基于模式识别技术结合UPLC的西红花产地鉴别_管彬彬.pdf

159 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 4 期基于模式识别技术结合UPLC的西红花产地鉴别管彬彬，熊金恩，李克庆，朱琳，蒋凡*南通市食品药品监督检验中心（南通 226006）摘要西红花集观赏、药用和经济价值于一身,是一种名贵的药食同源产品;产地的“道地性”在很大程度上也是其品质的保证。研究建立了一种基于超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)的方法,来同时检测不同产地西红花样本中的西红花苷、西红花苷、苦番红花素素、藏红花醛这四种主要有效成分,方法回收率为98.0%100.1%。方差分析结果表明不同产地的西红花样本中的有效成分存在显著性差异,浙江产地的西红花样本的西红花苷I、西红花苷、苦番红花素含量均值最高,江苏产地的藏红花醛含量最高。将UPLC测得的4种有效成分主成分分析后的得分向量进行LDA、KNN模式识别,结果表明KNN模型的效果更佳,当主成分数为3,K值为1时,模型的训练集和预测集的识别率分别为96.55%和100%。结果表明模式识别技术结合UPLC的西红花产地鉴别是可行的。关键词西红花;产地;超高效液相色谱;模式识别;有效成分Identification of Saffron Origin Based on Pattern Recognition Technology and UPLCGUAN Binbin,XIONG Jinen,LI Keqing,ZHU Lin,JIANG Fan*Nantong Food and Drug Supervision and Inspection Center(Nantong 22600)Abstract Crocus sativus L.is a kind of precious drug food homologous product,which combines ornamental,medicinal and economic values.In this study,a method based on Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC)was established to simultaneously detect the four main effective components(crocin I,crocin II,picrocrocin,and safranal)in crocus samples from different places of origin,and the recovery rate of the method was 98.0%-100.1%.The result of variance analysis showed that the effective components in crocus samples from different origins were significantly different,the average contents of crocin I,crocin II and picrocrocin in the crocus samples from Zhejiang Province were the highest,and the average content of safranal in the crocus samples from Jiangsu Province was the highest.The LDA and KNN pattern recognitions of the score vectors of the four effective components measured by UPLC after principal component analysis were carried out.The results showed that the KNN model had better effect.When the principal component score was 3 and the K value was 1,the recognition rates of the training set and prediction set of KNN model were 96.55%and 100%,respectively.The results showed that the pattern recognition technology combined with UPLC was feasible to identify the origin of saffron.Keywords saffron;origin;ultra-high performance liquid chromatography;pattern recognition;active ingredients西红花为鸢尾科植物番红花（Crocus sativus L.）的干燥柱头，是一种名贵的药食同源产品，用途广泛，在一些欧洲国家，如法国、西班牙、希腊等地区，西红花常被作为不可或缺的食品添加剂和香料。在中国，西红花是特别珍贵的中药材和膳食材料，具有活血化瘀、解郁安神、凉血解毒等功效，其有效成分包括西红花苷、苦番红花素和藏红花醛等1-3。其中西红花苷是西红花色泽主要来源，具有活血、养颜、降血脂等作用；苦番红花素是西红花的主要呈味物质，具有消炎、抗肿瘤等作用；藏红花醛是西红花香identification of aroma-active compounds in hotpot seasoning before and after boilingJ.Molecules,2021,26(19):5727-5727.21 蒲凤琳.不同产地花椒风味分析及其特征香气指纹图谱的构建D.成都:西华大学,2017.22 刘兵,常远,王瑞芳,等.葱属植物中挥发性风味物质研究进展J.食品科学,2022,664(3):249-257.23 刘洋,张宁,徐晓兰,等.SDE/GC-MS分析火锅底料的挥发性风味成分J.中国食品学报,2014,14(2):283-291.24 孙宝国,陈海涛.食用调香术(第三版)M.北京:化学工业出版社,2017:47-227.25 YANG P,LIU C,SONG H L,et al.Sensory-directed flavor analysis of off-flavor compounds in infant formula with deeply hydrolyzed milk protein and their possible sourcesJ.LWT,2020,119(C):108861-108861.26 万晓玉,向昱州,周莺茹,等.冷吃牛肉特征风味物质解析J.食品与发酵工业,202(19):1-11.食品工业 2023 年第44卷第 4 期 160 研究探讨气的主要来源，具有缓解心肌损伤、抗氧化应激等作用4-6。以上几种成分赋予西红花明媚的色彩、独特的香气和味道，集观赏、药用和经济价值于一身。因为药材在某一地域特定的自然生态环境下，加之较为集中的栽培、生产、加工技术，使其品质优良、疗效确切，因此中药素来有“道地药材”一说，产地的“道地性”在很大程度上也是中药材品质的保证7-8。西红花的原产地位于西亚中东地区，主要分布在地中海沿岸以及欧洲，再经印度到西藏传入我国，故又被称为“藏红花”或“番红花”。在20世纪80年代，我国进行了引种栽培，在上海、江苏、浙江以及河南等地实现了规模化的种植9-11。目前西红花在各个国家及地区都有规模化的培育和种植，但是也正是由于受到产地及种植方式等差异的影响，各产地的西红花药材品质和质量也存在差异12-13。此次研究以不同产地的西红花为研究对象，通过UPLC分离和检测其有效成分，结合模式识别，对产地进行区分。1材料与方法1.1材料、试剂与仪器西红花样本分别购自于上海、江苏、浙江、伊朗、西藏5个地区，共29批，每批样品取3份，共87份样品，具体样品信息见表1。Waters H-class超高效液相色谱系统（美国沃特斯）；KQ5200DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Sartorius CPA225D电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；Milli-Q Academic超纯水机（密理博上海公司）。样本号产地采收期样本号产地采收期样本号产地采收期S1伊朗2020S2伊朗2020S3伊朗2020S4伊朗2021S5伊朗2021S6伊朗2021S7伊朗2021S8伊朗2021S9伊朗2021S10伊朗2021S11伊朗2021S12伊朗2021S13伊朗2021S14伊朗2021S15伊朗2021S16上海崇明2020S17上海崇明2020S18上海崇明2020S19上海崇明2020S20上海崇明2020S21上海崇明2020S22上海崇明2020S23上海崇明2020S24上海崇明2020S25上海崇明2021S26上海崇明2021S27上海崇明2021S28上海崇明2021S29上海崇明2021S30上海崇明2021S31上海崇明2021S32上海崇明2021S33上海崇明2021S34上海崇明2021S35上海崇明2021S36上海崇明2021S37江苏海门2020S38江苏海门2020S39江苏海门2020S40江苏启东2020S41江苏启东2020S42江苏启东2020S43江苏南通2020S44江苏南通2020S45江苏南通2020S46江苏常熟2021S47江苏常熟2021S48江苏常熟2021S49江苏海门2021S50江苏海门2021S51江苏海门2021S52江苏启东2021S53江苏启东2021S54江苏启东2021S55江苏南通2021S56江苏南通2021S57江苏南通2021S58浙江嘉兴2020S59浙江嘉兴2020S60浙江嘉兴2020S61浙江桐乡2020S62浙江桐乡2020S63浙江桐乡2020S64浙江湖州2020S65浙江湖州2020S66浙江湖州2020S67浙江桐乡2021S68浙江桐乡2021S69浙江桐乡2021S70浙江萧山2021S71浙江萧山2021S72浙江萧山2021S73浙江湖州2021S74浙江湖州2021S75浙江湖州2021S76浙江乐清2021S77浙江乐清2021S78浙江乐清2021S79西藏2019S80西藏2019S81西藏2019S82西藏2020S83西藏2020S84西藏2020S85西藏2021S86西藏2021S87西藏2021表1西红花样本信息对照品西红花苷（批号111588-201704，含量以88.4%计）、西红花苷（批号111589-201705，含量以92.2%计）、苦番红花素（批号112056-202102，含量以97.3%计）：中国食品药品检定研究院；藏红花醛纯度99.5%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。乙腈（默克股份有限公司）为色谱纯，乙酸（西陇科学股份有限公司）为优级纯，乙酸铵（西陇科学股份有限公司）、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）为分析纯，水为超纯水。1.2方法1.2.1色谱条件色谱柱：安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm100 mm，1.8 m）；柱温：35；流动*通 信 作 者；基 金 项 目：江 苏 省 自 然 科 学 基 金（BK20190238）；南通市科技局项目（JC2021072）161 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 4 期相A为0.05 mol/L乙酸铵水溶液（含0.05%乙酸），流动相B为乙腈，流动相梯度程序见表2。表2流动相梯度程序时间/min流速/(mLmin-1)流动相A/%流动相B/%00.3901030.3633790.36337130.31585150.39010200.39010进样量为1 L；西红花苷和西红花苷的检测波长为440 nm，苦番红花素的检测波长为254 nm，藏红花醛的检测波长为308 nm14-15。1.2.2样品预处理精密称取40 mg西红花药材粉末，置于100 mL棕色量瓶中，加入90 mL 70%乙醇水溶液，冰浴超声20 min后放至室温，再以初始流动相比例A-B（9010，V/V）定容，摇匀，用0.22 m的有机滤膜过滤后即得。1.2.3对照品溶液的制备分别取适量对照品西红花苷、西红花苷、苦番红花素、藏红花醛，精密称定，置10 mL量瓶中，以初始流动相（A-B=9010，V/V）配制成质量浓度约为0.4 mg/mL的对照品储备液，再用70%乙醇分别稀释成质量浓度为0.181，0.363，0.904，1.809，3.617，9.043，18.087和90.433 g/mL的西红花苷系列标准溶液，质量浓度为0.197，0.394，0.984，1.968，3.935，9.838，19.675，98.377 g/mL的西红花苷系列标准溶液，质量浓度为1.718，3.436，6.871，17.178，34.355，68.710和171.776 g/mL的苦番红花素系列标准溶液，以及质量浓度为0.380，0.950，1.900，3.800，9.500和19.000 g/mL的藏红花醛系列标准溶液，分别以液相色谱图的峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。2结果与分析2.1线性关系利用UPLC对不同产地的西红花中的西红花苷、西红花苷、苦番红花素、藏红花醛进行分析，以上色谱条件能将以上成分完全分离，理论塔板数按所测各成分色谱峰计均不低于10 000，分离度均不小于1.5，对照品和样品色谱图分别见图1和图2。其中：西红花苷的回归方程为Y=2.105107X+4.623 103，r=0.999 9，线性范围为0.18190.433 g/mL；西红花苷的回归方程为Y=2.604107X+3.941103，r=0.999 9，线性范围为0.19798.377 g/mL；苦番红花素的回归方程为Y=3.325106X-2.921103，r=1.000 0，线性范围为1.718171.776 g/mL；藏红花醛的回归方程为Y=1.224107X-3.080102，r=1.000 0，线性范围为0.38019.000 g/mL。注：1.柠檬黄；2.胭脂红；3.苦番红花素；4.西红花苷-；5.西红花苷-；6.新品红-1；7.金胺O-1；8.新品红-2；9.金胺O-2；10.新品红-3；11.藏红花醛。图1混合对照品溶液色谱图注：1.苦番红花素；2.西红花苷-；3.西红花苷-；4.藏红花醛。图2样品液相色谱图2.2精密度取编号为S1的西红花样品，按1.2.2小节进行样品预处理后上机，分别于1天内连续进样6次和连续3 d内重复进样3次，西红花苷的日内精密度和日间精密度分别为0.98%和1.01%，西红花苷的日内精密度和日间精密度分别为0.34%和1.27%，苦番红花素的日内精密度和日间精密度分别为0.92%和1.68%，藏红花醛的日内精密度和日间精密度分别为1.08%和1.77%，精密度良好。2.3回收率取3份已知含量的编号为S1的西红花样品，每份20 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，分别精密加入相当于样品成分量100%的各对照品溶液，按1.2.2小节进行样品预处理后上机测定，西红花苷、西红花苷、苦番红花素、藏红花醛的回收率分别为100.01%，100.10%，99.46%和98.00%，SRSD分别为0.14%，0.04%，0.78%和0.40%。2.4样品测定结果将UPLC测得的87份样本的西红花苷、西红花苷、苦番红花素、藏红花醛四种成分峰面积，代入标准曲线，并折算其干燥失重后，得到各样本中的各自含量，如表3所示。从表3可以看出，不同产地的西红花样本中的成分存在一定差异。浙江和上海的西红花苷、西红花苷较为接近，均高于其他地区，其食品工业 2023 年第44卷第 4 期 162 研究探讨项目参数伊朗浙江江苏上海西藏干燥失重平均值8.106 08.106 98.624 28.183 88.750 0标准差0.290 40.278 00.332 80.137 80.544 1西红花苷平均值5.817 713.381 89.769 012.695 25.350 6标准差0.870 40.184 70.479 90.672 11.395 4西红花苷平均值2.032 95.127 53.637 24.881 01.841 6标准差0.345 10.070 20.157 20.490 080.511 1苦番红花素平均值11.497 236.390 425.021 726.932 311.089 8标准差0.976 37.170 05.317 50.917 01.968 38藏红花醛平均值0.367 30.335 00.406 80.366 50.330 6标准差0.106 40.029 70.025 40.031 80.109 5表3不同产地西红花样本的有效成分含量 单位：%中浙江的西红花苷、西红花苷平均含量最高，西藏和伊朗的西红花苷、西红花苷含量较为接近，均比较低，这可能是由于浙江、江苏和上海的西红花多为大棚种植，而伊朗和西藏多为露天种植的原因；浙江产的苦番红花素的含量远高于其余产地，江苏和上海产的含量接近；藏红花醛含量江苏产的西红花含量最高，伊朗和上海的较为接近，浙江和西藏的藏红花醛含量均比较低，这可能与当地的加工工艺有关。项目方差来源平方和自由度均方F显著性西红花苷组间846.9814211.745428.6570.000组内40.506820.494西红花苷组间143.357435.839321.0580.000组内9.154820.112苦番红花素素组间7 253.43241 813.35889.8540.000组内1 654.8538220.181藏红花醛组间0.06640.0174.4580.003组内0.305820.004表4不同产地西红花有效成分差异方差分析表2.5方差分析分别对5个不同产地的西红花4种有效成分进行单因素方差分析，结果见表4。从表4可以看出，上海、江苏、浙江、西藏、伊朗的西红花样本中的西红花苷、西红花苷、苦番红花素、藏红花醛这4种成分含量均存在显著性差异，P值均小于0.01。2.6主成分分析图3不同产地西红花样本的PCA主成分得分图图3是不同产地西红花样本中西红花苷、西红花苷、苦番红花素、藏红花醛的含量进行主成分分析后前3个主成分的得分图，是校正集中的西红花样本在该三维平面上的投影。可以看出，第一主成分（PC1）的贡献率为97.58%，第二主成分（PC2）的贡献率为2.40%，第三主成分（PC3）的贡献率为0.01%，不同产地的西红花在图上有一定的分类趋势，上海的西红花样本能和其他产地样本完全分开，浙江和江苏的西红花样本也有一定的聚类趋势，但是两省样本有一定的重叠，西藏的西红花样本投影点分布比较分散，和伊朗的西红花样本有一定重叠，这是由于通过UPLC测得的西藏和伊朗的西红花样本中的有效成分含量均比较接近，投影点分布交叉较多。2.7模式识别以不同产地的西红花样本的主成分得分向量作为线性判别（LDA）模型的输入，进行LDA分析。从图4（a）可以看出，当主成分因子数（Pcs）为2时，西红花产地鉴别的训练集和预测集的识别率均为最高，分别为81.03%和86.21%，预测集样本中有4个样本判别错误，其中有2个浙江的西红花样本误判为江苏，1个西藏的西红花样本误判为伊朗，1个伊朗的西红花样本误判为西藏。将不同产地的西红花样本的主成分得分向量作为K临近（KNN）模型的输入，进行KNN模型分析，当K值为1，主成分数为3时，模型的预测集识别率最高，为100%，此时训练集的识别率为96.55%。163 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 4 期图4不同产地西红花样本的LDA（a）和KNN（b）模型识别率3结论与讨论文章建立了一种基于UPLC法同时定量检测不同产地西红花样本中西红花苷（保留时间3.909 min）、西红花苷（保留时间4.232 min）、苦番红花素（保留时间3.235 min）、藏红花醛（保留时间11.751 min）这4种有效成分的方法，还可通过该方法同时鉴别西红花样本中是否添加柠檬黄（保留时间0.820 min）、新品红（保留时间5.118，5.702和6.551 min）、金胺O（保留时间5.210和6.222 min）、胭脂红（保留时间2.547 min）等色素，色谱图中峰形对称无干扰，分离度均大于1.5。从方差分析结果看，试验不同产地样本中西红花苷、西红花苷、苦番红花素、藏红花醛的含量均存在显著性差异。将UPLC测得的4种有效成分主成分分析后的得分向量作为模式识别的输入，进行LDA、KNN模式识别，结果表明KNN模型的效果更加，当主成分数为3，K值为1时，模型的训练集和预测集的识别率分别为96.55%和100%。结果表明模式识别技术结合UPLC的西红花产地鉴别是可行的。此次试验结果，发现不同产地的西红花中的有效成分存在显著性差异，但要使模型更加准确可靠，还需收集更多数量的西红花样本，此外，还需进一步研究不同产地西红花样本含量不同的原因，以便后期整体提高西红花的质量。参考文献：1 MZABRI I,ADDI M,BERRICHI A.Traditional and modern uses of saffron(Crocus sativus)J.Cosmetics,2019,6(4):63.2 GHAFFARI S,ROSHANRAVAN N.Saffron:An updated review on biological properties with special focus on cardiovascular effectsJ.Biomed Pharmacother,2019,109:21-27.3 AMIN A,FARRUKH A,MURALI C,et al,Saffron and its major ingredients effect on colon cancer cells with mismatch repair deficiency and microsatellite instabilityJ.Mol,2021,26(13):3855.4 钱勇,许纪锋,诸晨,等.西红花中西红花苷和苷的含量测定J.食品安全质量检测学报,2015,6(7):2822-2827.5 LU X,XIA Z,QU F,et al,Identification of 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