人类Kras基因突变检测试剂盒新版说明书.docx

人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书
【产品名称】 
通 用 名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法） 
英 文 名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis) 
【包装规格】     20测试/盒 
【预期用途】 
K-ras基因在12号染色体短臂上，是关键癌基因之一，编码一个21kD kras蛋白，参与细胞内信号传输，关键包含PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK信号转导路径，这些转导路径是目前肿瘤靶向药品研究热点，靶向药品经过抑制这些路径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将造成kras蛋白变异并处于连续激活状态，使药品失效。。据中国《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者回顾性研究中，全部患者均接收厄洛替尼单药一线诊疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差异有统计学意义（P <0.01）。所以，指南提议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药品前应进行K-ras基因突变状态检测。 
本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子12种体细胞突变（表1），提供突变状态定性结果。为临床肿瘤靶向药品个体化用药提供辅助诊疗依据，本品适适用于进入个体化靶向诊疗疗程前患者使用。 

 【检验原理】 
本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12，13密码子是否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可扩增12种突变型和野生型K-ras目标序列，利用标识了FAM荧光基团和淬灭基团双标识探针首先抑制野生型基因扩增，提升突变基因检测灵敏度，其次在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产物分析，荧光探针在未杂交时因荧光基团和淬灭基团相互靠近而被淬灭，不发荧光，杂交状态时，二者相互离开而产生荧光。该荧光探针分别和突变基因和野生型基因杂交产物在熔解曲线分析时，表现为熔解曲线导数图中出现不一样位置峰，熔解峰对应位置即为熔解温度（Tm值），因野生峰位置较突变峰位置大3℃以上而得到区分，但多种突变峰因Tm值相差较小而不能分辨。
本品可稳定地检出野生型10ng/ul基因组背景下1%含量体细胞突变，其熔解曲线会出现双峰，其中突变峰较野生峰Tm值显著降低（图1）。 

【关键组成成份】 
本试剂盒包含PCR反应液I、PCR反应液Ⅱ和野生型对照品等3管试剂。PCR反应液I包含对应K-ras基因突变检测引物和探针，探针由FAM荧光指示；PCR反应液Ⅱ含有dNTP、Taq酶和MgCl2等。

检测必需但试剂盒中不包含组分： 
1.5ml 离心管（用于配制PCR反应液和DNA提取）；0.2ml PCR管或8联PCR管或96孔PCR板； 带滤塞吸头（1ml、200μl和10μl）； 
DNA提取试剂盒ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System（货号：A2352） 
【贮存条件及使用期】 
置于-20℃条件下储存，使用期6个月。4-10℃避光条件下储存或运输不得超出7天。 
【适用仪器】 
适适用于ABI7500、Linegene FQD-96A型号Real-time PCR扩增仪。 
【样本要求】 
1. 适用样本为非小细胞肺癌、结直肠癌石蜡包埋病理组织切片，切片厚度10μm，数量1片，所用切片样品保留不超出3年。 
2. 因为肿瘤复杂性，所采集临床样品往往会混有正常组织细胞，石蜡包埋病理切片样品肿瘤病变细胞
应不低于   %，所取部分应尽可能在蜡块中部； 
3. 使用商业化试剂盒来提取人类基因组DNA，推荐使用Promega企业ReliaPrep™ FFPE gDNA 
Miniprep System（A2352）提取石蜡包埋组织切片样品，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA OD260/OD280值应在1.8~2.0，浓度应在3~300ng/μl之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，提议重新取切片进行核酸提取，提取完DNA提议立即进行检测，不然请于-20℃以下保留，保留时间不要超出6个月。 
【检验方法】 
一、 核酸提取（样本处理室） 
使用ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System进行核酸提取，提取步骤以下。 
1. 用矿物油去除石蜡 
加矿物油500µl到装有组织切片样本1.5ml离心管内，80℃孵育1min，振荡混匀；
 2. 组织样本裂解，消化组织蛋白质 
1)  离心管内加入200µl裂解液，室温10,000g离心15s,形成水油两相溶液，下层为水相，上层为油相；
2)  向离心管水相加入20µl蛋白酶K, 用移液枪吸打混匀； 3) 56℃孵育1h； 4) 80℃孵育1h； 
5) 冷却到室温，离心15s； 3. 去除RNA 
向离心管水相加入10µl RNase A，吸打混匀。室温（20-25℃）孵育5min； 4. 用核酸提取柱提取基因组DNA1) 加入220µl BL Buffer到含裂解样品离心管中，再加入240µl乙醇（95-100%），震荡混匀，室温10,000g离心15s，形成水油两相溶液，下层为水相，上层为油相； 
2) 将结合柱置于搜集管内，小心吸收离心管下层水相（包含可能形成沉淀）转移到结合柱内，盖上管盖，将离心管丢弃。 
3) 搜集管室温10,000g离心30s，弃去管中滤出液。 
4) 把柱子重新装入搜集管中，加入500μl 1 Í 洗涤液至柱内，室温10,000g离心30 s，弃去滤出洗涤液。 5) 反复步骤4）再洗涤一次； 
6) 打开结合柱盖子，室温条件下16,000g离心3 min以甩干柱内残余液体； 
7) 把柱子转移至一个洁净自备1.5ml离心管中，向柱内加入50μl Elution Buffer，室温16,000 g 离心1 min
洗脱基因组DNA，丢弃提取柱。 注意事项： 
1. 操作提取柱和搜集管时应戴好一次性手套； 
2. 搜集基因组DNA前16,000g离心3 min操作必需开盖，以除净乙醇，乙醇残留过量将严重影响基因组搜集质量。 
二、 试剂准备（试剂准备室） 
将试剂从冰箱取出，室温融化，混匀，1000rpm快速离心20秒，备用；
 三、 反应体系配制（试剂准备室） 
1.  依据检测样本数计算所需反应数，如样本数为n，则需做n+2个反应（包含一个阴性对照反应和一个
无模板对照反应）； 
2.  依据表3计算所需各反应液体积，并配制反应体系，反应体系混匀后3000rpm快速离心30秒，分装至PCR管中，每管18μl；

四、 加样（样本处理室） 
   取2μl提取样品DNA加入PCR反应管，盖上管盖，1000rpm离心或轻甩，排除管底气泡；阴性对照反应所用模板为试剂盒中野生型对照品，空白对照反应所用模板为超纯水（自备）。
五、 上机检测（扩增室） 
1. 将PCR管按次序放入PCR仪，设置反应程序 
（1） LineGene FQD-96A荧光定量PCR仪程序设置

l 在52℃时搜集荧光，荧光检测通道选择FAM检测通道，取得扩增曲线及Ct值，实时监测反应进程。 
l Melt分析时，目标温度65℃，起始温度39℃，台阶温度1℃，台阶温度维持30s，荧光采集方法为“台阶”。荧光检测通道选择FAM检测通道。
（2）  ABI7500荧光定量PCR仪

l Melt分析时，选择StepAndHold模式，温度39～65℃，每个步骤升高0.3℃，在每个温度全部搜集荧光。荧光检测通道选择FAM检测通道。
2.    运行PCR反应程序，保留文件。 
六、 结果获取 
荧光定量PCR仪运行结束后，使用配套软件对此次试验结果进行熔解曲线导数图（-dF/dT）分析。  
【参考临界值】 
以野生型对照品反应管为参考，以野生型对照峰峰高1/5划定阈值线。
【检验结果解释】 
1. 空白对照在Linegene FQD-96A中应无显著熔解峰，若分析后出现显著熔解峰，可能为试剂受到污染或操作过程中污染，请排除污染源后重新检测；在ABI7500中，空白对照荧光改变曲线（Normalized Reporter）应为逐步上升一条斜线（图4），若出现荧光值下降熔解特征曲线，可能为试剂受到污染或操作过程中污染，请排除污染源后重新检测； 
2. 野生型对照管在熔解曲线分析后应有单独熔解峰，若野生型对照管无熔解峰，或出现2个或2个以上熔解峰，该批次样本需重新检测。请确定所使用试剂是否仍在使用期内，确定操作是否严格根据说明书进行。 
3. 若满足1和2要求，表明此次试验成功，对样品管进行分析： 
（1） 样品管只出现单独熔解峰，且Tm值在野生型对照管熔解曲线峰Tm±1范围内，该样本判定为阴
性（野生型），图5野生峰； 
（2） 样品管只出现单独熔解峰，且Tm值小于野生型对照管熔解曲线峰Tm值3℃以上，则该样本判定
为阳性（突变型），图5突变峰； 
（3） 样品管出现两个熔解峰，且两个熔解峰分别符合（1）和（2）要求（图6A），或样品管出现
一个宽峰（左右各有一个高点，能够判为峰值，但两峰间平缓过渡，凹陷不显著，见图6B、C和D），则该样本判定为阳性（突变型）； 
（4） 通常情况下不会出现突变峰和野生峰位置相差3℃以内或单一突变峰和野生型对照管野生峰位
置相差1~3℃情况，如确实发生此种情况，考虑仪器温度控制和传感系统是否发生故障； （5） 样品管在熔解曲线分析中无显著熔解曲线峰，可能为DNA样本中存在PCR抑制剂或DNA量不够，请确定样本质量和前处理过程是否规范，必需时再行检测。

【检验方法不足】 
     本试剂盒仅适适用于要求仪器和检测系统，检测结果仅供临床参考，不得作为临床诊治唯一依据。  
【产品性能指标】 
1. 本试剂盒能检出在野生型背景下1%Kras基因12、13密码子多种突变，经1050例非小细胞肺癌和结直肠癌肿瘤组织样本临床试验，本品和测序法作对照，阳性符合率为99.1%，阴性符合率为95.7%，总符合率为97.2%。 
2. 试剂盒应外观清洁、无泄漏、无破损，标志、标签字迹清楚；各组分融化后应澄清透明，无色，无沉
淀。 
3. 检测分别12份阳性参考品，阳性参考品符合率应为100%。 4. 检测10份阴性参考品，阴性参考品符合率应为100%。 
5. 能够检出10ng野生型基因组DNA背景下，含量低至1%K-ras基因突变。 
6. 用2份企业内部精密性参考品分别作10次平行检测，结果均为阳性且Ct值变异系数CV≤8% 或 Tm值极
差≤1℃。
【注意事项】 
1. 本试剂盒仅用于体外研究。试验前请仔细阅读说明书。 
2. PCR检测应在有资质临床PCR试验室进行，试验室应严格根据卫生部《医疗机构临床基因扩增检验
试验室管理措施》卫办医政发〔〕194号文件要求进行资质认定和管理。 3. 试验过程中必需使用专用移液枪和一次性带滤塞加样吸头。 
4. PCR操作各阶段应在不一样分区进行，分别为试剂准备室、样本处理室和PCR扩增室。人、物单向流
动。PCR试剂盒不应存放在样本处理区。 
5. 加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应立即盖紧管盖。 6. PCR操作各阶段使用专用仪器和设备。 
7. 扩增完成立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。 
8. 试验前及试验完成后应该对试验室进行紫外线消毒，并用70%乙醇擦拭工作台和微量加样器。 9. 试剂盒各组份应在使用期内使用，不一样批次试剂盒成份不得混用。