实验室分子生物学实验基本操作标准规范及注意项目.docx

试验室分子生物学试验基础操作规范及注意事项一、酶和载体分装酶类和载体：T载体(50 ng/l)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/l）后分装成10 l或20 l；连接酶（solution）按5 l分装；dNTP（10 mM） 分装成50 l；无菌水分装成1 ml；注意：（1）全部分装全部必需用已灭菌管。（2）全部工具酶和载体使用过程均在冰浴中进行。 （3）工具酶、载体和试剂盒等试验室共用物品，用完后必需立即放回原处，以免耽搁她人使用。 （4）当你发觉你使用是最终一管（盒）公用物品时，请立即通知责任人购置，以免耽搁使用。 （5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由硕士轮番负责制备。每人负责六个月。其它试剂则由第一位使用新包装同学分装。因为分子试验工具酶比较轻易失活，必需在冰上进行分装。二、常见抗生素及IPTG配置以氨苄青霉素为例：1准备足够量1.5 mlEP管、两个100 ml离心管、0.22 m水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用具均要进行高压灭菌。2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。3称取2 g氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。4用注射器吸收配制好溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推进注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml离心管中。注意：动作要缓解，使滤出液出口正对着离心管，还要预防染菌。5把100 ml离心管中已除菌氨苄青霉素溶液分装到1.5 mlEP管中，每管0.5 ml。在EP管上做好标识，包含名称、浓度、日期等。6把做好标识盛有氨苄青霉素EP管于-20保留。注意：当你发觉你使用是最终一管抗生素时，请立即通知相关人员立即配制，以免耽搁使用。表1.常见抗生素储存浓度及工作浓度名称储存浓度工作浓度氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/ml50 g/ml100 g/ml卡那霉素（kanamycin）10 mg/ml10 g/ml50 g/ml氯霉素（chloramphenicol）25 mg/ml12.5 g/ml25 g/ml链霉素（streptomycin）50 mg/ml10 g/ml50 g/ml四环素（tetracyyline）10 mg/ml10 g/ml50 g/mlIPTG1 M0.05-0.6 mM三、分子生物学试验中多种试剂和溶液配制分子生物学试验中多种试剂和溶液配制参见分子克隆。四、总DNA提取具体步骤参考试剂盒说明书。注意：革兰氏阳性菌DNA提取时需要加溶菌酶。五、基因扩增1 引物和合成：设计引物序列，发至生工企业进行合成（）。2引物配制：合成后引物先离心至管底，然后按说明书用无菌水稀释至10-50M，分装至无菌EP管中，做好标识（一定要标识浓度！）后，于-20度保留备用。3 PCR反应体系配制：将所需各组分在冰浴中化开后，进行PCR反应体系配制。反应体系及反应参数按不一样聚合酶说明书进行，以transgen easyTaq酶扩增1kb基因序列为例，100 l反应体系为：10buffer 10 l，dNTP (10 mM) 2 l,引物各2 l （10-50M），模板1 l（依据浓度加减体积），Taq酶1 l，ddH2O 82 l（注意：加入次序为：水，buffer，dNTP，引物，模板，酶）。涡旋混匀，分装至四-五管，瞬时离心。注意：若反应时间较长在反应混合液上层加10-20 l 矿物油预防样品在PCR过程中蒸发。4 将管放入PCR仪中，在PCR仪上设置好PCR反应参数， 比如：94 5 min，94 40 sec，Tm 55 1 min， 72 2 min，72 10 min，16 1 h,通常设30个循环。待温度降至16 后停止PCR仪，立即取出样品，不许可过夜。六、琼脂糖核酸电泳1. 电泳缓冲液配制：电泳缓冲液通常为TAE（或TBE）,其配制方法参见表2，先配制50母液放于4度冰箱中，电泳时稀释100倍使用。2. 将制胶模具和梳子冲洗洁净，架好梳子；3. 依据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度琼脂糖凝胶 （表3）：正确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液；4 放入到微波炉内加热至胶粒全部熔化(通常沸三次即好),冷却片刻，倒入制胶模具中，待其凝固；a) 室温下30-45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；b) 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1 mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；c) 在DNA样品中加入1/5-1/10体积上样缓冲液（1% SDS, 50%甘油, 0.05%溴酚蓝），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没凝胶加样孔内；5 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔一端为负)。依据胶长度设定电压，通常5-8 V/cm，电泳20-40 min, 溴酚蓝跑完胶板3/4左右即可；6 电泳完成，关上电源，戴上手套，将胶放入0.5 g/ml溴化乙锭(EB)溶液中，室温下染色5-10 min。7 蒸馏水中漂洗一下，置于紫外灯下或凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并和核酸分子量标准Marker比较被扩增产物大小。假如要切胶回收，最好在观察台上铺上塑料片观察，预防污染和紫外灯引发DNA突变。注意：溴化乙锭（EB）有剧毒，操作时应注意安全，戴手套操作。不过要避免污染染色池和切胶板以外区域。操作完后手套和胶分别放入垃圾桶和回收桶。表2. 电泳缓冲液TAE配方电泳缓冲液配方缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris-乙酸（TAE）0.5：0.02 mol/L Tris-乙酸50：242 g Tris碱0.0005 mol/L EDTA57.1 ml冰乙酸100 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)表3.琼脂糖凝胶浓度和线形DNA最好分辨范围琼脂糖凝胶浓度和线形DNA最好分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA最好分辨范围（bp）0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,000七、回收和连接1. 将切下目标条带根据回收试剂盒说明书进行产物回收；2. 连接前先电泳确定待连接载体和片段浓度。稀释好T 载体浓度为 12.5 ng/l，不用再确定浓度，每次用量为1 l。3. 连接反应体系配制（1）用Solution I连接时，取一只分装Solution I离心管（含5 l Solution I），加入待连接两个DNA样品：载体和片段（载体和片段mol比为1：3-5），加水补足10 l。（2）用T4连接酶5 l连接时，取一只灭菌PCR管，加入10连接buffer 1 l，待连接两个DNA样品：载体和片段（载体和片段mol比为1：3-5），T4连接酶1 l，加水补足10 l。（3）连接至T载体时反应体系通常为：回收PCR产物 4 l, solution I 5 l， 4倍稀释pMD-18T克隆载体(12.5 ng/l）1 l。注意：加入次序为：水，buffer，DNA样品，酶4. 混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。5. 将离心管置于16 孵育4 h以上或过夜。八、E. coli DH5和Bl21感受态细胞制备采取 CaCl2制备法制备E. coli DH5感受态细胞，步骤以下：1 准备试验：（1）准备LB固体培养基和分装于试管（2-5 ml）和三角瓶 （100 ml）液体培养基。（2）分别配制含15%甘油和不含甘油0.1 M CaCl2。（3）准备洁净培养皿、很洁净100 ml离心管2只，1.5 ml EP管50只，1ml和200l枪尖各一盒。（4）将以上培养基和物品高压灭菌。2 在LB平板上活化E.coli DH5。将活化E.coli DH5单菌落接种于成含LB培养基试管中，37 摇床过夜培养。3 第二天按1%接种量接种到含100 ml LB培养基三角瓶中，37 摇床培养至OD600=0.4-0.6 （约2 h）。4 冰浴10 min，倒入灭过菌100 ml离心管中离心，4000 rpm，10 min，4 。5 去掉上清，加20 ml配制好已灭菌0.1 M CaCl2，将菌体打散后静置20 min，4000 rpm离心10 min，去掉上清。6 加1-2 ml 灭菌0.1 M CaCl2 (含15%甘油)制成感受态细胞。将制好感受态细胞分装成50 l 小份保留于-80 冰箱。7 E. coliBl21和BL21(DE3)制备方法同上。注意：（1）全部操作均在冰上进行；（2）整个制备过程必需确保无菌操作；（3）E.coli Bl21，BL21(DE3)，DH5菌种每学期更换一次。九、转 化1. 取50 l感受态细胞于冰浴上融化。2. 加入10 l连接产物或3-5 l纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴20 min。3. 放入42 水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2-10 min。4. 加入0.5 ml不含抗生素LB 液体培养基，于37 培养1 h。5. 将培养物4000 rpm离心3 min，保留约200 l上清 于管中， 将菌体用无菌枪尖轻轻打散，均匀涂布于含100 g/ml Amp+平板表面，平板于37 先正置1-2 h，后倒置培养12-16 h至菌落出现。十、重组子筛选和判定从转化平板上挑取白色菌落，转接至含抗生素Amp+（100 g/ml）LB液体培养基，37 振荡培养过夜。菌液能够用以下三种方法验证是否是阳性转化子。注意：同时培养阴性菌落作为对照！（一）酚抽验证取1 ml菌液12,000 rpm 离心1 min搜集菌体，尽可能倒洁净上清后加入50 l Tris 饱和酚和50 l 水，漩涡震荡5 min充足混匀。12,000 rpm离心10 min后快速取上清进行琼脂糖凝胶电泳。（二）质粒酶切验证1. 根据质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，用未插入片段质粒作为阴 性对照，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳后可依据质粒大小初步判定质粒中是否有插入片段，并推测质粒浓度。2. 利用引物中设计酶切位点或质粒上酶切位点，对质粒进行酶切。依据待切质粒浓度确定要加体积, 选择适宜限制性内切酶和配套Buffer。3. 在离心管中加入以下成份：10Buffer 2 l 待切样品 x l （通常为 5 l 左右） 酶 1 l 10 U/ul加灭菌水补足20 l酶多少并不是一成不变，关键要看待切DNA浓度，假如浓度较低，能够合适少加酶。不要在20 l体系中加入超出2 l 酶，那样轻易产生星号活性。4、混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。5、将离心管置于37 中温育2 h，若待切样品为PCR产物，则可将反应时间合适延长。最长酶切时间要取决于是否会产生星号活性。假如50l 体系加入1l 酶，则可过夜酶切通常不会出现星号活性。6、用未酶切质粒作为对照，琼脂糖电泳判定酶切结果。注意：当酶切样品用于回收而不是判定时，可按百分比合适扩大反应体积。不一样内切酶最适酶活温度不一样，如BamH I最适酶活温度为30 。 双酶切可选择二者活性全部较高Buffer或通用Buffer，但要注意不能有星反应。（三）菌落PCR挑取培养皿上部分菌落或取0.5-1.0 l 菌液作为模板进行PCR扩增，每管反应体系最低可少至10 l，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。若为阳性转化子，可检测到插入目标条带。将判定好阳性转化子菌液500 l 送上海博尚生物技术进行序列测定。注意：冬天温度很低时需做成甘油管样品送测！