T∕CACM 1329.2-2019 子洲黄芪药材质量等级标准.pdf

ICS 11.120.01 C 23 团体标准 T/CACM 1329.22019 子洲黄芪药材质量等级标准 Quality grade standard of ZizhouHuangqi 2019-11-28 发布 2020-01-01 实施 中 华 中 医 药 学 会 发 布 T/CACM 1329.22019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 来源.2 5 性状.2 6 鉴别.2 6.1 显微鉴别.2 6.2 理化鉴别.2 6.3 聚合酶链式反应法.3 7 检查和要求.3 7.1 水分.3 7.2 总灰分.3 7.3 重金属及有害元素.4 7.4 有机氯农药残留量.4 7.5 浸出物.4 7.6 主要成分含量.4 8 规格等级.5 附录 A（资料性附录）植物基因组 DNA 提取试剂盒操作步骤.7 附录 B（资料性附录）中药材 DNA 条形码分子鉴定标准操作流程 PCR 扩增.8 附录 C（资料性附录）PCR 扩增子洲黄芪规格等级性状图.9 参考文献.10 全国团体标准信息平台T/CACM 1329.22019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由子洲县人民政府和北京中医药大学提出。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位：北京中医药大学、子洲县人民政府、中药材规范化生产教育部研究工程中心、陕西师范大学西北濒危药材资源开发国家工程实验室、国药种业有限公司、中国汉广中药材集团有限公司、丽珠集团利民制药厂、河北橘井药业有限公司、恒德本草（北京）农业科技有限公司、陕西天芪生物科技有限公司、陕西省子洲县投资发展集团有限公司、陕西子洲黄芪产业发展股份有限公司、子洲县天赐中药材有限公司、子洲县富发农业科技有限公司、子洲县鼎盛中药材有限公司及子洲县永盛黄芪种植、子洲县永旺农产品销售、子洲县秦北中药材种植、子洲县正利中药种植等42家专业合作社。本标准主要起草人：魏胜利、赵婷、张媛、宋学武、栾震、宫国强、张晶、田文仓、康杰芳、王继永、曹海禄、李勇、叶雄、李怀生、李建国、师仰新、郭耿、曹鹏、曹多多、冯紫薇、李欣、卓冰雨、丁一明、祁晓娟、李娇、刘守杰、蒋丽江、徐裕彬、柳志刚、祁春雷、徐社会、曹牛、曹发、姬存良、曹子林、苗建军、马生忠、郑世安等。全国团体标准信息平台T/CACM 1329.22019 1 子洲黄芪药材质量等级标准 1 范围 本标准规定了子洲黄芪药材的来源、性状、鉴别、检查及规格等级等方面的要求。本标准适用于子洲黄芪药材的生产、流通以及使用过程中的药材质量评价。2 规范性引用文件 下列文件对本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国药典（2015年版）一部 中华人民共和国药典（2015年版）四部 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 子洲黄芪 ZizhouHuangqi 产于陕西省榆林市子洲县县域内及其周边生态环境相似地域的仿野生种植蒙古黄芪（Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao）的干燥根。3.2 金井玉栏 jinjingyulan 药材横切面上，外圈（皮部和韧皮部）白色，中心（木质部）黄色或淡黄色的断面外观。注：又称金心玉栏。3.3 直如箭杆 zhirujiangan 形容子洲黄芪药材笔直，如同箭杆的特征。3.4 折之如绵 zhezhirumian 形容子洲黄芪药材绵性大，不易折断的特征。3.5 商品规格等级 commodity specification grade 商业交易过程中，对产品或所使用原材料所规定的质量标准，一般用反映商品品质的要素（包括定性要素和定量要素）进行划分。注：中药材商品规格常根据基原、野生或家种、产地、主要形态特征（特别是颜色）、大小及比例、各种残次品比例、杂质比例、含硫情况、干度、虫蛀霉变等与药材品质相关的要素划分。T/CACM 1329.22019 2 4 来源 本品为豆科植物蒙古黄芪（Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao）的干燥根。直播仿野生栽培于陕西省榆林市子洲县及其周边生态环境相似地域，生长5年或5年以上，于秋季采挖，除杂修剪，干燥。5 性状 本品呈圆柱形，有的具分枝，上端较粗，长 30 cm90 cm，直径 1 cm3.5 cm，呈明显的“直如箭杆”特征。其质硬而韧，不易折断，断面纤维性强，并显粉性，具有“折之如绵”特征。表面淡棕黄色或淡棕褐色，有不整齐的纵皱纹或纵沟。断面皮部黄白色，木部淡黄色，皮部与木部颜色对比鲜明，呈现鲜明的“金井玉栏”外观，且有放射状纹理和裂隙。老根中心偶呈枯朽状，黑褐色或呈空洞。气微，味微甜，嚼之有明显的豆腥味。6 鉴别 6.1 显微鉴别 6.1.1 本品横切面：木栓细胞多列；栓内层为 3列5列厚角细胞。韧皮部射线外侧常弯曲，有裂隙，纤维成束，壁厚，木化或微木化，与筛管群交互排列；近栓内层处有时可见石细胞。形成层成环。木质部导管单个散在或 2个3个相聚；导管间有木纤维；射线中有时可见单个或 2个4个成群的石细胞。薄壁细胞含淀粉粒。6.1.2 黄白色粉末。纤维成束或散离，直径 8 m30 m，壁厚，表面有纵裂纹，初生壁常与次生壁分离，两端常断裂成须状，或较平截。具缘纹孔导管无色或橙黄色，具缘纹孔排列紧密。石细胞少见，圆形、长圆形或形状不规则，壁较厚。6.2 理化鉴别 6.2.1 方法一 6.2.1.1 取本品粉末 3 g，加甲醇 20 mL，加热回流 1 h，滤过，滤液加于中性氧化铝柱（100目120目，5g，内径为 10 mm15 mm)上，用 40甲醇 100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水 30 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取 2 次，每次 20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次 20 mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇 0.5 mL 使溶解，作为供试品溶液。6.2.1.2 另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成 1 mg/mL 的溶液，作为对照品溶液。6.2.1.3 采用中华人民共和国药典（2015年版）一部通则 0502 中的薄层色谱法进行试验，吸取上述两种溶液各 2 L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 10 硫酸乙醇溶液，在 105 加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点；紫外光灯(365nm)下显相同的橙黄色荧光斑点。6.2.2 方法二 全国团体标准信息平台T/CACM 1329.22019 3 6.2.2.1 取本品粉末 2 g，加乙醇 30 mL，加热回流 20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加 0.3氢氧化钠溶液15 mL 使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调节 pH 值至 56，用乙酸乙酯15mL振摇提取，分取乙酸乙酯液，用铺有适量无水硫酸钠的滤纸滤过，滤液蒸干。残渣加乙酸乙酯 1 mL 使溶解，作为供试品溶液。6.2.2.2 另取黄芪对照药材 2 g，按 6.2.2.1 的方法制成对照药材溶液。6.2.2.3 采用中华人民共和国药典（2015年版）一部通则 0502 中的薄层色谱法进行试验，吸取上述两种溶液各 10 L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（10：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。6.3 聚合酶链式反应法 6.3.1 DNA提取 DNA 提取步骤详见附录 A。其中 A.2 水浴 20 min 调整为 8 h，其余步骤不变。6.3.2 序列扩增 序列扩增见附录 B。6.3.3 psbA-trnH 序列特征 蒙古黄芪（Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao）psbA-trnH序列比对后长度为 384 bp。有 5 处插入/缺失，分别为 93，202-206，220-221，315，347 位点。Gen Bank序列如下：AB787167、GU396754、KJ999256KJ999271、KJ999286KJ999295、KT201456KT201480、MF097107MF097110。主导单倍型序列特征见图 1。图1 主导单倍型序列特征二维码 7 检查和要求 7.1 水分 不应超过 10.0。采用中华人民共和国药典（2015年版）四部通则 0832 第二法进行测定。7.2 总灰分 不应超过 4.0。采用中华人民共和国药典（2015年版）四部通则 2302 进行测定。全国团体标准信息平台T/CACM 1329.22019 4 7.3 重金属及有害元素 铅不应超过 5 mg/kg；镉不应超过 0.3 mg/kg；砷不应超过 2 mg/kg；汞不应超过 0.2 mg/kg；铜不应超过 20 mg/kg。采用中华人民共和国药典（2015年版）四部通则 2321 中的原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法进行测定。7.4 有机氯农药残留量 总六六六（-BHC、-BHC、-BHC、-BHC之和）不应超过 0.2 mg/kg；总滴滴涕（pp-DDE、pp-DDD、op-DDT、pp-DDT之和）不应超过 0.2 mg/kg；五氯硝基苯不应超过 0.1 mg/kg。采用中华人民共和国药典（2015年版）四部通则 2341 有机氯类农药残留量测定第一法进行测定。7.5 浸出物 按照水溶性浸出物测定法测定，不应少于 17.0。采用中华人民共和国药典（2015年版）四部通则 2201 的热浸法进行测定。7.6 主要成分含量 7.6.1 黄芪甲苷 7.6.1.1 要求 按照 7.6.1.2 的检测方法进行测定，黄芪甲苷（C41H68O14）含量不应少于 0.10（按干燥品计算）。7.6.1.2 检测方法 7.6.1.2.1 采用中华人民共和国药典（2015年版）四部通则 0512 中的高效液相色谱法进行测定。7.6.1.2.2 色谱条件：a）流动相：纯水（A相），乙腈（B相），流动相 0 min20 min，32 B等度；b）流速：1.0 mL/min；c）柱温：30；d）样品温度：25；e）漂移管温度：95；f）氮气流速：2.0 L/min；g）进样量：20 L；h）蒸发光散射检测器检测。7.6.1.2.3 对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成 0.5 mg/mL 的溶液，即得。7.6.1.2.4 供试品溶液的制备：取本品粉末 2.0 g，精密称定，置 50 mL 离心管中，加甲醇 30 mL，超声处理 30 min，离心 5 min（3000 xg）。残渣用 30 mL 甲醇超声 30 min，离心 5 min，合并上清液，用旋转蒸发仪减压蒸干。残渣精密加入10 mL 的 10（V/V）氨水溶液中，放置 10 min，不时振摇，即得。7.6.1.2.5 测定：分别精密吸取对照品溶液 20 L、供试品溶液 20 L，注入液相色谱仪，测定。全国团体标准信息平台T/CACM 1329.22019 5 7.6.2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷 7.6.2.1 要求 按照 7.6.2.2 的检测方法进行测定，毛蕊异黄酮葡萄糖苷（C22H22O10)含量不应少于 0.02（按干燥品计算）。7.6.2.2 检测方法 7.6.2.2.1 采用中华人民共和国药典（2015年版）四部通则0512中的高效液相色谱法进行测定。7.6.2.2.2 色谱条件：a）Waters Atlantis T3 C18 色谱柱(4.6 mm250 mm，5 m)；b）以 0.2 甲酸水为流动相 A，以乙腈为流动相 B，按表 1 进行梯度洗脱；c）流速：1.0 mL/min；d）柱温：25；e）样品温度：25；f）检测波长：261 nm；g）进样量：20 L。表 1 梯度洗脱程序 时间（min）流动相A（）流动相B（）013 1335 1620 2028 8480 8072 7.6.2.2.3 对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解分别制成0.2mg/mL 的对照品溶液，即得。7.6.2.2.4 供试品溶液的制备：取本品粉末（过四号筛）约 1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加人甲醇 50mL，称定重量，加热回流 4 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 25 L，回收溶剂至干，残渣加 5mL 甲醇和 50mL 乙酸乙酯，静置 1 h，抽滤，取滤液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至 5mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。7.6.2.2.5 测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20 L，注入液相色谱仪，测定，即得。8 规格等级 子洲黄芪为仿野生种植，应无须根、虫蛀、霉变。仿野生黄芪只有1种规格，将此规格划分为 6 个等级，具体要求见表 2。子洲黄芪规格等级性状图见附录 C。全国团体标准信息平台T/CACM 1329.22019 6 表2 子洲黄芪原型药材商品规格等级划分标准 规格 等级 性状描述 共同点 长（cm）上端直径（cm）下端直径（cm）仿野生黄芪 特等 干货，呈圆柱形的单条。其质硬而韧，不易折断，断面纤维性强，并显粉性。表面淡棕黄色或淡棕褐色，有不整齐的纵皱纹或纵沟。断面皮部黄白色，木部淡黄色，皮部与木部颜色对比鲜明，呈现明显的“金井玉栏”外观，且有放射状纹理和裂隙。老根中心偶呈枯朽状，黑褐色或呈空洞。气微，味微甜，嚼之可闻到明显的豆腥味。70 2 0.8 一等 60 1.5 0.7 二等 50 1.3 0.6 三等 40 1.0 0.5 四等 30 0.8 0.5 五等/0.6 0.4 全国团体标准信息平台T/CACM 1329.22019 7 A A 附 录 A（资料性附录）植物基因组 DNA 提取试剂盒操作步骤 A.1 取植物新鲜组织约 100 mg 或干重组织 30 mg，加入液氮充分研磨。A.2 将研磨好的细粉迅速转移到预先装有700L 65预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为 0.1），迅速颠倒混匀后，将离心管放在 65 水浴 20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。A.3 加入 700 L 氯仿，充分混匀，12000 rpm(13400 xg)离心 5 min。A.4 小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入 700 L 缓冲液 GP2，充分混匀。A.5 将混匀的液体转入吸附柱 CB3 中，12000 rpm(13400 xg)离心 30 s，弃掉废液。（吸附柱容积为700 L 左右，可分次加入离心。）A.6 向吸附柱 CB3 中加入 500 L 缓冲液 GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm(13400 xg)离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中。A.7 向吸附柱 CB3 中加入 600 L漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm(13400 xg)离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中。A.8 重复操作步骤 A.7。A.9 将吸附柱 CB3 放回收集管中，12000 rpm(13400 xg)离心 2 min，倒掉废液。将吸附柱 CB3 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。A.10 将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50 L200 L洗脱缓冲液TE，室温放置 2 min5 min，12000 rpm(13400 xg)离心 2 min，将溶液收集到离心管中。全国团体标准信息平台T/CACM 1329.22019 8 B B 附 录 B（资料性附录）中药材 DNA 条形码分子鉴定标准操作流程 PCR 扩增 中药材的 DNA 条形码扩增引物及 PCR 扩增程序见表 B.1。表 B.1 DNA 条形码扩增引物及 PCR 扩增程序 序列名称 引物名称 引物序列（53）PCR 反应条件 psbA -trnH fwd PA 5-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3 94 4min 94 45s，58 30s，72 90s，30个循环；727min，4保存 rev TH 5-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3 子洲黄芪叶绿体psbA-trnH基因扩增反应体系配比见表 B.2。表 B.2 子洲黄芪叶绿体psbA-trnH基因扩增反应体系配比 反应物 反应面积 2Taq PCR Mix 15L 正向引物（10 mol/L）0.5L 反向引物（10 mol/L）0.5L ddH2O 11L 模板 3L 全国团体标准信息平台T/CACM 1329.22019 9 附 录 C（资料性附录）PCR 扩增子洲黄芪规格等级性状图 子洲黄芪不同等级上端截面观见图 C.1。图 C.1 子洲黄芪不同等级上端截面观 不同等级的子洲黄芪见图 C.2。图 C.2 不同等级的子洲黄芪 T/CACM 1329.22019 10 参 考 文 献 1 中华人民共和国香港特别行政区卫生署.香港中药材标准（第一册）S.香港：中华人民共和国香港特别行政区卫生署，2005.2 陈士林.中国药典中药材DNA条形码标准序列M.北京：科学出版社，2015._