SDS-PAGE电泳标准操作流程.doc

SDS-PAGE电泳标准操作规程（网上）
3.程序：
3.1. 制胶
3.1.1组装胶架 将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。
3.1.2 分离胶的配置
3.1.2.1 10%分离胶配方如下表：
10%胶
蒸馏水
30%Acr-Bis(29:1)
1.5M Tris-Hcl PH 8.8
10%SDS
10%AP
(过硫酸铵)
TEMED
5 ml
1.3 ml
1.7 ml
1.9 ml
0.05 ml
0.05 ml
0.007ml
3.1.2.2 灌胶 混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。
3.1．2.3液封 在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。
3.1.3浓缩胶的配置
3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表：
5%胶
蒸馏水
30%Acr-Bis(29:1)
0.5M Tris-Hcl PH 6.8
10%SDS
10%AP
(过硫酸铵)
TEMED
2 ml
1.4 ml
0.33 ml
0.25ml
0.02 ml
0.02 ml
0.02 ml
3.1.3.2插入制胶梳
混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。
3.2. 电泳
3.2.1 安装电泳槽 将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X tris-gly电泳缓冲液。
3.2.2 样品处理 对于蛋白样品直接取80µl的样品，依次加上20µl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。
3.2.3 加样 用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。
3.2.4 电泳 将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。
3.2.5剥离胶 把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。
3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。
3.4.脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。
3.5.拍照 将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到扫描仪上，拍照。
4. 注意事项
4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD选用10%胶；50KD-30KD选用12%胶；30KD-10KD选用15%胶。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作.4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。
4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。4.6 分离胶高度控制得当，确保有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。4.7 电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。
l 配胶用的试剂，要提前配好：
30%丙烯酰胺贮存液
丙烯酰胺29.2g，亚甲双丙烯酰胺0.8g，混匀后加ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于4℃。

1.5MTris-HCl(pH 8.0)：
Tris base 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至100ml，4℃保存。

1M Tris-HCl(pH 6.8)：
Tris base12.11g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8，定容至100ml，4℃保存。

10% SDS：
电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶，浓盐酸调至pH 7.2，定容至100ml。

10%过硫酸铵（AP）：
1g过硫酸铵加ddH2O至10ml。

l 跑胶用试剂：
电泳缓冲液(pH 8.3
Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解，定容至1000ml。

2´SDS电泳
上样缓冲液：
1M Tris-HCl (pH 6.8) 1.0ml，b-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.4 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚蓝 1.0ml，ddH2O 5.0ml。

考马斯亮蓝染色液：
考马斯亮蓝R250 0.25 g，甲醇45ml，冰醋酸 10ml，ddH2O 45ml

脱色液
甲醇45ml，冰醋酸 10ml，ddH2O 45ml。

操作步骤：
采用垂直式电泳槽装置
1、 安装电泳槽
2、 配制分离胶(12%)（10ml）：
ddH2O
3.3ml
30%丙烯酰胺贮存胶
4.0ml
1.5M Tris-HCl
2.5ml
10% SDS
0.1ml
10% AP
0.1ml
TEMED
4.0μl
混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面水平。（凝胶完全聚合需30-60min）。
3、 配制积层胶（5%）（3ml）：
ddH2O
2.1 ml
30%丙烯酰胺贮存胶
0.5 ml
1M Tris-HCl
0.38 ml
10%SDS
0.03 ml
10%AP
0.03 ml
TEMED
3.0 μl
将分离胶上的水倒去，并用滤纸吸干多余水份，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。
4、待积层胶完全聚合后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽上。
5、样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min， 12000g离心1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白质Marker作平行处理。
6、上样：取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20μl低分子量蛋白Marker作对照。
7、电泳：在电泳槽中加入1´电泳缓冲液，连接电源，电泳时，积层胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止（约需2-3h）。
8、染色：将胶从玻璃板中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，室温4-6h。
9、脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。
10、凝胶摄像和保存：将脱色好的凝胶摄像，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。
注意事项：
1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。
周师姐 试剂配制：
l 30%丙烯酰胺(29:1)配制：称取Acrylamide 29 g、Bisacrylamide 1 g，加入约60 ml的去离子水，充分搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至100 mL，用0.45um滤膜滤去杂质，于中4℃避光保存。
l 5×Tris-Glycine电泳缓冲液的配制：称取Tris-base 15.1 g、Glycine 94 g、SDS 5 g置于1 L烧杯中，加入约800 mL的去离子水，搅拌溶解；加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。
l 10 %过硫酸胺(AP)的配制：称取过硫酸胺0.1 g 溶于1.0 mL 灭菌的去离子水中，充分混匀后于4 ℃避光保存，保存时间不能超过1周。
l 10 % SDS的配制：称取SDS 10 g溶于100 mL灭菌的去离子水中并于50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
l 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)：称取Tris-base 45.43 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；用浓盐酸调pH至8.8，最后用去离子水定容至250 mL，室温下保存。
l 0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)：称取Tris-base 15.14 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；用浓盐酸调pH至6.8，最后用去离子水定容至250 mL，室温下保存。
l 12 % SDS-PAGE 分离胶：30%丙烯酰胺4 mL、去离子水3.3 mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL、10 % AP 100 μL、10 % SDS 100 μL和TEMED 5 μL充分混匀后灌胶。
l 15 % SDS-PAGE 分离胶：30%丙烯酰胺5 mL、去离子水2.3 mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL、10 % AP 100 μL、10 % SDS 100 μL和TEMED 5 μL充分混匀后灌胶。
l 5 % SDS-PAGE 浓胶：30%丙烯酰胺0.5 mL、去离子水2.1 mL、0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.375 mL、10 % AP 30 μL、10 % SDS 30 μL和TEMED 5 μL充分混匀后灌胶。
l 考马斯亮蓝染色液的配制：称取1 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中；量取250 mL异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解；加入100 mL的冰醋酸，搅拌均匀；加入650 mL去离子水，搅拌均匀；用滤纸除去颗粒物质后，室温保存备用。
l 脱色液的配制：量取冰醋酸 100 mL、乙醇50 mL，加去离子水定溶至1L，搅拌均匀，室温保存备用。

l 转移缓冲液的配制：称取Tris-base 1.45 g、甘氨酸7.2 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；加入100 mL甲醇，最后用去离子水定容至500 mL，室温下保存备用。
l 洗膜缓冲液(TBST)的配制：称取NaCl 8.8 g、Tris-base 2.42 g，向烧杯中加入约800 mL去离子水，充分搅拌溶解；用1 M HCl将溶液的pH值调至7.5，加入0.5 mL Tween 20后充分混匀；加去离子水将溶液定容至1 L后，于4 ℃保存备用。
l 封闭缓冲液的配制：称取0.5 g脱脂奶粉溶于10 mL TBST缓冲液中，充分混匀后备用。
0.1 M 甘氨酸缓冲液配制：称取0.75 g甘氨酸加入90 mL去离子水，充分溶解后用pH计将pH值调至2.5，用去离子水定容至100mL后用0.22 µm 微孔虑膜过滤除菌后，将其分装并于4 ℃保存备用。
l 1 M Tris-HCl 缓冲液的配制：称取12.1g Tris-base，加入90 mL去离子水，充分溶解后用pH计将pH值调至7.5，用去离子水定容至100mL备用。
l 银染固定液：30 % 的乙醇，10%的乙酸。
l 银染氧化液：称取0.7 g高碘酸溶于100 mL去离子水，充分混匀备用。
l 银染显色液：浓度为0.005 g/L的柠檬酸，0.02 %的甲醛。
l 银氨溶液：浓度为0.67 % 的硝酸银，0.33 %的氨水，0.8 g/L的NaOH。