实验室分子生物学实验基本操作标准规范及注意项目.docx

试验室分子生物学试验基础操作规范及注意事项

一、酶和载体分装
酶类和载体：T载体(50 ng/μl)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/μl）后分装成10 μl或20 μl；
连接酶（solutionΙ）按5 μl分装；
dNTP（10 mM） 分装成50 μl；
无菌水分装成1 ml；
注意：（1）全部分装全部必需用已灭菌管。
（2）全部工具酶和载体使用过程均在冰浴中进行。
（3）工具酶、载体和试剂盒等试验室共用物品，用完后必需立即放回原处，以免耽搁她人使用。
（4）当你发觉你使用是最终一管（盒）公用物品时，请立即通知责任人购置，以免耽搁使用。
（5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由硕士轮番负责制备。每人负责六个月。其它试剂则由第一位使用新包装同学分装。因为分子试验工具酶比较轻易失活，必需在冰上进行分装。

二、常见抗生素及IPTG配置
以氨苄青霉素为例：
1．准备足够量1.5 mlEP管、两个100 ml离心管、0.22 μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用具均要进行高压灭菌。
2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。
3．称取2 g氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。
4．用注射器吸收配制好溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推进注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml离心管中。
注意：动作要缓解，使滤出液出口正对着离心管，还要预防染菌。
5．把100 ml离心管中已除菌氨苄青霉素溶液分装到1.5 mlEP管中，每管0.5 ml。在EP管上做好标识，包含名称、浓度、日期等。
6．把做好标识盛有氨苄青霉素EP管于-20℃保留。
注意：当你发觉你使用是最终一管抗生素时，请立即通知相关人员立即配制，以免耽搁使用。
表1.常见抗生素储存浓度及工作浓度
名称
储存浓度
工作浓度
氨苄青霉素（ampicillin）
100 mg/ml
50 μg/ml～100 μg/ml
卡那霉素（kanamycin）
10 mg/ml
10 μg/ml～50 μg/ml
氯霉素（chloramphenicol）
25 mg/ml
12.5 μg/ml～25 μg/ml
链霉素（streptomycin）
50 mg/ml
10 μg/ml～50 μg/ml
四环素（tetracyyline）
10 mg/ml
10 μg/ml～50 μg/ml
IPTG
1 M
0.05-0.6 mM

三、分子生物学试验中多种试剂和溶液配制
分子生物学试验中多种试剂和溶液配制参见《分子克隆》。

四、总DNA提取
具体步骤参考试剂盒说明书。注意：革兰氏阳性菌DNA提取时需要加溶菌酶。

五、基因扩增
1． 引物和合成：设计引物序列，发至生工企业进行合成（）。
2．引物配制：合成后引物先离心至管底，然后按说明书用无菌水稀释至10-50μM，分装至无菌EP管中，做好标识（一定要标识浓度！）后，于-20度保留备用。
3． PCR反应体系配制：将所需各组分在冰浴中化开后，进行PCR反应体系配制。反应体系及反应参数按不一样聚合酶说明书进行，以transgen easyTaq酶扩增1kb基因序列为例，100 μl反应体系为：10×buffer 10 µl，dNTP (10 mM) 2 µl,引物各2 µl （10-50μM），模板1 µl（依据浓度加减体积），Taq酶1 µl，ddH2O 82 µl（注意：加入次序为：水，buffer，dNTP，引物，模板，酶）。涡旋混匀，分装至四-五管，瞬时离心。
注意：若反应时间较长在反应混合液上层加10-20 µl 矿物油预防样品在PCR过程中蒸发。
4． 将管放入PCR仪中，在PCR仪上设置好PCR反应参数， 比如：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 sec，Tm 55℃ 1 min， 72 ℃ 2 min，72 ℃ 10 min，16 ℃ 1 h,通常设30个循环。待温度降至16 ℃后停止PCR仪，立即取出样品，不许可过夜。

六、琼脂糖核酸电泳
1. 电泳缓冲液配制：电泳缓冲液通常为TAE（或TBE）,其配制方法参见表2，先配制50×母液放于4度冰箱中，电泳时稀释100倍使用。
2. 将制胶模具和梳子冲洗洁净，架好梳子；
3. 依据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度琼脂糖凝胶 （表3）：正确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液；
4． 放入到微波炉内加热至胶粒全部熔化(通常沸三次即好),冷却片刻，倒入制胶模具中，待其凝固；
a) 室温下30-45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；
b) 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1 mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；
c) 在DNA样品中加入1/5-1/10体积上样缓冲液（1% SDS, 50%甘油, 0.05%溴酚蓝），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没凝胶加样孔内；
5． 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔一端为负)。依据胶长度设定电压，通常5-8 V/cm，电泳20-40 min, 溴酚蓝跑完胶板3/4左右即可；
6． 电泳完成，关上电源，戴上手套，将胶放入0.5 μg/ml溴化乙锭(EB)溶液中，室温下染色5-10 min。
7． 蒸馏水中漂洗一下，置于紫外灯下或凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并和核酸分子量标准Marker比较被扩增产物大小。假如要切胶回收，最好在观察台上铺上塑料片观察，预防污染和紫外灯引发DNA突变。
注意：溴化乙锭（EB）有剧毒，操作时应注意安全，戴手套操作。不过要避免污染染色池和切胶板以外区域。操作完后手套和胶分别放入垃圾桶和回收桶。

表2. 电泳缓冲液TAE配方
电泳缓冲液配方
缓冲液
使用液
浓贮存液（每升）
Tris-乙酸（TAE）
0.5×：0.02 mol/L Tris-乙酸
50×：242 g Tris碱

0.0005 mol/L EDTA
57.1 ml冰乙酸

100 ml 0.5 mol/L EDTA
(pH 8.0)

表3.琼脂糖凝胶浓度和线形DNA最好分辨范围
琼脂糖凝胶浓度和线形DNA最好分辨范围
琼脂糖凝胶浓度
线形DNA最好分辨范围（bp）
0.5%
1,000～30,000
0.7%
800～12,000
1.0%
500～10,000
1.2%
400～7,000
1.5%
200～3,000
2.0%
50～2,000

七、回收和连接
1. 将切下目标条带根据回收试剂盒说明书进行产物回收；
2. 连接前先电泳确定待连接载体和片段浓度。稀释好T 载体浓度为 12.5 ng/μl，不用再确定浓度，每次用量为1 μl。
3. 连接反应体系配制
（1）用Solution I连接时，取一只分装Solution I离心管（含5 μl Solution I），加入待连接两个DNA样品：载体和片段（载体和片段mol比为1：3-5），加水补足10 μl。
（2）用T4连接酶5 μl连接时，取一只灭菌PCR管，加入10×连接buffer 1 μl，待连接两个DNA样品：载体和片段（载体和片段mol比为1：3-5），T4连接酶1 μl，加水补足10 μl。
（3）连接至T载体时反应体系通常为：回收PCR产物 4 μl, solution I 5 μl， 4倍稀释pMD-18T克隆载体(12.5 ng/μl）1 μl。
注意：加入次序为：水，buffer，DNA样品，酶
4. 混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。
5. 将离心管置于16 ℃孵育4 h以上或过夜。

八、E. coli DH5α和Bl21感受态细胞制备
采取 CaCl2制备法制备E. coli DH5α感受态细胞，步骤以下：
1． 准备试验：（1）准备LB固体培养基和分装于试管（2-5 ml）和三角瓶 （100 ml）液体培养基。（2）分别配制含15%甘油和不含甘油0.1 M CaCl2。（3）准备洁净培养皿、很洁净100 ml离心管2只，1.5 ml EP管50只，1ml和200μl枪尖各一盒。（4）将以上培养基和物品高压灭菌。
2． 在LB平板上活化E.coli DH5α。将活化E.coli DH5α单菌落接种于成含LB培养基试管中，37 ℃摇床过夜培养。
3． 第二天按1%接种量接种到含100 ml LB培养基三角瓶中，37 ℃摇床培养至OD600=0.4-0.6 （约2 h）。
4． 冰浴10 min，倒入灭过菌100 ml离心管中离心，4000 rpm，10 min，4 ℃。
5． 去掉上清，加20 ml配制好已灭菌0.1 M CaCl2，将菌体打散后静置20 min，4000 rpm离心10 min，去掉上清。
6． 加1-2 ml 灭菌0.1 M CaCl2 (含15%甘油)制成感受态细胞。将制好感受态细胞分装成50 μl 小份保留于-80 ℃冰箱。
7． E. coliBl21和BL21(DE3)制备方法同上。

注意：（1）全部操作均在冰上进行；（2）整个制备过程必需确保无菌操作；（3）E.coli Bl21，BL21(DE3)，DH5α菌种每学期更换一次。

九、转 化
1. 取50 μl感受态细胞于冰浴上融化。
2. 加入10 μl连接产物或3-5 μl纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴20 min。
3. 放入42 ℃水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2-10 min。
4. 加入0.5 ml不含抗生素LB 液体培养基，于37 ℃培养1 h。
5. 将培养物4000 rpm离心3 min，保留约200 μl上清 于管中， 将菌体用无菌枪尖轻轻打散，均匀涂布于含100 μg/ml Amp+平板表面，平板于37 ℃先正置1-2 h，后倒置培养12-16 h至菌落出现。

十、重组子筛选和判定
从转化平板上挑取白色菌落，转接至含抗生素Amp+（100 μg/ml）LB液体培养基，37 ℃振荡培养过夜。菌液能够用以下三种方法验证是否是阳性转化子。注意：同时培养阴性菌落作为对照！
（一）酚抽验证
取1 ml菌液12,000 rpm 离心1 min搜集菌体，尽可能倒洁净上清后加入50 μl Tris 饱和酚和50 μl 水，漩涡震荡5 min充足混匀。12,000 rpm离心10 min后快速取上清进行琼脂糖凝胶电泳。
（二）质粒酶切验证
1. 根据质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，用未插入片段质粒作为阴 性对照，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳后可依据质粒大小初步判定质粒中是否有插入片段，并推测质粒浓度。
2. 利用引物中设计酶切位点或质粒上酶切位点，对质粒进行酶切。依据待切质粒浓度确定要加体积, 选择适宜限制性内切酶和配套Buffer。
3. 在离心管中加入以下成份：
10×Buffer 2 μl
待切样品 x μl （通常为 5 μl 左右）
酶 1 μl 10 U/ul
加灭菌水补足20 μl
酶多少并不是一成不变，关键要看待切DNA浓度，假如浓度较低，能够合适少加酶。不要在20 μl体系中加入超出2 μl 酶，那样轻易产生星号活性。
4、混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。
5、将离心管置于37 ℃中温育2 h，若待切样品为PCR产物，则可将反应时间合适延长。最长酶切时间要取决于是否会产生星号活性。假如50μl 体系加入1μl 酶，则可过夜酶切通常不会出现星号活性。
6、用未酶切质粒作为对照，琼脂糖电泳判定酶切结果。
注意：当酶切样品用于回收而不是判定时，可按百分比合适扩大反应体积。不一样内切酶最适酶活温度不一样，如BamH I最适酶活温度为30 ℃。 双酶切可选择二者活性全部较高Buffer或通用Buffer，但要注意不能有星反应。
（三）菌落PCR
挑取培养皿上部分菌落或取0.5-1.0 μl 菌液作为模板进行PCR扩增，每管反应体系最低可少至10 μl，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。若为阳性转化子，可检测到插入目标条带。
将判定好阳性转化子菌液500 μl 送上海博尚生物技术进行序列测定。注意：冬天温度很低时需做成甘油管样品送测！