日立L-8900全自动氨基酸分析仪简易统一标准操作作业规程.doc

日立L-8900全自动氨基酸分析仪原则操作规程

一. 目
为规范日立L-8900全自动氨基酸分析仪基本操作、维护保养、异常解决程序，防止人为操作失误，保证氨基酸分析仪正常运转，特制定本程序。
二. 合用范畴
本程序合用于日立L-8900全自动氨基酸分析仪。
三． 责任
1. 本程序实行者为氨基酸分析仪操作者，各实验室负责人对本程序实行状况进行监
督。
2. 寻常运营及维护、定期维护、定期点检及保养由氨基酸分析仪操作者负责。
四. 内容
1．联机
（1） 打开电脑。
（2） 打开L-8900主机电源。
（3） 双击桌面图标，进入1-1画面，双击图标，进入程序。

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（4） 在菜单栏中依次点击和，浮现1-2画面，单击联机。大概两分钟，初始化完毕。中Uninitialized变成Idle，图1-2变成了图1-3，各个组件可以进行控制了。初始化完毕后，分离柱温度逐渐上升，分离柱温度会升到50℃。 如果打开反映柱柱温控制，则温度大概20分钟升到135℃。

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2、手动各组件控制操作
（1） 泵1和泵2
点击，浮现2-1画面。设立泵1，流量0.1ml/分钟，B6 100%。点击打开泵1。泵打开后，泵背景颜色由灰色变为黄色。

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点击，浮现2-2画面，设立泵2，流量0.1ml/分钟，R3 100%。点击打开泵2。泵打开后，泵背景颜色由灰色变为黄色。

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（2）自动进样器
点击，浮现2-3画面，设立Sampler Wash不少于3次。

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（3）分离柱柱温箱
点击，浮现2-4画面，设立柱温50℃，设立ON，打开柱温箱。柱温箱打开后，背景颜色由灰色变为黄色。

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（4）反映柱柱温箱
点击，浮现2-5画面，设立柱温135℃，设立ON，打开柱温箱。柱温箱打开后，背景颜色由灰色变为黄色。

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（5）钨灯
点击，浮现2-6画面，设立ON，打开钨灯。钨灯打开后，背景颜色由灰色变为黄色。

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3、编辑办法
（1）Stand By 程序
（a）依次点击、、浮现3-1-1画面。

3-1-1
（b）选中，点击。再依次点击、，浮现3-1-2画面。

3-1-2
（c） 在设立中选中各个柱（也可以不选），别的参数默认。
（d）将办法另存为Stand-By，文献名及途径均可自选。注意最佳不要覆盖本来办法，最佳另存办法。

（2）再生程序
犹如Stand By 程序，只是选中而已。将办法另存为RG。

（3）分析程序
（a） 犹如Stand By 程序，选中，参数默认，将办法另存为Analyze。
4、编辑Sequence
（1）依次点击、、，浮现4-1画面。选中，别的参数默认。

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（2）点击，浮现4-2画面，依照需要填写各个参数（未知样品个数、未知样品重复次数等）。

4-2
（3）点击，浮现4-3画面，依照需要填写各个参数（标样和未知样品第一种瓶号，增量、进样体积等）。

4-3
（4）点击，浮现4-4画面，依照需要填写各个参数（标样品个数、标样重复次数等）。
。

4-4
（5）点击，浮现4-5画面。
4-5
（6）通过复制、编辑，最后将Sequence编辑如图4-6所示。注意此时第一行是升温程序（Stand-By），第二行是再生程序（RG），两行进样体积均为0，Run Type是Unknown，第三行是原则样品，四行起是未知样。

（7）将Sequence另存为Test。
5、采集数据
点击Control、Sequence Run，运营Sequence Test。
数据采集完后，机器自动进入清洗程序。清洗一种小时后，自动关泵，关灯，关柱温箱。
6、关机
点击断开连接，关闭程序，关闭主机电源。
7、试剂准备
反映液R1、R2：醋酸钠(CH3COONa·2H2O)、冰醋酸(CH3COOH)、茚三酮(C9H6O4)、丙二醇甲醚（CH3CH(OH)·CH2OCH3）、硼氢化钠 （NaBH4）
缓冲液B1到B6：柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)、柠檬酸(C6H8O7·H2O)、氯化钠(NaCl)、无水乙醇(C2H5OH)、氢氧化钠(NaOH)、硫代双乙醇（硫二甘醇）(S(C2H4OH)2)、苯甲醇（）、brij-35(聚氧乙烯十二烷基谜)、辛酸(C7H15COOH)
试剂建议用优级纯。

8．出峰状况
Asp： 天门冬氨酸 Thr：苏氨酸 Ser： 丝氨酸 Glu：谷氨酸
Pro： 脯氨酸 Gly：甘氨酸 Ala：丙氨酸 Cys：胱氨酸
Val： 缬氨酸 Met：蛋氨酸 Ile： 异亮氨酸 Leu： 亮氨酸
Tyr： 酪氨酸 Phe：苯基丙氨酸 Lys：赖氨酸 NH3： 氨气
His： 组氨酸 Trp：色氨酸 Arg：精氨酸

9. 仪器使用注意事项
（1）氮气压力：仪器需要压力为0.05—0.1Mpa，压力过高会损坏仪器。
（2）为避免堵塞，注意泵1泵2打开顺序。先开泵1，再开泵2。泵1用B6100%，0.1ml/分钟；泵2用R3100%，0.1ml/分钟。
（3）电脑禁止更改设立，禁止安装其她程序，禁止上网。注意避免染上病毒。因软件需要注册，如果操作系统发生故障，请告知天美公司。
（4）进样浓度范畴：0.4—10 nmol， 过高浓度会影响分析成果，且容易堵塞反映柱。
（5）注意检查仪器泵压力与否正常。
（6）筹划长期不用可以用B5清洗泵流路。但最佳只清洗泵头，即开泵时最佳将排放阀打开。
10. 样品前解决
准备想做测试样品，在开动氨基酸分析仪之前，需要进行适合该项检测目解决，在这上分有两大系统，一种是将氨基酸以及和它关于连化合物为对象对游离氨基酸测定法（如下称生物液分析法），另一种是由蛋白质加水分解而得到氨基酸对它分析法（如下称蛋白质加水分解物分析法）在此对其中几种作简介。此外，作为原则请用0.45um过滤器对样品过滤。
（1） 生物液分析法前解决：
重要目是做氨基酸成分提取（萃取），除去蛋白质以及不溶性物质。
（a） 血液
① 把血液用7,000~10,000 rpm(7000~10000 G)离心分离15分钟
② 在澄清液中加入5~10%三氯醋酸，稀释2~3倍。
③ 用7,000~10,000 rpm（7000~10000 G）离心分离15分钟。
④ 将澄清液作为样品。
注意事项：
1）澄清液有混蚀时，要么提高离心分离转速，要么进一步使用过滤器。
2）虽然三氯醋酸浓度依照蛋白质量而不同样，普通把添加后浓度做为3%左右。
3）将血液就这样做除蛋白操作，回收率很低，特别是Arg消失明显。
4）最后样品量做成0.05~0.1ml
（b） 滤纸提取血液（直径10mm点约30ul，至少也是直径3mm×5片）
① 剪开滤纸，沿着离心管管壁放入（例如：
② 加入0.5ml1%三氯醋酸
③ 用超声波清洗器震动2分钟
④ 用7,000~10,000rpm（7000~10000G）离心分离15分钟
⑤ 用0.45um过滤器将澄清液过滤，使用微量小玻璃瓶装进自动进样器
注意事项：样品混浊多时候，不要使用三氯醋酸，用水/乙醇提取（萃取），待减压干硬后，用0.02N-HCI稀释话，分析柱污染将减少。
（c） 尿
① 在原尿中加入1%三氯醋酸再稀释2~5倍（由于有异常尿有大量氨基酸出来，因此要提高稀释倍率）。
② 有混浊时，进行过滤或者离心分离。
③ 把得到液体0.05~0.1ml作样品。
注意事项：检测微量成分良好敏捷度时，在除蛋白后，减压干硬之后用稀释液再溶解。浓度就和原液吻合。
（d） 酱汁（调味汁）、果汁等具有蔬菜原料食品类
① 用1~5%三氯醋酸溶液稀释10倍
② 用7,000~10,000rpm（7000~10000G）离心分离15分钟
③ 把澄清液作样品
（e） 酱油、酒等设有沉淀物水系食品类
① 在0.02NHCI稀释做样品（和PH关系在3倍以上）
注意事项：食醋等虽然在低稀释度就可以，但酱汕等由于氨基酸浓度高，要稀释200~300倍左右再作样品。
（f） 从植物叶提取（萃取）
① 用研钵将样品搓碎，或是截断成细小状。
② 在具有乙醇20%~30%水中让其散开（1g样品/3ml乙醇/水）
③ 在水浴器上用80℃，约20分钟以上提取（萃取）。
④ 将澄清液过滤提取，提取（萃取）要重复3次。
⑤ 使用漏斗将剩余样品用酒精清洗。
⑥ 由④以及⑤液体在水浴器上除去酒精。
⑦ 往残留下来水溶液中加入乙醚提取（萃取）后，采用水层
⑧ 把水层减压干硬
⑨ 在0.02 N HCI给一定容量
（2） 蛋白质加水分解物分析法前解决
把混合了药液氨基酸，以及用蛋白质加水分解得到氨基酸作对象。
（a） 药液
① 由0.02 N HCI稀释3倍以上（依照氨基酸浓度）作样品，包具有糖、核酸、维生素等水溶性物质，也不妨碍。
（b） 盐酸加水分解
① 将样品在加水分解用玻璃试管上秤
② 加入6N-HCI
③ 在减压状态下封管，此时，若置换N2话，将更对的。
④ 在加水分解炉中，用110℃、22小时加热分解。分解时间以上面为准，依照目而变更。
⑤ 减压干硬，除去HCI
⑥ 在0.02NHCI稀释一定容量作样品
注意事项：
1）最后浓度以0.5mg蛋白质/ml为原则。
2）加水分解时容量以6NHCI1mg中，样品在3mg如下为基准。
3）减压干硬之际，在40~80℃之间加温。

（c） 以回收Trp为目加水分解
① 代替6N-HCI是使用4N甲烷磺酸，依从前面所述，盐酸加水分解办法让其分解。
② 分解后，由于不能减压干硬，加入4N-NaOH，在PH=2调节。
③ 在0.02N-HCI给一定容量作样品。
注意事项：
1）甲烷磺酸是用1ml小玻璃瓶装入，由技术化学制品株式会社出售，其构成是在4N甲烷磺酸中具有0.2% 3-(2-氨基乙烷)吲哚[氮（杂）茚]
2）中和时PH，使用PH试纸
3）分析了20个被检体后，将分解柱用再生液清洗4小时左右，这是为除去从树脂中混入到试剂吸附物质。
4）对氢硫基乙烷磺也有效
（d） 以回收Cys 、Met为目加水分解
① 精准秤量1~2mg样品。
② 加入2ml过蚁酸，在0℃放置4~24小时。
③ 添加48%HBr0.3ml。
④ 减压干硬。
⑤ 依从盐酸加水分解办法，减压进行到干硬为止。
⑥ 加入1mla2N-NaOH，放置1小时。
⑦ 在0.05N~a1NCHI，进行PH调制和给一定容量。
五．仪器维护与保养
1、样品解决
严格按照程序解决样品，特别对生理体液样品，更需小心谨慎，加沉淀剂一定要过量，离心所用时间宁长勿短，最后，一定要用0.22μm超滤膜进行超滤后方可上机，以防树脂污染和柱头堵塞。
2、缓冲液配备
缓冲液配备后一方面用360目尼龙沙网过滤缓冲液（粗滤），然后，用全玻璃溶液过滤器装上0.45μm微孔滤膜进行超滤。配制茚三酮缓冲液也应按上述程序进行。三是进样器洗涤液关。工作时，洗涤液要每日必换。
3、管路及部件清洗
　　经常需要进行清洗管路和部件是吸样泵阀及泄液管管路。吸样泵阀清洗环节：将吸样泵止逆阀取下，放入超声波清洗池中，加30度左右温水和几滴洗洁精，超声清洗10～15分钟，如发现仍不干净，可将阀体拆开清洗，冲洗干净后，再组装上（注意安装方向）。吸样泵泄液管清洗：在每次关机时，可将泄液管从阀上卸下，用玻璃注射器（50ml以上并选用恰当型号针头）先用去离子水注射清洗，再用75%乙醇注射清洗。如果管路中沉积物太多，不易清洗干净，或管路已完全堵塞，可将泄液管盘起放入超声波清洗池中，40度温水超声清洗10～15分钟，边清洗边用注射器重复推和抽，使管路里面沉积物逐渐松动，最后完全清除。必要时还可配合细铜丝等工具使用，将沉积物捅开并清洗。在突然断电又不能在短时间内来电状况下，为了防止反映盘管中发生堵塞，也可采用注射器注入去离水办法清洗反映盘管。详细办法是：将混合器（三通）与反映盘管接合部卸下，选用恰当型号针头插入盘管一端，用注射器（50ml以上）注入去离水。如压力太大，可将反映盘管后部倍压线圈拆下另行清洗。待反映液所有被去离子水置换出来后，再将管路接好。注意：1、针头必要水平插入，以防刺破反映盘管管壁；2、凡是有塑料管连接部位，螺帽都需适度旋紧，以防管壁变形，使阻力增大。
4、分析柱保养
　　分析柱及去氨柱保养分两个方面：1、样品及试剂解决以防污染和堵塞，在前面已经提及；2、分析柱再生。合理再生能有效清除树脂及过滤器中残存物，以减少因树脂污染和过滤器堵塞而引起噪声，使仪器可以经常在较低压力下工作，减少泵工作负载，延长分析柱使用寿命。再生详细做法是：开机后运营吸样泵清洗程序（4-2-0），然后，运营分析柱再生程序（1-6-0；2-10-0）。在运营此程序时应注意是，一定要事先将缓冲液泵泄液阀打开，约5分钟后，再将其关闭。这样做可将缓冲管里残留液置换出去，还可较快地使分析柱压力减少。待实验结束关机前，再运营上述程序一次（约30分钟）。

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