充质干细胞的获取：从小型猪股骨通过骨髓穿刺法获取骨髓，经淋巴细胞分离液密度梯度离心后，获取上数第二层目标细胞，进行细胞培养。培养基：-MEM、10%FBS、1%双抗、1%谷氨酰胺。置于 37，5%CO2和 95%空气条件的细胞培养箱内培养，每隔 3 天换液。7 天后使用 0.25%胰蛋白酶传代培养。骨髓间充质干细胞鉴定：表面标志物鉴定：流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物 CD29、CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD31 和 CD45 的表达情况。成骨诱导及茜素红染色：第 3 代细胞以 2103个/cm2的浓度接种于6 孔板中，等细胞生长至 80%融合后，更换为成骨诱导培养液，对照组加入普通培养基，每 2 天换液，光镜下观察钙结节形成情况；诱导 23 周后，进行茜素红染色。成脂诱导及油红 O 染色：将第 3 代的骨髓间充质干细胞按 1104/孔接种于 12孔板中，用成脂诱导培养基培养，按说明书步骤进行换液。细胞在此种培养基诱导 34 周后，用油红O 染色法检测。牙胚的获取、分离重组及体外三维培养：获取E50 天胚胎小型猪后，置于无菌 PBS 内，齐下颌角水平剪下标本头部，沿口裂水平剪开，分离上下颌，在体式显微镜下用显微镊子分离上下颌第二乳切牙牙胚（E50 天时，该牙胚处于帽状期6）。在体视镜下,分离牙胚上皮和间充质；并分别用 Collagen I 3 mg/ml和 Dispase4 mg/ml 酶消化法，解离成上皮和间充质单细胞悬液：离心后分别成细胞团。将牙胚上皮细胞团（1105个细胞）置于含胶原凝胶的间充质细胞团（1105个细胞）上方，制成重组牙胚后，再经 Transwell 三维培养 7 天，用于移植2。同种异体牙胚移植：重组牙胚（后续简称牙胚）移植 3 月前，拔除受体小型猪的上颌尖牙和前磨牙；移植前拍 CT 确认无残余牙体组织2。移植时，受体猪麻醉完善后，仰卧位，术区常规消毒铺巾，切开上颌拔牙区黏膜，剥离黏骨膜，种植机制备种植孔，备孔全程用生理盐水冲洗冷却，将需要移植的牙胚分别置于一侧上颌骨种植孔内，用含阿司匹林（100 g/孔）的明胶海绵覆盖，每孔周围用一个钛钉进行标记，严密缝合。每头小型猪移植 3 个牙胚。实验动物分组及免疫干预：为了克服同种异体移植的免疫排斥，实验采用了 BMMSCs 和 FK506进行免疫干预，根据免疫干预措施，受体小型猪随机分为三组：BMMSC 组、BMMSC+FK506 组，空白对照组，每组 4 头。前两组于牙胚回植前 1 天从受体猪耳缘静脉给予(2.687.36)106/kg 的骨髓间充质干细胞13（图 1）。BMMSC+FK506 组受体小型猪除骨髓间充质干细胞免疫干预外，于牙胚回植前 1 天开始，根据药品说明书，每天还通过饲料饮食给予 1.33 mg/kg FK506，连续 2 周。空白对照组：仅接受牙胚移植，不采用任何免疫干预。免疫状况的检测：分别于免疫干预前 3 天、干预后第 3、7、21 天，从前腔静脉获取受体猪外周血，进行流式细胞检测，分析 CD3+细胞、CD8+T 淋巴细胞、CD25+Foxp3+T 淋巴细胞、CD79+活化 B 细胞等的比例，并检测血清中 IgM，IgG 和 IgA 等的浓度。评估牙再生小型猪百分比：移植 3 月后，取移植部位组织进行 HE 染色，检测牙再生情况，并计算各组出现牙再生小型猪占每组样本量的百分比。北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.1144.统计学分析应用 SPSS21.0 统计学软件；采用单因素 ANOVA 检验进行统计学分析，P 0.05，认为具有统计学差异。结 果1.骨髓间充质干细胞的鉴定倒置显微镜下观察，原代培养的小型猪骨髓间充质干细胞呈短梭形或扁平多角形，胞体丰满，核较大，呈圆形或卵圆形。经传代后，细胞生长旺盛，形态均一，呈长梭形（图 2A）。在体外经成骨诱导培养后，茜素红染色呈阳性，说明该细胞表现出成骨分化潜能（图 2B）；经成脂诱导培养后，油红 O 染色显示，细胞内出现脂滴，说明该细胞表现出可分化为脂肪细胞的潜能（图 2C）。经过流式细胞术检测，小型猪骨髓间充质干细胞表面 CD29、CD73、CD90、CD105 等呈阳性表达，CD14、CD31、CD34、CD45 呈阴性表达2。2.他克莫司浓度BMMSC+FK506 组小型猪饮食中加入 FK506后，血药浓度逐渐升高，给药第 7 天时浓度达到高峰，约为 12.0 ng/ml；停止给药后，药物浓度逐渐降低，第 21 天后（即停止给药 7 天后），血清中无法检出他克莫司（图 3）。3.免疫状况检测细胞免疫相关指标：受体猪在接受免疫干预后，与空白对照组比较，BMMSC 组和 BMMSC+FK506组的 CD3+T 淋巴细胞比例、CD3+CD8+T 细胞比例均显著下调，差异具有统计学意义（P 0.05）（图4A，B）。T 淋 巴 细 胞 中，CD25+Foxp3+调 节 性 T细胞比例在 BMMSC 组显著上调（P 0.05）；但BMMSCs 和 FK506 联合应用无法上调 Tregs 细胞（图 4C）；提示骨髓间充质干细胞可上调 Tregs，但图 1 小型猪耳缘静脉输注骨髓间充质干细胞 A：小型猪耳缘静脉输注；B：内含骨髓间充质干细胞 BMMSCs 的注射器连接输液管图 2 小型猪骨髓间充质干细胞的鉴定 A：骨髓间充质干细胞形态学观察；B：成骨诱导分化（左：实验组，右：对照组）；C：成脂诱导分化（左：实验组，右：对照组）图 3 FK506 的浓度北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.115FK506 可能会抑制 Tregs 产生。由于小型猪的 CD4+T 细胞个体差异极大，无法有效统计；甚至在部分小型猪外周血中发现了 CD3+CD4+CD8+的“双阳”T 细胞。CD79+CD3-是活化B 细胞的标志物，BMMSCs 干预前 3天 CD79+CD3-B 细胞有下调趋势，但未发现统计学差异（图 4D），可能与样本数量有限和个体差异大有关。体液免疫相关指标：检测受体小型猪血清中的体液免疫相关指 标，发 现 BMMSCs 和 BMMSCs+FK506 均可不同程度地降低同种异体牙胚移植后的 IgM、IgG 和 IgA 的浓度（图 5）。4.不同免疫方式干预下，牙再生小型猪百分比移植 3 月后，HE 染色检测小型猪颌骨内移植部位牙再生情况，BMMSC 组 和 BMMSC+FK506 组 有牙齿样结构形成（图 6），说明同种异体牙胚移植后在有免疫干预情况下，在受体颌骨内可存活且继续发育。但接受了 BMMSCs 免疫干预的 4 头小型猪，其中 3 头发现牙再生，牙再生小型猪百分比为 75%；而 BMMSC+FK506 组仅 1 头小型猪出现了牙再生，牙再生小型猪百分比为 25%；空白对照组均未发现牙再生迹象（表 1）。讨 论龋病、牙周炎、肿瘤、创伤及衰老等原因引起的牙齿缺失在临床上十分常见。由于牙缺失修复方式的选择多元化需求的推动，及人口老龄化日趋严重而人们生活质量和追求日渐提高，近年来基于组织工程的牙再生取得了很大进展，并具有广阔的市场前景。种子细胞、生物支架和生长因子微环境被认为是组织工程的三要素14；其中，种子细胞来源是限制牙再生研究和临床应用的最关键因素之一。相对于自体种子细胞，同种异体细胞移植为牙再生提供了更广阔的种子细胞来源。然而，大型动物和人类同种异体移植不可避免需要克服免注：*：BMMSC组与空白对照组比较，P 0.05；#：BMMSC+FK506组与空白对照组比较，P 0.05图 5 骨髓间充质对体液免疫的调节作用 注：d：牙本质；dp：牙髓；e：牙釉质；od：成牙本质细胞图 6 不同免疫干预组的再生牙 HE 染色注：*：BMMSC组与空白对照组比较，P 0.05；#：BMMSC+FK506组与空白对照组比较，P 0.05图 4 骨髓间充质干细胞对免疫细胞的调节作用 A：CD3+细胞；B：CD3+CD8+T 细胞；C：CD25+FoxP3+Tregs 细胞；D：CD79+CD3-B 细胞ABCD北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.116疫排斥等问题。本研究发现同种异体牙胚移植的小型猪接受BMMSCs 免疫干预后，外周血中 CD3+T 淋巴细胞比例和CD3+CD8+T细胞比例显著下调，Tregs显著上调，从而诱导免疫耐受，与文献报道一致。大量研究认为，BMMSCs 可通过旁分泌途径分泌多种可溶性细胞因子如一氧化氮、前列腺素 E2（PGE2）、吲哚胺 2，3 双加氧酶（IDO）等或者通过与 T 细胞间的直接接触，抑制 T 细胞的增殖、分化和活化15,16；同时MSCs 还可通过转化生长因子(TGF-)、IL10 等促进 Treg 的产生，从而抑制免疫排斥反应17；因此，MSCs 已被用于血液恶性肿瘤患者造血干细胞移植，以减少移植物抗宿主反应 GVHD，降低移植并发症和死亡率，并取得了良好效果18。MSCs 可减低同种异体免疫排斥，提高心肌细胞移植成功率19,20。本研究发现对照组小型猪不接受任何免疫干预时，同种异体牙胚移植后，均无法获得再生牙，这提示：同种异体牙胚具有一定的免疫原性，会引起免疫排斥。BMMSC 组与 BMMSC+FK506 组均可不同程度地下调 CD3+T 细胞和 CD3+CD8+T 细胞比例；但 BMMSC 组出现牙再生小型猪的比例更高，从免疫角度分析看来，主要原因跟 Tregs 比例有关；BMMSC 组 Tregs 显著上调，而 BMMSC+FK506 组Tregs 比例上调不明显，由此推测：同种异体移植的成功可能与Tregs细胞诱导免疫耐受密切相关；FK506 与 BMMSCs 联合应用，会影响 Tregs 的产生。文献报道，FK506 可全面抑制 T 淋巴细胞和其他免疫细胞的作用，不但抑制 Th1、Th17 等促炎细胞，同时还抑制 Tregs 细胞21,22。但是 FK506是否会对 BMMSCs 上调 Tregs 细胞产生间接抑制作用，尚需要进一步的研究验证；不过有研究发现23，在大鼠同种异体肠移植时，单独使用 MSCs 比与FK506 联合应用的免疫调节能力更强；前者能更大幅度地下调 CD4+、CD8+T 细胞、B 细胞等，与本研究观点一致。另外，FK506 价格相对昂贵，高浓度的 FK506 具有一定肝毒性和肾毒性，引起糖代谢紊乱，诱发感染，尤其是呼吸道感染。相对FK506 的作用机理和副作用，间充质干细胞 MSCs是一种更温和且更具调节能力的免疫干预制剂。本研究通过检测细胞免疫和体液免疫相关指标，发现 BMMSCs 可以上调 Tregs 且下调免疫排斥相关指标。但由于目前市场上猪的免疫相关抗体尚待完善，部分免疫指标无法检测，但关键的免疫排斥和免疫调节相关指标如 CD3+细胞、CD8+T 细胞、Treg 细胞等尚可检测，且均表明单独使用 BMMSCs作为免疫干预，比与 FK506 联合应用，对受体猪的免疫调节效果更好；总之，综合考虑免疫调节效果、副作用和经济因素等，更推荐 BMMSCs 不与FK506 合用。综上所述，本研究以小型猪为动物模型，研究了骨髓间充质干细胞单独或联合免疫抑制剂 FK506对同种异体牙胚移植的免疫调节作用；为将来开展人类牙再生转化研究克服免疫排斥问题，提供了重要的参考依据。参 考 文 献 1 Zhang Y,Chen Y.Bioengineering of a human whole tooth:progress and challenge.Cell Regen,2014,3(1):8-11.2 Wu Z,Wang F,Fan Z,et al.Whole-tooth regeneration by allogeneic cell reassociation in pig jawbone.Tissue Eng Part A,2019,25(17-18):1202-1212.3 Ikeda E,Morita R,Nakao K,et al.Fully functional bioengineered tooth replacement as an organ replacement therapy.Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(32):13475-13480.4 Wang F,Wu Z,Fan Z,et al.The cell re-association-based whole-tooth regeneration strategies in large animal,Sus scrofa.Cell Prolif,2018,51(4):e12479.5 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空白对照组（n=4）（n=4）（n=4）牙再生小型猪3（75）1（25）0（0）再生失败小型猪134北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.117randomized,open-label,controlled trial.Stem Cell Res Ther,2021,12(1):244-259.13 Zhao Q,Ren H,Han Z.Mesenchymal stem cells:immunomodulatory capability and clinical potential in immune diseases.Journal of Cellular Immunotherapy,2016,2:3-20.14 Mertz L.Tissue engineering and regenerative medicine:the promise,the challenges,the future.IEEE Pulse,2017,8(3):15-18.15 Meisel R,Zibert A,Laryea M,et al.Human bone marrow stromal cells inhibit allogeneic T-cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase-mediated tryptophan degradation.Blood,2004,103(12):4619-4621.16 Sato K,Ozaki K,Oh I,et al.Nitric oxide plays a critical role in suppression of T-cell proliferation by mesenchymal stem cells.Blood,2007,109(1):2 28-234.17 Li N,Hua J.Interactions between mesenchymal stem cells and the immune system.Cell Mol Life Sci,2017,74(13):2345-2360.18 Zhao L,Chen S,Yang P,et al.The role of 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