NY∕T 4188-2022 化学农药 大型溞繁殖试验准则.pdf

2022?11?11发布2023?03?01实施化学农药大型繁殖试验准则17中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX65.020CCS B41882022Chemical pesticidesGuideline for Daphnia magna reproduction test中华人民共和国农业农村部发 布N Y/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.本文件起草单位:农业农村部农药检定所.本文件主要起草人:黄健、陈朗、周欣欣、安雪花、赵榆、常艳茹、吕露、王菲迪、杜丽娜、袁善奎、刘琼.N Y/T 化学农药大型溞繁殖试验准则范围本文件规定了化学农药对大型溞繁殖影响试验的材料与条件、主要仪器设备、试验步骤、质量控制、数据分析和试验报告等的基本要求.本文件适用于为化学农药登记而进行的大型溞繁殖影响试验,其他类型的农药可参照使用.规范性引用文件本文件没有规范性引用文件.术语和定义下列术语和定义适用于本文件.亲溞p a r e n t a n i m a l s试验开始时的受试雌溞.冬卵d o r m a n t e g g大型溞进行有性生殖所产受精卵.繁殖量 r e p r o d u c t i v eo u t p u t试验期间亲溞所产的存活幼溞数.无可观察效应浓度n oo b s e r v e de f f e c t c o n c e n t r a t i o n,N O E C在一定暴露期内,与对照组相比,对受试大型溞在统计学意义上(p )未产生显著影响的最高被试物浓度.注:单位为毫克有效成分每升(m ga i/L)或微克有效成分每升(ga i/L).最低可观察效应浓度 l o w e s t o b s e r v e de f f e c t c o n c e n t r a t i o n,L O E C在一定暴露期内,与对照组相比,对受试大型溞(繁殖量和死亡率)在统计学意义上(p )产生显著影响的最低被试物浓度.注:单位为毫克有效成分每升(m ga i/L)或微克有效成分每升(ga i/L).x效应浓度xe f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o n,E Cx在一定暴露期内,引起大型溞繁殖量下降x的被试物浓度.注:单位为毫克有效成分每升(m ga i/L)或微克有效成分每升(ga i/L).试验概述将被试物按等比配制一系列不同浓度的试验溶液,将出生 h内的非头胎幼雌溞(亲溞)暴露于试验溶液中开始试验.从亲溞开始繁殖第批幼溞开始,每天对每只亲溞所产幼溞的存活数和死亡数(包括死胎数)进行计数与记录.试验周期为 d.试验结束时,对每只存活亲溞繁殖的存活幼溞总数和每只亲溞从头胎开始每天所产的存活幼溞数进行统计分析,确定无可观察效应浓度(NO E C)、最低可观察效应浓度(L O E C)和x效应浓度(E Cx,如可能),评价被试物对大型溞繁殖能力的影响.N Y/T 材料和条件 受试生物 受试生物为大型溞(D a p h n i am a g n aS t r a u s).大型溞保种期间应保持良好的培养条件,使其处于孤雌生殖状态,避免出现雄溞和冬卵,以及死亡率高()、头胎延迟、体色异常等现象.试验前,大型溞应在试验条件下驯养至少周.驯养期间,大型溞的培养条件(如光照、温度、培养液、饲喂量等)应与试验条件相似.试验开始时,应选用同一个健康母系所产、出生 h内的非头胎幼雌溞作为受试亲溞.被试物农药原药或制剂.试验前应收集被试物的基本信息,包括但不限于以下数据.a)结构式;b)纯度;c)溶解性;d)蒸气压;e)光化学稳定性;f)试验条件下的稳定性;g)p Ka;h)正辛醇/水的分配系数(P o w);i)大型溞急性毒性试验结果等.试验容器试验容器应采用玻璃、不锈钢或其他化学惰性材质,尽量避免硅酮管、硅胶密封圈等与大型溞培养液及试验溶液接触.培养液 除被试物含有金属离子外,一般情况下宜使用E l e n d tM 和E l e n d tM 培养液,配制方法按附录A执行.如使用其他培养液,其组分中不应含有海藻、土壤提取液等组分不明确的添加物.培养液中含有组分不明确的添加物(尤其是含有碳组分)时,应在试验报告中详细说明.添加藻类食物之前应测定培养液/试验液中的总有机碳(TO C)和/或化学需氧量(C O D),TO C应m g/L.饲喂 饲料选择试验期间应选用浓缩的藻细胞悬浮液作为亲溞食物,如普通小球藻(C h l o r e l l av u l g a r i s)、近头状尖胞藻(R a p h i d o c e l i s s u b c a p i t a t a)(原名P s e u d o k i r c h n e r i e l l as u b c a p i t a t a,S e l e n a s t r u mc a p r i c o r n u t u m)或近具刺链带藻(D e s m o d e s m u s s u b s p i c a t u s)(原名S c e n e d e s u m s s u b s p i c a t u s).可先对藻细胞液进行离心处理,去除上清液后再加入大型溞培养液以获得浓缩的藻细胞悬浮液.饲喂量 大型溞饲喂量宜为每天每溞 m g有机碳(C)m gC.藻细胞悬浮液的碳含量可通过替代指标(如藻细胞数或吸光度)进行测量和计算.各实验室应建立碳含量与替代指标之间的线性图,详见附录B.该线性图应至少每年校准一次,且当藻类的培养条件发生变化时,应增加校准频率.饲喂频率 宜每天饲喂.半静态试验中,应至少每周饲喂次(如更换试验溶液时).尽量使用充分浓缩的藻细胞悬浮液,减少食物添加对暴露浓度的稀释.流水式试验中应详细描述饲喂量.N Y/T 负载率 半静态试验中,亲溞应分开培养,即每个容器只,容器中试验溶液体积为 mL mL.可根据被试物浓度分析的需要适当增加试验溶液体积,也可将各重复试验溶液合并后进行分析.若试验溶液体积超过 mL,需加大饲喂量,使其满足饲喂量标准.光照条件光照/黑暗时间比为 hh.水面处光强 E/m/s E/m/s(或 l x l x).温度条件试验溶液的温度应控制在 .同一个试验中,试验溶液的每日温度变化范围不应超过(如 ),试验中宜增加个试验容器专门用于实际水温的持续监测.其他条件试验开始时和试验期间溶解氧浓度应m g/L.p H应在,且同一个试验中变化范围不应超过 个单位.硬度应 m g/L(以C a C O计).试验期间不应进行曝气处理.主要仪器设备 电子天平(感量 g以上).显微镜.p H计.溶解氧测定仪.照度计.硬度计.分析仪器.TO C测定仪或C O D测定仪.环境条件控制和监测的相关设施与设备等.试验步骤 试验方法的选择根据被试物的特性选择半静态法或流水式法进行试验.采用半静态法时,试验溶液中被试物的浓度应保持在设定浓度或初始测定浓度的.对于难处理农药(难溶或略溶于水、易挥发、易降解、易被吸附、疏水性、离子型或多组分农药等),参考NY/T 选择试验方法.预试验参考被试物及其类似化合物对溞类或其他水生生物的毒性等资料,视需要开展预试验.预试验按正式试验条件,以较大间距设置若干组浓度.试验周期为 d,当根据阶段性试验结果能够预估出毒性效应水平时,可提前结束预试验.正式试验正式试验应至少设置个处理组和个空白对照组.处理组浓度按几何级数排列,公比 .对于难溶于水的被试物,可用少量对大型溞无毒的有机溶剂(如丙酮、N,N 二甲基甲酰胺等)、乳化剂或分散剂助溶,但助溶剂/助分散剂的用量应尽可能小(m g/L或 mL/L),且在各处理组和对照组中的用量一般应尽可能保持一致.此外,还应增设助溶剂/助分散剂对照组.对于半静态试验,每一处理组和对照组应至少 只溞,单只培养.对于流水式试验,每一处理组和对照组至少 只溞(以 只为宜),分配到至少个重复中.试验开始时,应将亲溞随机分配至各试验容器中.试验周期为 d.限度试验N Y/T 限度试验浓度为 m ga i/L或最大溶解度浓度(二者取较低值).限度试验中,处理组与对照组的各项观测指标应在统计学意义上无显著差异(p ).染毒 用培养液将被试物配制成一系列不同浓度的试验溶液,加入试验容器中.向试验容器中加入试验用幼溞.使用宽口径吸管将幼溞加到液面以下.将试验容器置于光照培养箱或人工气候室等设备/设施中,随机摆放.半静态试验中培养液的更换频率 半静态试验中培养液的更换频率取决于被试物的稳定性,但至少每周更换次(如每周一、周三和周五).若被试物在最长的更换周期内(如d)不稳定(浓度变化范围超出设定浓度或初始测定浓度的 ),则应增加更换频率,或使用流水式暴露系统.更换试验溶液时,应采用宽口径吸管将亲溞从暴露后的试验溶液(旧液)转移至新配制的试验溶液(新液)中.转移时,随溞转移的旧液体积应尽可能小,尽可能不改变新液体积.观察与测定 亲溞死亡率试验期间应每天记录受试亲溞的死亡或受抑制情况.大型溞死亡或受抑制的判定标准是:不能游动,或轻晃试验容器 s内未观察到附肢或后腹活动.繁殖量记录受试亲溞的头胎时间及之后几胎的繁殖时间.从头胎开始,应每天从试验容器中移出幼溞,并记录存活幼溞数、死亡幼溞数、死胎数,以及出现雄溞(雄溞的鉴别见附录C)和冬卵的情况等.其他参数 试验结束时,测定亲溞体长(不含尾刺,精确到 mm).宜测定的其他参数还包括每只亲溞的产溞次数和产溞总数、每只亲溞每胎产溞数、雄性幼溞数和冬卵数等.水质测定定期测定对照组和最高浓度处理组新液与旧液中的溶解氧浓度、温度、硬度及p H,至少每周测定次.被试物浓度检测 半静态试验中,试验浓度可保持在设定浓度的 时,可在试验第周更换试验溶液前后测定最高和最低浓度处理组新、旧试验溶液中的被试物浓度,之后至少每周测定次;否则,应测定所有浓度处理组新、旧试验溶液中的被试物浓度.但有充分证据表明初始浓度可重复且稳定时(旧液浓度保持在初始测定浓度的 ),第周周可仅测定最高和最低浓度处理组中的被试物浓度.试验溶液更换前的旧液可仅测定各处理组的其中个重复.流水式试验开始前,应对流水式系统的药液输送和稀释能力进行确认.试验期间,应每天检查试验液与储备液的流速.试验第周应进行至少次试验液浓度测定,此后至少每周次.试验期间,若被试物浓度偏差保持在设定浓度或初始测定浓度的,以设定浓度或初始浓度表示试验结果;若被试物浓度偏差超出设定浓度或初始测定浓度的,应以时间加权平均浓度表示试验结果(时间加权平均浓度的计算方法见附录D).质量控制质量控制条件包括:试验结束时,对照组亲溞死亡率应;试验结束时,对照组平均每只存活亲溞所产存活幼溞数应 只,且变异系数(C V);当试验中雄性幼溞数量表现为敏感指标时,对照组的雄性幼溞率应.N Y/T 数据分析 数据整理 繁殖量指标应基于每个重复中亲溞所产的存活幼溞总数来计算.若亲溞在试验期间意外死亡(因意外导致的、与被试物无关的死亡)或偶然死亡(不知道原因的、与被试物无关的死亡),或转化成雄溞,则数据分析过程中应排除此重复.采用以下个繁殖量指标分别统计繁殖效应的L O E C、NO E C和E Cx及其置信区间(如可能):a)试验期间每只非偶然、非意外死亡的亲溞所产存活幼溞总数,包括由于剂量效应死亡的亲溞和存活的亲溞所产存活幼溞总数;b)每只存活亲溞所产存活幼溞总数.从上述种统计方式得到的结果中选择L O E C、NO E C和E Cx的较低值表征被试物对大型溞繁殖的影响.统计方法 统计分析前,先对浓度效应关系进行直观判断(是否表现为单调性),再对试验数据进行正态分布性检验(如S h a p i r o W i l k检验)和方差齐性检验(如L e v e n es检验),并选用适宜的统计方法比较处理组与对照组之间的差异.当毒性效应数据呈现为非单调性浓度效应关系时,如果数据(或经转换后的数据)服从正态分布且方差齐性,采用D u n n e t t检验法对处理组与对照组之间的差异进行比较,否则,采用配对检验方法(如D u n n s检验或M a n n Wh i t n e y检验等).当毒性效应数据呈现为单调性浓度效应关系时,如果数据(或经转换后的数据)服从正态分布且方差齐性,采用W i l l i a m s检验法对处理组与对照组之间的差异进行比较,否则,采用s t e pd o w nJ o n c k h e e r e T e r p s t r a检验等方法.当限度试验数据服从正态分布且方差齐性时,采用S t u d e n t sT检验比较处理组与对照组之间的差异,否则,采用W e l c h检验或M a n n Wh i t n e y检验等方法.若设置了溶剂对照组,应首先采用T检验或M a n n Wh i t n e y检验等方法对溶剂对照组和空白对照组的统计指标进行差异显著性比较(p ).当差异不显著时,将组数据合并后再与处理组进行比较;当差异显著时,应仅使用溶剂对照组数据进行统计分析.试验报告试验报告应至少包括下列内容.a)被试物:通用名、标称含量、剂型、样品批号、外观、重量、生产日期、有效日期、来样日期、生产企业、生产企业地址、储存条件等.b)有效成分:中英文通用名称、美国化学文摘号(C A S号)、化学名称、分子式、结构式、相对分子量、外观、溶解度、稳定性等内容,并注明出处.c)受试生物:中文学名、拉丁名称和来源等.d)试验条件:)试验程序(半静态或流水式试验,体积,负载率等);)温度、光照周期与光强;)试验设计(重复数,每一重复受试大型溞数量);)所用培养液;)培养液中如包含额外的有机添加物,报告其成分、来源、制备方法、储备液中的TO C/C O D,N Y/T 试验液中TO C/C O D的估算值;)饲喂的详细资料,包括数量和食物类型(如藻名、品系、培养条件、藻液浓度)等;)储备液和试验溶液的制备方法和更换频率,包括任何有机溶剂、分散剂的使用等.e)试验结果:)被试物稳定性;)被试物浓度分析结果,分析方法的回收率、检出限与定量限等;)水质测定结果(p H、温度、溶解氧、TO C和/或C O D、硬度等);)每只亲溞所产存活幼溞数;)亲溞死亡数及其死亡时间;)对照组繁殖量的变异系数(基于试验结束时每只存活亲溞所产存活幼溞总数);)被试物胁迫下每只非偶然/意外死亡的亲溞所产存活幼溞总数的剂量效应曲线;)L O E C、NO E C及其统计分析方法及相关统计参数(如p).并说明该结果为基于试验期间每只非偶然/意外死亡的亲溞所产存活幼溞总数还是每只存活亲溞所产存活幼溞总数统计而来;)如可能,E Cx及其置信区间(如 或者),剂量效应曲线,曲线斜率及其标准误差;)其他可观察或测定的生物学效应:如亲溞生长情况等,并对观察到的结果予以解释;)试验偏离及相关的解释说明.N Y/T 附录A(规范性)E l e n d tM 和E l e n d tM 培养液A 储备液的配制先用合格的去离子水、蒸馏水或反向渗透水(电导率 s/c m)配制储备液,再用储备液制备储备液,详见表A .A M 和M 培养液的配制用储备液、表A 指定的常量元素和维生素配制E l e n d tM 和E l e n d tM.A 培养液的更换若试验所用培养液与日常培养液不同,试验前应设置至少个月驯养期.驯养期间,将大型溞从原培养液中取出,转入含 新培养液的培养液中,然后逐步增大新培养液的比例到,最后到 .表A 储备液、储备液的配制组分浓度,m g/L与M 培养液的浓度关系储备液将储备液加入水中的量,m L/LE l e n d tM E l e n d tM 储备液(单一物质)HB O 倍 M n C l HO 倍 L i C l 倍 R b C l 倍 S r C l HO 倍 N a B r 倍 N aM o O HO 倍 C u C l HO 倍 Z n C l 倍 C o C l HO 倍 K I 倍 N aS e O 倍 NHVO 倍 F e E D T A溶液a 倍 a分别制备 m g/LN aE D T A和 m g/LF e S O,等体积混合后立即灭菌,即得到F e E D T A溶液.表A E l e n d tM 和E l e n d tM 的配制组分浓度,m g/L与E l e n d tM 培养液的浓度关系为制备E l e n d tM 和E l e n d tM 培养液,水中加入各组分的量,m L/LE l e n d tM E l e n d tM 储备液(微量元素混合液)倍 常量营养储备液(单一物质)C a C l HO 倍 M g S O HO 倍 K C l 倍 N a HC O 倍 N Y/T 表A (续)组分浓度,m g/L与E l e n d tM 培养液的浓度关系为制备E l e n d tM 和E l e n d tM 培养液,水中加入各组分的量,m L/LE l e n d tM E l e n d tM 常量营养储备液(单一物质)N aS i O HO 倍 N a NO 倍 KHP O 倍 KH P O 倍 混合维生素储备液a 倍 a混合维生素储备液由盐酸硫胺(维生素B)、氰钴胺(维生素B)和钙长石(维生素H)配制而成,浓度分别为盐酸硫胺(维生素B)m g/L,氰钴胺(维生素B)m g/L,钙长石(维生素H)m g/L.混合维生素储备液应小瓶分装并冷藏保存.N Y/T 附录B(资料性)总有机碳(T O C)分析与藻细胞悬浮液中T O C的线性图绘制B 藻细胞悬浮液的T O C含量可通过绘制线性图,并测定替代指标(藻细胞数或吸光度)进行计算而获得.B 通过离心,将藻细胞从不同浓度的藻细胞悬浮液中分离,然后用蒸馏水重新悬浮,每个样本个重复.B 测定藻细胞悬浮液和蒸馏水的TO C浓度和替代指标(藻细胞数或吸光度).B 计算藻细胞悬浮液的TO C浓度时,应扣除蒸馏水中的检出浓度.B 线性图的线性范围应满足碳含量测定范围的需求,见图B 、图B 、图B .图B 藻细胞悬浮液的T O C浓度与替代参数测定值示意图图B 藻细胞悬浮液的T O C浓度与替代参数测定值示意图N Y/T 图B 藻细胞悬浮液的T O C浓度与替代参数测定值示意图N Y/T 附录C(资料性)幼溞性别鉴定指南根据形态学特征区分大型溞的性别.用吸管将幼溞转移至有少量培养液的培养皿中.培养液体积应尽可能小,以防止幼溞移动.在立体显微镜()下观察幼溞的第一触角,雄溞的第一触角明显长于雌溞(图C ).注:如圆圈中所示,雄溞的第一触角比雌溞长.图C 溞龄为 h的雄溞(左)和雌溞(右)N Y/T 附录D(规范性)时间加权平均值的计算D 时间加权平均浓度的简单示例见图D ,该图中:试验周期为d,在第d、第d、第d更换培养液;假定浓度呈指数衰减过程下降,之字线代表任意时间点的浓度;个方形点代表在每一个更换周期开始与结束时的测定浓度;粗实线表示时间加权浓度.图D 时间加权平均浓度的示例D 按公式(D )计算每一个培养液更换周期内指数曲线下的面积(S),数据示例见表D .SCCl nC()l n(C)x(D )式中:x 培养液更换周期内的天数;C 培养液更换周期开始时的测定浓度;C 培养液更换周期结束时的测定浓度;l n(C)浓度的自然对数;l n(C)浓度的自然对数.D 计算时间加权平均浓度:试验周期内指数曲线下方的总面积除以总天数(如 d).D 当被试物在培养液中的降解过程遵循指数衰减以外的其他过程,也可采用与之相应的面积计算方法.在缺乏相关信息和数据的情况下,首选指数衰减模型.N Y/T 表D 时间加权平均计算更换试验液间隔天数,d浓度浓度l n(浓度)l n(浓度)面积 共计d总面积:时间加权平均:N Y/T 参考文献NY/T 难处理农药水生生物毒性试验指南O E C D(),G u i d e l i n e s f o r t h eT e s t i n go fC h e m i c a l s,T e s tN o ,D a p h n i am a g n aR e p r o d u c t i o nT e s t,A d o p t e dO c t o b e r