川贝母检验统一标准操作作业规程.doc

川贝母检查原则操作规程文献编码：S0P-QC-ZJ-3017-03 题 目 川贝母检查原则操作规程制定部门：质量检查中心颁发部门：质量管理部分发部门：质量管理部、质量检查中心制定人： 日期： 年 月 日 审核人： 日期： 年 月 日批准人： 日期： 年 月 日生效日期： 10 月 1 日变更历史：1.3月制定； 2.7月执行中华人民共和国药典第一次修订； 3.10月执行中华人民共和国药典第二次修订。4.10月1日执行中华人民共和国药典第一增补本第三次修订。 目 ：建立川贝母检查原则操作规程。规范检查操作，保证川贝母质量。合用范畴：合用于川贝母检查。责 任 者：质量管理部经理、质检中心主任、质量检查员。内 容： 1品名：川贝母 2取样：按药材和饮片取样原则操作规程（SOP-QC-ZJ-6065）取样 3检查根据：川贝母内控质量原则（STP-QS-ZJ-3015） 4性状松贝 取本品，置明亮处用肉眼观测，呈类圆锥形或近球型,尺量，高0.30.8cm，直径0.30.9cm。，表面类白色。外层鳞叶2瓣，大小悬殊，大瓣紧抱小瓣，未抱某些呈新月形，习称“怀中抱月”；顶部闭合，内有类圆形，顶端稍尖心芽和小鳞叶12枚；先端钝圆或稍尖，微凹入，中心有1灰褐色鳞茎盘，偶有残存须根。质硬而脆，断面白色，富粉性。气微，味微苦。 青贝 呈类扁球形，高0.41.4cm，直径0.41.6cm。外层鳞叶2瓣，大小相近，相对抱合，顶部开裂，内有心芽和小鳞叶23枚及细圆柱形残茎。 炉贝 呈长圆形，高0.72.5cm，直径0.52.5cm。表面类白色或浅棕黄色，有具棕色斑点。外层鳞叶2瓣，大小相近，顶部开裂而略尖，基部稍尖或较钝。 5鉴别： 5.1仪器：显微镜、超声波清洗机、电子恒温水浴锅、薄层喷雾气压泵、电子天平 5.2试剂与试液 5.2.1试剂：二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、浓氨试液5.2.2试液水合氯醛试液：取水合氯醛50g，加水15ml与甘油10ml使溶解，即得。甘油乙醇试液：取甘油、稀乙醇各1份，混合，即得。碘化钾溶液：取碘化钾16.5g，加水使溶解成100ml，即得。临用新制。稀碘化铋钾试液：取次硝酸铋0.85g，加冰醋酸10ml与水40ml溶解后，即得。临用前取5ml，加碘化钾溶液（410）5ml，再加冰醋酸20ml，加水稀释至100ml，即得。亚硝酸钠乙醇试液：取亚硝酸钠1g，加乙醇使溶解成100ml，即得。5.3对照品与：贝母辛对照品、贝母素乙对照品5.4操作办法 5.4.1按显微鉴别法原则操作规程（SOP-QC-ZJ-6034）检查。松贝、青贝、 取本品粉末10g，过四号筛，平铺于干净白纸上，在明亮处用肉眼观测，本品粉末类白色。挑取少量置载玻片上，滴加水合氯醛试液2滴，将载玻片置酒精灯火焰上方2cm处来回摆动加热至边沿起小泡，即停止加热，补充试液后再加热，直至透化完全。透化后放冷，加甘油乙醇2滴，盖上盖玻片。置显微镜下观测，淀粉粒甚多，广卵形、长圆形或不规则圆形，有边沿不平整或略作分枝状，直径564m，脐点短缝状、点状、人字状或马蹄状，层纹隐约可见。表皮细胞类长方形，垂周壁微波状弯曲，偶见不定式气孔，圆形或扁圆形。螺纹导管直径526m。炉贝 取本品粉末10g，过四号筛，平铺于干净白纸上，在明亮处用肉眼观测，本品粉末类白色。挑取少量置载玻片上，滴加水合氯醛试液2滴，将载玻片置酒精灯火焰上方2cm处来回摆动加热至边沿起小泡，即停止加热，补充试液后再加热，直至透化完全。透化后放冷，加甘油乙醇2滴，盖上盖玻片。置显微镜下观测，淀粉粒广卵形、贝壳形、肾形或椭圆形，直径约至60m，脐点人字状，星状或点状，层纹明显。 5.4.2 取本品粉末10g，置具塞小锥形瓶中加浓氨试液10ml，密塞，浸泡1小时，加二氯甲烷40ml，超声解决1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇O.5mI使溶解，作为供试品溶液。另取贝母素乙对照品，加甲醇制成每1ml含1mg溶液.作为对照品溶液。按薄层色谱法（附录VI B）实验，吸取供斌品溶液16l、对照品溶液2l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液-水(18：2：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，依次喷以稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相似颜色斑点。 5.4.3聚合酶链式反映-限制性内切酶长度多态性办法。 模板DNA提取 取本品0.1 g，依次用75 %乙醇1ml、灭菌超纯水1ml清洗，吸干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉。取20mg，置1.5ml离心管中，用新型广谱植物基因组DNA迅速提取试剂盒提取DNA：加入缓冲液AP1 400 L和RNA酶溶液（10 mg/ml）4L，涡旋振荡，65 水浴加热10分钟，加入缓冲液AP2 130L，充分混匀，冰浴冷却5分钟，离心（转速为每分钟14000转）10分钟；吸取上清液转移入另一离心管中，加入1.5倍体积缓冲液AP3/E，混匀，加到吸附柱上，离心（转速为每分钟13000转）1分钟，弃去过滤液，加入漂洗液700 L，离心（转速为每分钟1转）30秒，弃去过滤液；再加入漂洗液500 L，离心（转速为每分钟1转）30秒，弃去过滤液；再离心（转速为每分钟13000转）2分钟，取出吸附柱，放入另一离心管中，加入50L洗脱缓冲液，室温放置35分钟，离心（转速为每分钟1转）1分钟，将洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2分钟，离心（转速为每分钟1转）1分钟，取洗脱液，作为供试品溶液，置4 冰箱中备用。另取川贝母对照药材0.1 g，同法制成对照药材模板DNA溶液。 PCR-RFLP反映 鉴别引物：5CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3和5GCTACGTTCTTCATCGAT3。PCR反映体系：在200 L 离心管中进行，反映总体积为30 L，反映体系涉及10 PCR缓冲液3 L，二氯化镁（25 mmol/L）2.4 L，dNTP（10 mmol/L）0.6 L，鉴别引物（30 mol/L）各0.5 L，高保真Taq DAN聚合酶（5 U/L）0.2L，模板1L，无菌超纯水21.8 L。将离心管置PCR仪，PCR反映参数：95预变性4分钟，循环反映30次（95 30秒，5558 30秒，72 30秒），72 延伸5分钟。取PCR反映液，置500 L离心管中，进行酶切反映，反映总体积为20 L，反映体系涉及10 酶切缓冲液2 L，PCR反映液6 L，Sma I（10 U/L）0.5 L，无菌超纯水11.5 L，酶切反映在30 水浴反映2小时。另取无菌超纯水，同法上述PCR-RFLP反映操作，作为空白对照。电泳检测 照琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为1.5 %，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRad，供试品与对照药材酶切反映液上样量分别为8LDNA，DNA分子标记上样量为1 L（0.5g/L）。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应位置上，在100250 bp应有两条DNA条带，空白对照无条带。 6检查6.1水分：按水分测定法原则操作规程（SOP-QC-ZJ-6020）烘干法测定，不得过15.0%。6.1.1仪器：鼓风电热恒温干燥箱、电子天平。6.1.2操作办法：接通电子天平电源，启动电子天平，使电子天平预热30分钟。取干净称量瓶，置烘箱内100105干燥2小时，取出，置干燥器中室温放置30分钟，精密称定重量，再置烘箱内100105干燥1小时，取出置干燥器中室温放置30分钟，精密称定重量，直至持续两次干燥后称重差别在0.3mg如下为止。取供试品最粗粉25g，平铺于干燥至恒重扁形称量瓶中，厚度不超过5mm。精密称定，记录数据，打开瓶盖在100105干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时 ，冷却，称重，并记录数据，至持续两次称重差别不超过5mg为止。依照减失重量，计算出供试品中含水量(%)。6.2总灰分：按灰分测定法原则操作规程（SOP-QC-ZJ-6016)总灰分测定法测定，不得过5.0%。6.2.1仪器：节能电阻炉、电子天平、坩锅。6.2.2操作办法：接通电子天平电源，启动电子天平，使电子天平预热30分钟。取干净坩埚，置节能电阻炉内，将坩埚盖斜盖于坩埚上，经加热至600炽灼约1小时，停止加热，待节能电阻炉温度冷却至约300，取出坩埚，置干燥器内，盖好坩埚盖，放冷至室温，精密称定重量，再以同样条件重复操作，直至持续两次干燥后称重差别在0.3mg如下为止。取能通过二号筛并混合均匀粉末23g，置炽灼至恒重坩埚中，在电子天平上精密称定，放入节能电阻炉内，缓缓炽热，至完全炭化呈黑色，逐渐升高温度至500600，停止加热，待节能电阻炉温度冷却至约300，取出观测 ，直至完全灰化，取出坩埚，置干燥器内，盖好坩埚盖，放冷至室温，精密称定重量，再以同样条件重复操作，直至持续两次炽灼后称重差别在0.3mg如下为止。并记录数据。依照残渣重量，计算供试品中总灰分含量。 6.3浸出物：按浸出物测定法原则操作规程（SOP-QC-ZJ-6015）项下热浸法测定，用稀乙醇作溶剂，不得少于9.0%。 6.3.1仪器：鼓风电热恒温干燥箱、电子天平、电子恒温水浴锅。 6.3.2试剂：稀乙醇：取乙醇53ml，加水制成100ml即得。6.3.3操作办法：接通电子天平电源，启动电子天平，使电子天平预热30分钟。取干净蒸发皿，置烘箱内100105干燥1小时，取出，置干燥器中室温放置30分钟，精密称定重量，再置烘箱内100105干燥1小时，取出置干燥器中室温放置30分钟，精密称定重量，直至持续两次干燥后称重差别在0.3mg如下为止。 取能通过二号筛并混合均匀供试品约4g，置250ml锥形瓶中，精密加稀乙醇100ml，密塞，称定重量，静置1小时后连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用稀乙醇补足减失重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25ml，置已干燥至恒重蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于100105干燥3小时 ，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。并记录数据。除另有规定外，以干燥品计算供试品浸出物含量。 6.4二氧化硫残留量：按二氧化硫残留量测定法原则操作规程（SOP-QC-ZJ-6062）测定，不得过150mg/kg。6.4.1仪器：SO2测定装置（1000ml）、电热套、10ml棕色滴定管、250ml锥形 瓶、磁力搅拌器、100ml量筒。 6.4.2试液6mol/L盐酸溶液：取盐酸54ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。淀粉批示液：本液应临用新制。取可溶性淀粉0.5g，加水5ml搅匀后，缓慢倾入100ml沸水中，随加随搅拌继续煮沸2分钟，放冷，倾取上层清液，即得。0.01mol/L碘滴定液： 6.4.3 仪器装置：A为1000ml两颈圆底烧瓶；B为竖式回流冷凝管；C 为（带刻度)分液漏斗；D 为连接氮气流入口；E 为二氧化硫气体导出口； 6.4.4操作办法： 取药材细粉约10g，精密称定W，置两颈圆底烧瓶中， 加水300400ml（应加水至没过氮气导气管下端），取6mol/L盐酸溶液10ml加入带刻度分液漏斗中。锥形瓶里加入水125ml和淀粉批示液1ml作为吸取液，置于磁力搅拌器上不断搅拌。打开冷凝管，将冷凝管上端口处连接一橡胶导气管置于锥形瓶内液面如下。连接导气管入口。开通氮气，调节适当气体流量（氮气流速约为0.2L/min,至蒸馏瓶内有气泡均匀排出）。打开带刻度分液漏斗活塞，使盐酸溶液10ml流入烧瓶中。给两颈烧瓶内溶液加热至沸，并保持微沸约3分钟后开始用碘滴定液（0.01mol/L）滴定，吸取液置于磁力搅拌器上不断搅拌，至吸取液显蓝色或蓝紫色持续30秒钟不完全消褪，记录样品消耗滴定液体积A；并用空白实验校正，记录消耗滴定液体积B。每1ml碘滴定液（0.01mol/L）相称于0.6406mgSO2。C为碘滴定液浓度校正因子 7含量测定 ：按紫外-可见分光光度法原则操作规程（SOP-QC-ZJ-6035）测定。7.1仪器：分光光度计、电子天平、电子恒温水浴锅。7.2试剂：三氯甲烷、甲醇试液0.05溴甲酚绿缓冲液：取溴甲酚绿0.05g，置100ml容量瓶中，加入0.2mol/L氢氧化钠溶液6ml，振摇使溶解，加磷酸二氢钾1g，加水使溶解并稀释至刻度，即得7.3对照品：西贝母碱对照品 7.4操作办法对照品溶液制备 精密称取西贝母碱对照品5mg，置25ml棕色量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，制成浓度为C对（每1ml含0.2mg）溶液，即得。 原则曲线制备 精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4m1、0.6ml、1.0ml，置25ml具塞刻度试管中，分别补加三氯甲烷至10.0ml，再用大肚吸管精密加水5ml、再精密加0.05溴甲酚绿缓冲液2m1，密塞，激烈振摇，转移至分液漏斗中，放置30分钟。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以三氯甲烷试剂为空白试剂，按紫外-可见分光光度法原则操作规程（SOP-QC-ZJ-6035），在415nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制原则曲线。西贝母碱溶液取量0.1ml0.2ml0.4ml0.6ml1.0ml对照液浓度mg/ml0.1C对100.2C对100.4C对100.6C对101.0C对10吸取度 测定法 取本品适量粉碎，取过三号筛粉末约2g，精密称定W样，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液3ml，浸润1小时。加三氯甲烷-甲醇(4：1)混合溶液40ml，置80水浴加热回流2小时，放冷，滤过，滤液置50ml量瓶中，用适量三氯甲烷-甲醇(4：1)混合溶液洗涤药渣23次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(4：1)混合溶液至刻度，摇匀。精密量取体积Vml（25）ml，置25ml具塞试管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10ml使溶解，再用大肚吸管精密加水5ml、再精密加0.05溴甲酚绿缓冲液2m1，密塞，激烈振摇，转移至分液漏斗中，放置30分钟。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以三氯甲烷试剂为空白试剂，按紫外-可见分光光度法原则操作规程（SOP-QC-ZJ-6035），在415nm波长处测定吸光度A样，从原则曲线上读出供试品溶液中西贝母碱浓度C样。 本品按干燥品计算，样品中含总生物碱以西贝母碱(C27H43NO3)量，按下式计算 本品按干燥品计算，含总生物碱以西贝母碱(C27H43NO3)计，不得少于0.055。