2022年湖北省人与家养动...荆门蜱病毒感染状况初步研究_张秀丹.pdf

*传染病监测*2022 年湖北省人与家养动物中荆门蜱病毒感染状况初步研究张秀丹1,2，李贝杰1,2，王静3，孙晖2，郑雅匀2，罗雪莲1,2摘要：目的对 2022 年湖北省人和家养动物血清中荆门蜱病毒（JMTV）的抗体阳性率进行初步研究，评估荆门蜱病毒感染人群和动物的风险。方法将 JMTVNS3 蛋白在大肠埃希菌中表达并纯化，制备 ELISA 包被抗原，利用人和动物血清分别确定cut-off 值；收集湖北省多个市牛羊养殖场采集的牛、羊血清，武汉市中心医院体检健康人血清，对这些血清样本以及实验室保存的林区居民血清进行 JMTV 特异性抗体以及核酸检测。结果初步建立基于 NS3 蛋白的 JMTV抗体检测酶联免疫吸附试验（ELISA）。确定人血清、牛血清和羊血清的 cut-off 值分别为 0.342、0.098 和 0.298。44 份牛血清和 193 份羊血清中 JMTV 抗体阳性率分别为 4.55%和 3.63%。174 份体检健康人和 13 份林区居民血清 JMTV 抗体结果均为阴性。所有样本中均未检测到JMTV 的核酸片段。结论家养动物牛、羊血清中检出 JMTV 特异性抗体，提示需关注牛、羊作为蜱携带者导致病毒扩散的风险。关键词：荆门蜱病毒；NS3；酶联免疫吸附试验；血清学中图分类号:R211;R51;R384文献标志码:A文章编号:10039961（2023）05053706ApreliminarystudyofJingmentickvirusinfectioninhumananddomesticanimalsinHubei,2022Zhang Xiudan1,2,Li Beijie1,2,Wang Jing3,Sun Hui2,Zheng Yayun2,Luo Xuelian1,2.1.School of Public Health,Shanxi MedicalUniversity,Taiyuan 030001,Shanxi,China;2.National Institute for Communicable Disease Prevention and Control,ChineseCenter for Disease Control and Prevention,Beijing 102206,China;3.Department of Medical Laboratory,the CentralHospital of Wuhan,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430014,Hubei,ChinaCorresponding authorCorresponding author:Luo Xuelian,Email:Abstract:ObjectiveTostudythepositiverateofJingmentickvirus(JMTV)antibodyinserumofdomesticanimalsandassesstheriskofJMTVinfectioninhumansanddomesticanimalsinHubeiprovince,2022.MethodsJMTVNS3proteinasantigenwasexpressedinEscherichiacoliandpurified.ELISAenvelopeantigenwasprepared,andcut-offvaluesweredeterminedbyhumanandanimalserum.Serumsamplesfromcattle,sheepfromfarmsandserumsamplesfromhealthypeoplefromhospitalswerecollectedinHubei.JMTV-specificantibodyandnucleicacidweredetectedinthesessamples,aswellasserumfromforestresidentsstoredinourlaboratory.Inaddition,JMTV-specificnucleicacidwasdetectedinallsamplesbyRT-PCRmethod.ResultsAnELISAassayforJMTVantibodydetectionbasedonNS3proteinwasestablished.Thecut-offvaluesofhuman,bovineandsheepserumweredeterminedtobe0.342,0.098and0.298,respectively.ThepositiveratesofJMTVantibodyin44bovineand193sheepserumwere4.55%and3.63%,respectively.JMTV-specificantibodywerenegativein174healthysubjectsand13forestresidents.NonucleicacidfragmentsofJMTVweredetectedinallsamples.ConclusionJMTVspecificantibodywasdetectedintheserumofdomesticcattleandsheep,suggestingthatitisnecessarytopayattentiontothespreadriskoftheviruscausedbycattleandsheep.Keywords:Jingmentickvirus;NS3;Enzyme-linkedimmunosorbentassay;SerologicalscreeningThisstudywassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81802017)荆门蜱病毒（Jingmentickvirus，JMTV）是一类由蜱、蚊等节肢动物叮咬传播的病毒，首次在我国湖北省荆门市蜱中被发现13。随后，Lader 等1在乌干达一只红色疣猴中检测到 JMTV 变体，扩大了荆门病毒宿主的范围。Souza 和 Villa 等45先后从蜱被感染的牛中分离出该病毒。2018 年在克里米亚刚果热患者血清中检测到JMTV6。由此可见，JMTV分布十分广泛，包括亚洲2，714、非洲1，1516、美洲1，5，15，1718和欧洲7，17，1920。2019 年 Jia 等8从被蜱叮咬患者的皮肤、血液和血清中检测到了 JMTV，并在蜱细胞中对该病毒进行了分离培养。同年，Wang等20再次在中国东北地区有蜱叮咬史的发热患者血清中检测并分离到类 JMTV样病毒，命名为阿龙山病毒，该病毒的发现提示 JMTV 是一种新的人类蜱传病原体。基金项目：国家自然科学基金（No.81802017）作者单位：1.山西医科大学公共卫生学院,山西太原030001；2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京102206；3.华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院检验科,湖北武汉430014作者简介：张秀丹，女，山西省朔州市人，在读硕士研究生，主要从事新病毒分离鉴定，Email:通信作者：罗雪莲，Tel：[phone]，Email：收稿日期：20221020网络出版日期：20230422疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5537www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202210200459JMTV 属于黄病毒科病毒，是一组由 4 个片段组成的多组分基因组的单股正链带包膜的 RNA 病毒，其基因组由 S1S44 个片段组成，分别编码NSP1（NS5 类蛋白）、VP1、NSP2（NS2b-NS3 复合体类蛋白）、VP2 和 VP3 蛋白2，5，10。在黄病毒科病毒中，NS3 蛋白具有很好的免疫原性，可刺激机体产生特异性体液免疫和细胞免疫2125。Simmons 等26利用登革热病毒 NS3 蛋白免疫小鼠发现，小鼠抗病毒抗原的 IgG 抗体总效价升高。Yan 等27利用非典型猪瘟病毒 NS3 蛋白检测单克隆抗体识别的表位，间接检测单克隆抗体的反应性。本研究构建了 JMTVNS3 的原核表达质粒，在大肠埃希菌中表达并纯化了 NS3 蛋白，初步建立基于NS3 蛋白的JMTV 抗体检测ELISA 方法。并对2022 年收集的湖北省人、家养动物血清进行 JMTV 抗体筛查，为 JMTV 引起的人和动物感染提供基础数据。1材料和方法1.1主要试剂E.coliBL21（DE3）感受态细胞和聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）相关化学试剂均购自北京 Solarbio 公司；ECL 发光液和蛋白 Marker 购自大连 TaKaRa公司；ELISA 包被液购自北京四正柏生物科技有限公司；TMB 可溶性底物和脱脂奶粉均购自北京 BD 公司；TMB 终止液购自北京博奥龙免疫技术有限公司；RNeasyMiNiKit 试剂盒购自QIGEN 公司，MSonestepRT-PCRKit 和 MS1stStrandcDNASynthesisKit（gDNAwiper）均购自北京兆葵生物科技有限公司。1.2样本采集2022 年 56 月于湖北省 10 家养殖场采集羊血清 193 份（对应血块 106 份），牛血清44 份（对应血块 44 份），见表 1。低风险人群（武汉市中心医院体检人群）血清 174 份，高风险人群（林区居民）血清 13 份。本文所涉及人和动物样本均通过中国疾病预防控制中心传染病预防控制所伦理审查委员会批准（ICDC-2019012;ICDC-2022022）。1.3NS3 蛋白序列分析根据 GenBank 上收录的JMTVNS3 的基因序列（GenBank 登录号NC_024114.1），获得 NS3 的氨基酸序列，利用 SignalP-5.0prediction（Eukarya）、Sequence 软件和 TMHMMSEVER 在线软件（http:www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）对 NS3 蛋白序列的信号肽和跨膜区域进行分析。1.4NS3 重组蛋白制备利用 NCO和 Xho双酶切 NS3 基因片段和 pET-22b（），构建重组质粒pET-22b-JMTV-NS3（148-808AA）。将重组质粒转化至大肠埃希菌 BL21（DE3）感受态细胞中，培养过夜，挑取单克隆，37 摇菌至 A600为 0.60.8，加入终浓度为 1mmol/L 的 IPTG，诱导表达 4h 后收集菌体，超声破碎后分别对上清和沉淀进行 SDS-PAGE 分析。小量表达成功后对重组蛋白进行大量诱导表达，离心收集细菌，用BindingBuffer（15mmol/LTris.HCl，500mmol/LNaCl，pH8.0）洗涤菌体三次后重悬菌体，将菌体置于冰浴中进行超声破碎，离心后收集沉淀，用 BindingBuffer（15mmol/LTris.HCl，500mmol/L 的 NaCl，8mol/LUrea，pH8.0）重选沉淀并将沉淀置于冰浴中再次超声，离心后取上清过 0.22m 滤芯后经 Ni-NTAHis 层析柱纯化，收集纯化后的蛋白加入蛋白浓缩柱中，多次少量的加入磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsolution，PBS）对蛋白进行复性和浓缩。最后用聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninicacid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。1.5聚丙烯酰胺凝胶法（SDS-PAGE）和蛋白免疫印迹法（WesternBlot，WB）收集纯化过程中的蛋白，取 100L 与 2SDS-PAGEloadingbuffer11等体积混合，100 煮 10min 后经 5%浓缩胶和12%分离胶 SDS-PAGE 电泳，随后使用考马斯亮蓝染色进行观察。纯化的蛋白经 SDS-PAGE 电泳后湿转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF)膜，5%脱脂牛奶 4 封闭过夜，磷酸盐缓冲液吐温（PhosphatebufferedsolutionTWEEN，PBST）洗膜3 次，鼠抗 his 标签特异性血清抗体按 11000 比例用 5%脱 脂 奶 粉 封 闭 液 稀 释，37 孵 育 1 h，PBST 洗膜 3 次，辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠 IgG 抗体按 15000 比例用 5%脱脂奶粉封闭液稀释，37 孵育 40min，PBST 洗膜 3 次，用增强型化学发光（enhancedchemiluminescence，ECL）法显色分析结果。1.6间 接 酶 联 免 疫 吸 附 试 验（Enzyme linkedimmunosorbentassay，ELISA）根据 ELISA 常规程序进行2829，首先，由棋盘滴定法确定 NS3 重组表 1动物采样信息表Table1Informationaboutanimalsamples采样时间（年月）地点养殖场名称种属样本类型样本数量（份）202205湖北宜昌市CY羊血清50XT羊血清8YD羊血清10DJ羊血清9GX羊血清10202206湖北宜昌市CY羊血清（血块）31（31）湖北黄冈市MC羊血清（血块）34（34）LT羊血清（血块）41（41）湖北十堰市ZS牛血清（血块）5（5）湖北宜昌市ZJ牛血清（血块）14（14）湖北襄阳市ZY牛血清（血块）25（25）538疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202210200459蛋白最佳包被浓度 4g/mL。将 NS3 蛋白用磷酸盐缓冲液稀释后包被于 ELISA 反应板，每个反应孔100L，4 过夜后，弃包被液，PBST洗涤5 次并拍干。每个反应孔加入100LELISA 封闭液，37 封闭2h。弃去封闭液，PBST 清洗 5 次并拍干，PBS 稀释待测血清 100L 加入反应板中，37 孵育 1h。PBST洗涤 5 次并拍干分别加入对应的 HRP 标记的羊抗人（110000）、兔抗牛（15000）或兔抗羊 IgG 抗体（15000）100L每孔，孵育 30min，PBST 洗涤 5 次拍干后，取 TMB过氧化物酶底物 100L/孔加入96 孔板中，室温反应 5min，加入酸性终止液，立即测 A450值，每个样本重复 3 个孔。x x分别对人、牛、羊的血清样本进行间接 ELISA检测，每份样本重复 3 个孔，结果取平均值，分别计算样本 A450值的平均值（）和标准差（s），被检样本 A450值 3s 时判定为阳性。每个样本进行 2 次实验，如两次实验结果不符合，进行第三次实验进一步判定2931。1.7RT-PCR 检测提取所有血样本的 RNA，利用已发表文献中的引物2，32和本研究自行设计的兼并引物（表 2）用于 JMTV 核酸检测。参照文献2，32引物和方法对 RNA 进行扩增，两轮目的产物大小分别为 511bp 和 394bp。采用本研究自行设计的引物，首先用 R2664 引物对 RNA 进行逆转录，接下来用引物对 R801/F555 和 R801/F645 进行半巢式 PCR，目的产物大小分别为 254bp 和 156bp。2结果2.1全长 NS3 蛋白序列分析NS3 蛋白全长 808aa，蛋白序列分析显示 129aa 为信号肽，30147aa含有两个跨膜结构域（3052aa，125147aa）和亲水区（148808aa）（图 1、2）。本研究选取 148808aa进行 NS3 重组蛋白表达与纯化，蛋白大小约 75000。2.2NS3 重组蛋白的表达与纯化小量表达结果表明，NS3 蛋白能够在 IPTG 诱导下成功表达（图 3A）。经菌体上清和沉淀的 SDS-PAGE 分析表明 NS3 蛋白的表达不可溶，呈现出包涵体的形式（图 3B）。根据图 3A 随机挑选单克隆菌株在 30，终浓度为1mmol/L 的 IPTG 诱导下进行大量表达并对 NS3包涵体蛋白进行纯化，SDS-PAGE 分析可见相对分子质量约为 75000 的蛋白条带，大小与预期一致，且蛋白条带较为单一（图 4）。经 WesternBlot 分析，纯化的 JMTVNS3 蛋白能与 His 标签单抗发生特异性反应，可见相对分子质量约为 75000 的蛋白条带，表明该蛋白具有良好的抗原性（图 5）。2.3人血清 ELISA 筛查结果取 174 份低风险人血表 2荆门蜱病毒筛查引物Table2PrimersforthedetectionofJMTV基因引物名称序列（53）参考文献RdRp 194F1TCGGCGATAAATAGGAGAGGTGCCAT2，32194F2GGACTGGAGACAAGACGTCAACACG194R1 TCTGCGTAGAGTCGGTAGAGGTGGTG194R2 CGCCATTTCTTCATCCTCCGCTAGNS5R2664 CATCATCCARCCYTTGGYKATRCC本研究设计R801TGCATCATCCAKGCRTCYACWGCRTCF555GARGARTGGATGGCSGAYCCF645TGYGCRGGMMGAGGAGGMTGGAG注：SP(Sec/SPI).由Sec转座转运，并由信号肽酶I(Lep)切割的“标准”分泌信号肽；CS.用来区分是否为剪切位点，最高峰值为剪切位点后的第一个氨基酸(即成熟蛋白的第一个氨基酸残基)；Other.其他图 1NS3 信号肽分析Figure1NS3Signalpeptideanalysis图 2NS3 蛋白跨膜结构域Figure2TransmembranedomainofNS3protein注：a.NS3 蛋白小量诱导表达 SDS-PAGE 鉴定：M.Marker；泳道 1.未诱导；泳道 24.1mmol/LIPTG 诱导不同单克隆菌株。b.NS3 蛋白表达形式 SDS-PAGE 鉴定：M.Marker；泳道 1.上清；泳道 2.沉淀；箭头所指为目的蛋白所在位置图 3NS3 蛋白小量诱导表达及表达形式的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定Figure3SDS-PAGEidentificationofsmallamountinducedexpressionandexpressionformofNS3protein疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5539www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202210200459 x x清进行间接 ELISA 检测，每份样本重复 3 个孔，结果取平均值，计算样本 A450值的平均值（）和标准差（s），低风险人血清 A450的 为 0.132，s 为 0.070，cut-off 值为 0.342，（图 6），174 份低风险人群和 13 份高风险人群血清均阴性。图中红色横线位置对应 cut-off 值。x2.4家养动物血清样本ELISA 筛查结果所有的牛、羊血清样本分别进行间接 ELISA 检测，每份样本重复 3 个孔，结果取平均值，分别计算样本总的 A450的平均值（）和标准差（s）。羊血清 A450平均值为 0.088，s 为 0.070，cut-off 值为 0.298，牛血清平均值为 0.035，s 为0.053，最终确立cut-off 值为0.098，（图7），44 份牛血清中阳性样本 2 份（图 7B），阳性率为 4.55%，193 份羊血清中阳性样本7 份（图7A），阳性率为3.63%，图中红色横线位置对应 cut-off 值。不同养殖场血清阳性率见表 3。2.5血样本中 JMTV 核酸检测结果将所有血样本进行RNA 提取后，用两种不同RT-PCR 引物进行扩增。注：M.Marker；泳道 1.过柱结合后液体；泳道 26.300mmol/L 咪唑洗脱的 NS3 重组蛋白；箭头所指为目的蛋白所在位置图 4NS3 蛋白表达（包涵体）纯化聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Figure4SDS-PAGEidentificationofNS3proteinexpression(inclusionbodies)purification注：M.Marker；泳道 1.NS3 蛋白；箭头所指为目的蛋白所在位置图 5NS3 蛋白 his 单抗蛋白免疫印迹分析Figure5WesternblotanalysisofNS3proteinhismonoclonalantibod图 6人群血清样本吸光度值分布Figure6DistributionofA450valueinserumsamplesofpeople图 7动物血清样本吸光度值分布Figure7DistributionofA450valueinserumsamplesofbeast540疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202210200459未有目的条带的扩增。3讨论JMTV 是一类新发现对人类有危害的蜱传病毒。目前，尚无人群感染 JMTV 的血清学本底数据。本文利用初步建立的 ELISA 方法对高风险人群、低风险人群及家养牛、羊感染 JMTV 进行血清学初步研究，为掌握人群和动物 JMTV 感染状况提供基础数据。x在用大肠埃希菌表达的 JMTVNS3 蛋白作为抗原进行 ELISA 检测时，不同物种来源血清样本产生的 A450差别很大，人血清样本高于牛、羊血清样本。NS3 蛋白分子质量大（70000），在大肠埃希菌中形成包涵体，可能造成后续目的蛋白纯度不够，而且人血清中抗体更丰富，更容易与抗原产生非特异性反应。由于 JMTV 对人和动物的致病性尚不明确，本研究在 cut-off 值的确定上采用总样本 A450的平均值（）3 倍标准差（s），且根据样本宿主来源不同分开确定。未来需扩大人群检测范围，优化完善用 ELISA检测 JMTV 抗体的方法。在 ELISA 筛查 JMTV 抗体阳性的 2 份牛血清和 7 份羊血清中，未检测到 JMTV 核酸片段，可能是由于荆门病毒在血标本中含量低且阳性标本数量太少。未来在荆门病毒感染研究中，除扩大样本量，也将关注多种样本类型，特别是结痂部位皮肤组织等。JMTV 在蜱中广泛存在，已在全沟硬蜱、坚果革蜱、银革蜱、血蜱、裂头蜱和残缘璃眼蜱等蜱中检测到病毒 RNA2，12，32。牛、羊为 JMTV 的中间宿主。本研究对湖北省牛、羊血清中 JMTV 抗体进行初步筛查，结果显示，抗体阳性率分别为 4.55%和 3.63%，提示存在 JMTV 的感染，因此，需定期对牛、羊进行血清学监测，警惕通过机械携带蜱可能导致的JMTV 扩散。我国学者对内蒙古自治区 480 份牛、羊血清进行 JMTV 抗体检测，结果表明 4.60%牛血清和 9.20%羊血清 JMTV 抗体阳性13。在法国，200 份加勒比海牛血清中JMTV 抗体均为阴性18。由此可见，牛、羊中 JMTV 的检出情况在不同国家、地区差异较大，提示 JMTV 多样性可能与地理分布相关。不同 JMTV 毒株感染动物宿主能力需进一步研究。长期在林区生活的人群有更多蜱接触或暴露机会，是需要关注 JMTV 感染的高风险人群。我国已报道患者皮肤结痂、全血或血清中检出 JMTV 样病毒核酸8。Kuivanen等10在芬兰东南部疑似病毒性脑炎患者的血清中未检测到病毒 RNA 及抗体。Diner等7对土耳其 21 份病因不明的发热患者的血清（无蜱叮咬）、23 份有蜱咬伤史的患者血清以及16 例无明确病因的急性发作性中枢神经系统感染患者的脑脊液标本检测均为阴性。结果提示，人类感染压力较低。本研究对 13 例高风险人群的血清进行JMTV 特异性抗体检测，结果均为阴性。可能是高风险人群样本数量太少，同时，也需考虑使用更灵敏的检测方法综合评估人群感染 JMTV 的风险。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突致谢本论文中动物血清的采集得到湖北省畜牧兽医研究所李晓锋老师的大力支持和帮助参考文献LadnerJT,WileyMR,BeitzelB,etal.Amulticomponentanimalvirus isolated from mosquitoesJ.Cell Host Microbe,2016,20（3）:357367.DOI:10.1016/j.chom.2016.07.011.1QinXC,ShiM,TianJH,etal.Atick-bornesegmentedRNAviruscontains genome segments derived from unsegmented viralancestorsJ.Proc Natl Acad Sci USA,2014,111（18）:67446749.DOI:10.1073/pnas.1324194111.2王泽东.新型分节段黄病毒的发现及其流行病学研究D.北京:中国农业科学院,2019.Wang ZD.Discovery and epidemiology of a novel segmentedflavivirusD.Beijing:ChineseAcademyofAgriculturalSciences,2019.3deSouzaWM,FumagalliMJ,deOliveiraTorresCarrascoA,etal.Viral diversity of Rhipicephalus microplus parasitizing cattle insouthern BrazilJ.Sci Rep,2018,8（1）:16315.DOI:10.1038/s41598018346301.4VillaEC,MaruyamaSR,deMiranda-SantosIKF,etal.Completecodinggenomesequenceformogianatickvirus,ajingmenvirusisolatedfromticksinbrazilJ.Genome Announc,2017,5（18）:e0023217.DOI:10.1128/genomeA.0023217.5EmmerichP,JakupiX,vonPosselR,etal.Viralmetagenomics,genetic and evolutionary characteristics of Crimean-Congohemorrhagicfeverorthonairovirusinhumans,KosovoJ.InfectGenet 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养殖场名称样本数量（份）阳性数（例）阳性率（%）牛血清ZS500.00ZJ1417.14ZY2514.00羊血清CY8167.41XT800.00YD1000.00DJ900.00GX1000.00LT4112.44MC3400.00注：JMTV.荆门蜱病毒疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5541www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202210200459JingmentickvirusinticksandmammalsJ.Virus Evol,2020,6（2）:veaa051.DOI:10.1093/ve/veaa051.MengF,DingMM,TanZZ,etal.Viromeanalysisoftick-bornevirusesinHeilongjiangprovince,ChinaJ.Ticks Tick Borne Dis,2019,10（2）:412420.DOI:10.1016/j.ttbdis.2018.12.002.12WangZD,WangW,WangNN,etal.Prevalenceoftheemergingnovel Alongshan virus infection in sheep and cattle in InnerMongolia,northeasternChinaJ.Parasit Vectors,2019,12（1）:450.DOI:10.1186/s1307101937071.13Kobayashi D,Kuwata R,Kimura T,et al.Detection ofjingmenvirusesinJapanwithevidenceofverticaltransmissioninticksJ.Viruses,2021,13（12）:2547.DOI:10.3390/v13122547.14MaruyamaSR,Castro-JorgeLA,RibeiroJMC,etal.Characterisation of divergent flavivirus NS3 and NS5 proteinsequences detected in Rhipicephalus microplus ticks 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