个体化医学检测微阵列基因芯片关键技术标准规范.doc

个体化医学检测
微阵列基因芯片技术规范

序言
微阵列基因芯片是基于DNA分子杂交技术原理研制，经过探针结合碱基互补序列单链核酸，从而确定其对应序列来识别基因或其产物。能够同时快速检测多个基因及其多个位点，在多态性分析、突变分析、基因表示谱测定及杂交测序等多领域含有广泛应用价值。
临床诊疗技术使用微阵列基因芯片，可快速判定病原体、检测遗传突变及基因表示，更早更方便检测肿瘤基因标志，检测药品反应和代谢相关基因多态性来指导临床个体化诊疗。
本规范意在对个体化医学检测中采取微阵列基因芯片检测核酸序列和基因表示进行通常性技术指导，不包含行政审批要求。
本规范由全国生物芯片标准化技术委员会（SAC/TC 421）提出。
本规范起草单位：全国生物芯片标准化技术委员会、清华大学医学院、生物芯片北京国家工程研究中心、北京博奥医学检验所。
本规范起草人：项光新、李元源、王辉、邓涛、孙义民、张治位、张川、邢婉丽、程京。
目录
1.适用范围 1
2.申明/警告 1
3.术语和定义 1
4.样本处理 2
4.1样本类型 2
4.2样本采集、运输和保留 3
4.3样本质量确保 3
4.4样本信息保留 3
5.检测各步骤分述 4
5.1核酸分离 4
5.2核酸定量（如适用） 4
5.3核酸扩增和标识 4
5.4芯片杂交 5
5.5信号采集和数据分析 5
6.结果汇报 5
7.质量控制 5
8.注意事项 6
9.参考文件 7
1.适用范围
本规范适适用于医疗机构开展微阵列基因芯片个体化医学检测服务。
检测服务需遵照国家卫生主管部门或各专业协会公布疾病诊疗指南或国家卫生计生委医政医管局个体化医学检测技术教授委员会公布个体化医学检测指南。

2.申明/警告
本规范所称微阵列基因芯片诊疗技术是指从医疗机构取得临床样本中，提取核酸（DNA或RNA），进行必需扩增和标识，标识后靶标和基因芯片进行分子杂交，经过基因芯片扫描仪器取得基因芯片杂交图像和数据，经计算机程序分析，并给出检测汇报全过程。

3.术语和定义
（1）聚合酶链反应 polymerase chain reaction（PCR）
聚合酶链反应或多聚酶链反应是一个对特定DNA或RNA片段在体外进行快速扩增方法。
（2）杂交 hybridization
含有一定同源序列两条核酸单链（DNA或RNA）能够经过氢键方法，按碱基互补配对标准相结合。
（3）突变 mutation
是细胞中DNA核苷酸序列发生了稳定可遗传改变。
（4）点反复 spot replicates
每种探针在芯片上每个阵列中反复次数。
（5）探针 probe
能够和靶标特异性结合分子，多数情况下探针固定在基片上。
（6）质控探针quality control probe
用来监控芯片表面化学修饰、样品制备和反应过程等步骤质量探针。该探针只和反应体系中外加带有可检测标识物靶标发生特异性结合，故可用于监控探针和基片结合质量及探针和靶标结合质量等整个反应过程质量。
（7）表面化学修饰质控探针 surface modification control probe
微阵列基因芯片上用来质控基片表面化学修饰质量探针。
（8）内标探针 internal control probe
微阵列基因芯片上用来质控检测过程中核酸提取、扩增反应、芯片杂交反应等过程是否正常探针。
（9）阳性质控探针 positive control probe
设置在微阵列基因芯片上质控探针，不管被检测样品结果怎样，均能产生能够被识别信号。
（10）阴性质控探针 negative control probe
设置在微阵列基因芯片上质控探针，不管被检测样品结果怎样，均不会产生可被识别信号。

4.样本处理
4.1样本类型
样本类型能够是全血、滤纸干血斑、新鲜组织、穿刺组织、冰冻组织、石蜡包埋组织、脑脊液、骨髓、羊水、毛囊、精液、粪便、尿液、脱落细胞、培养细胞、其它体液（如痰液）等。
4.2样本采集、运输和保留
样本采集、运输和保留须遵照《全国临床检验操作规程(第四版)》和《个体化医学检测质量确保指南》，其中新生儿滤纸干血斑采集须符合《新生儿遗传疾病筛查血片采集技术规范》。样本采集种类和采集量，如使用经CFDA同意商品试剂，须根据所使用商品微阵列基因芯片检测试剂盒说明书要求。
样本一经采集，则应尽可能快送至检测试验室。对于提取DNA样本，能够在室温（18〜25℃）下运输，尽可能在8 h之内抵达。如条件许可，样本应采取冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。如为RNA，短时间内运输如10 min左右，可室温下运输，如为较长时间，则应在加冰条件下运输，提议在4 h送至试验室。如条件许可，应使用液氮或保留在特殊试剂中运输。
对于检测靶标为DNA样本，在2～8℃可保留3天。对于检测靶标为RNA样本，一旦采集送到试验室后，则应在-20℃以下冻存。如为血循环中RNA，最好不要使用血清样本，而应使用EDTA抗凝立即分离后血浆样本。临床体液样本长久（超出两周）保留应在-70℃下。
4.3样本质量确保
（1）严格根据样本采集规范进行采集，正确运输，保留样本；对采集、运输和保留过程不符规范样本，给予拒绝接收。对多种样本类型应按检测要求建立采集标准操作程序（SOP）。
（2）正确进行样本处理，严格根据核酸提取试剂盒说明书操作。
（3）有专用样本核酸提取操作室，并配置对应专用仪器设备。
（4）设定专员保管制度，具体统计样本信息，确保样本信息不丢失、错位。
4.4样本信息保留
被检测样本要求唯一编号，试验前仔细查对和检验。试验室须含有样本保留基础条件，须配置数据保留及确保数据安全软、硬件设施，相关数据保留不少于5年。

5.检测各步骤分述
5.1核酸分离
采取微阵列基因芯片说明书要求方法或指定商品化试剂盒。提取RNA时，须快速灭活RNA酶预防对RNA降解，须严格遵照已经证实行之有效提取方法和操作规范，比如须佩戴一次性手套口罩、使用RNase-free试剂耗材等。
5.2核酸定量（如适用）
使用紫外分光光度计法或荧光染料法。在检测核酸浓度时须注意：一是检测核酸浓度分光光度计（或染料法使用酶标仪）须建立标准操作程序，并注意维护；二是每次检测前，须同时检测已知浓度对照样本，确保浓度测定正确。
确定特定检测芯片最低检测限和检测范围，所提取核酸浓度和质量须能满足微阵列基因芯片检测需要，必需时纯化、稀释或浓缩。举例来说，遗传性耳聋基因检测芯片能够设定最低检测限为100 ng/μL人基因组DNA，检测范围为100 ng/μL至300 ng/μL人基因组DNA，核酸纯度OD260/280=1.7-2.0，那么需要从临床血液样本中提取核酸，并用分光光度计测定浓度，进行必需纯化、稀释或浓缩以满足要求；若芯片设定最低检测限为2 ng/μL人基因组DNA，检测范围为2 ng/μL至50 ng/μL人基因组DNA，核酸纯度OD260/280=1.7-2.0，那么能够从临床血液、血斑等说明书中标识样本中提取核酸，必需时用分光光度计测定浓度，和进行纯化、稀释或浓缩以满足要求。再举例，检测结核分枝杆菌微阵列芯片，对从临床痰液中提取核酸，若说明书中已经要求了具体步骤，并指出无须采取分光光度计检测，那么能够省略核酸定量。
5.3核酸扩增和标识
扩增反应（如PCR、体外转录等）须遵照《医疗机构临床基因扩增检验试验室管理措施》，预防污染。
荧光标识为常见样品标识方法，也能够对核酸样品进行纳米金或磁珠等标识。DNA样品可在核酸扩增同时进行标识。当进行RNA表示谱分析时，首先在体外把RNA反转录成cDNA，然后进行体外扩增和荧光标识。必需时对产物进行纯化。
5.4芯片杂交
按对应检测项目标操作说明将标识扩增产物和杂交缓冲液混合，加到微阵列基因芯片上，放置于适宜温度下杂交。杂交完成后，将芯片进行洗涤干燥。
5.5信号采集和数据分析
使用基因芯片荧光扫描仪检测微阵列基因芯片时，必需定时对扫描仪进行校准，通常为每七天一次。设置适宜扫描参数，由软件自动分析得到信号值。需要采取专用算法程序得到检测结果，须由专业人员根据要求步骤进行分析。
对于分析软件判定为检测失败或检测位点信号丢失样本，须进行重新检测。重新检测过程同首次检测一样，包含核酸提取、扩增、标识，芯片杂交和后续图像扫描及数据分析。

6.结果汇报
被检测样本检测汇报须由专业结果汇报系统根据统一标准格式自动打印出汇报，并给出具体检测结果。检测汇报必需说明检测方法不足和适用范围。
检测汇报须由专业人员（含有对应资质医师）向被检测者进行解读。

7.质量控制
（1）微阵列基因芯片须符合中国国家标准化管理委员会公布《DNA微阵列芯片通用技术条件》（GB/T 28639-）所要求性能要求。在每个阵列中应设置表面化学修饰质控探针、阳性质控探针、阴性质控探针、内标质控探针和空白对照。
（2）微阵列基因芯片须经过分析性能验证，包含检测灵敏度、阳性符合率、阴性符合率、批内反复性。用灵敏度参考品对抽检微阵列基因芯片进行检测，灵敏度测定结果应符合对应产品标准要求。用阳性参考品对抽检微阵列基因芯片进行检测，测定阳性符合率应符合对应产品标准要求。用阴性参考品对抽检微阵列基因芯片进行检测，测定阴性符合率应符合对应产品标准要求。用反复性参考品对同一批生产最少2张芯片10个子阵列平行检测，各次测定结果应正确一致。
（3）检测相关仪器须取得CFDA医疗器械注册证书。仪器需定时维护和校验。
（4）临床基因芯片检测试验室须根据《医疗机构临床基因扩增检验试验室管理措施》开展室内质量控制，并参与室间质量评价或进行有效试验室间比对。
（5）须建立基因芯片诊疗技术相关器材登记制度，确保基因芯片、基因提取标识和分子杂交试剂起源可追溯。不得违规反复使用一次性器材和试剂。
（6）检测人员上岗前须取得临床基因扩增检验试验室技术人员培训证书，同时相关操作须符合《试验室生物安全通用要求》（GB19489-）。

8.注意事项
（1）建立健全微阵列基因芯片检测及相关数据保密制度，对临床微阵列基因芯片检测取得基因诊疗数据，应确保仅用于被检者本人诊疗和基于提升诊疗水平所进行医学科学研究。未经被检测者许可不得随意公开，传输被检测者检测结果。
（2）包含遗传基因信息临床检测项目，被检者须签署知情同意书。

9.参考文件
[1] GB/T 27990-，生物芯片基础术语。
[2] GB/T 28639-，DNA微阵列芯片通用技术条件。
[3] GB 19489-，试验室生物安全通用要求。
[4] 卫生部办公厅。基因芯片诊疗技术管理规范(试行)。
[5] 卫生部办公厅。医疗机构临床基因扩增检验试验室管理措施。
[6] 卫生部办公厅。新生儿疾病筛查技术规范（）。
[7] 卫生部医政司。全国临床检验操作规程(第三版)。南京：东南大学出版社，
[9] 卫计委医政医管局。个体化医学检测质量确保指南。待同意。
[10] Clinical and laboratory standands institute (CLSI). Diagnostic nucleic acid microarrays, approved guideline. CLSI document MM12-A (ISBN 1-56238-608-5).
[11] Clinical and laboratory standands institute (CLSI). Collection, transport, preparation, and storage of specimens for molecular methods; approved guideline. CLSI document MM13-A (ISBN 1-56238-591-7).
[12] 邢婉丽，程京。生物芯片技术教程。北京：清华大学出版社，