银钟花根尖染色体制片及核型分析.pdf

D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 3-0 9 7 2.2 0 2 4.0 2.0 1 4 文章编号:1 0 0 3-0 9 7 2(2 0 2 4)0 2-0 2 2 2-0 6银钟花根尖染色体制片及核型分析闫明慧1*,孙文光2,张 银1,宁汪洋1,刘彬文1(1.信阳师范大学 生命科学学院,河南 信阳 4 6 4 0 0 0;2.云南师范大学 生命科学学院,云南 昆明 6 5 0 5 0 0)摘 要:以银钟花种子的初生根尖为材料,探讨不同预处理试剂、预处理时间和解离方法对银钟花根尖染色体压片的影响,获得了一套银钟花染色体制片技术,并以此为基础进行核型分析,揭示其核型特征。结果表明:用0.0 0 3 m o l/L的8-羟基喹啉避光处理6 h,卡诺氏固定液固定1 0 h,1 m o l/L HC l在6 0 的恒温水浴锅中解离1 2 m i n,2 0%的卡宝品红染色,可获得分散较好、形态清晰的高质量银钟花染色体压片。银钟花的染色体数目为2n=2 4,核型公式为2n=2 4=2 0 m+4 S m,核型不对称系数为5 5.7 7%,核型分类属于1 B型。关键词:银钟花;染色体;制片技术;核型分析;根尖中图分类号:Q 4 9 2.4 文献标识码:A 开放科学(资源服务)标识码(O S I D):O p t i m i z a t i o n o f C h r o m o s o m e P r e p a r a t i o n T e c h n o l o g y a n d K a r y o t y p e A n a l y s i s o f P e r k i n s i o d e n d r o n m a c g r e g o r i i(C h u n)P.W.F r i t s c hY A N M i n g h u i1*,S U N W e n g u a n g2,Z H A N G Y i n1,N I N G W a n g y a n g1,L I U B i n w e n1(1.C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e s,X i n y a n g N o r m a l U n i v e r s i t y,X i n y a n g 4 6 4 0 0 0,C h i n a;2.C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e s,Y u n n a n N o r m a l U n i v e r s i t y,K u n m i n g 6 5 0 5 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:T h e r o o t t i p s o f P.m a c g r e g o r i i s e e d s w a s u s e d a s t h e r e s e a r c h m a t e r i a l t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s o f d i f f e r e n t p r e t r e a t m e n t r e a g e n t s,p r e t r e a t m e n t t i m e a n d d i s s o c i a t i o n m e t h o d s o n t h e c h r o m o s o m e p r e p a r a t i o n o f P.m a c g r e g o r i i r o o t t i p s.A s e t o f c h r o m o s o m e p r e p a r a t i o n t e c h n i q u e o f P.m a c g r e g o r i i w a s o b t a i n e d a n d u s e d a s t h e b a s i s f o r k a r y o t y p e a n a l y s i s t o r e v e a l i t s k a r y o t y p e c h a r a c t e r i s t i c s,p r o v i d i n g a f o u n d a t i o n f o r t h e c o n s e r v a t i o n a n d g e n e t i c r e s e a r c h o f P.m a c g r e g o r i i.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t p r e t r e a t m e n t w i t h 0.0 0 3 m o l/L 8-h y d r o x y q u i n o l i n e i n t h e d a r k f o r 6 h,f i x a t i o n w i t h C a r n o ys f i x a t i v e f o r 1 0 h,d i s s o c i a t i o n w i t h 1 m o l/L HC l i n a c o n s t a n t t e m p e r a t u r e w a t e r b a t h a t 6 0 f o r 1 2 m i n,a n d s t a i n i n g w i t h 2 0%c a r b o l f u c h s i n c o u l d o b t a i n h i g h-q u a l i t y c h r o m o s o m e s q u a s h o f P.m a c g r e g o r i i w i t h g o o d d i s p e r s i o n a n d c l e a r m o r p h o l o g y.T h e c h r o m o s o m e n u m b e r o f P.m a c g r e g o r i i w a s 2n=2 4,a n d t h e k a r y o t y p e f o r m u l a w a s 2n=2 4=2 0m+4S m,w i t h a n a s y mm e t r y c o e f f i c i e n t o f 5 5.7 7%.T h e k a r y o t y p e w a s c l a s s i f i e d a s t y p e 1 B.K e y w o r d s:P e r k i n s i o d e n d r o n m a c g r e g o r i i(C h u n)P.W.F r i t s c h;c h r o m o s o m e;f i l m i n g t e c h n i q u e;k a r y o t y p e a n a l y s i s;r o o t t i p0 引言银 钟 花(P e r k i n s i o d e n d r o n m a c g r e g o r i i(C h u n)P.W.F r i t s c h)是中国特有的单种属珍稀濒 危 植 物,属 于 菊 类(A s t r i d e)基 部 杜 鹃 花 目(E r i c a l e s)的安息香科(S t y r a c a c e a e)。按照 A P G 系统银钟花作为中国特有种被置于银钟花属中。与银钟花同在银钟花属的还有2个种,分别是H.c a r o l i n a、H.d i p t e r a,全部分布于北美洲1,因此银钟花属被认为具有东亚北美间断分布的特点。但在分子系统学研究当中,2个北美银钟花聚为一支,而银钟花与另一个东亚特有种木瓜红聚为一支,收稿日期:2 0 2 3-0 2-0 7;修回日期:2 0 2 3-0 8-2 3;*.通信联系人,E-m a i l:y a n m i n g h u i 8 8 9 91 6 3.c o m 基金项目:国家自然科学基金项目(3 1 8 0 0 2 7 6);河南省高等学校重点科研项目(1 9 A 1 8 0 0 2 9);信阳师范学院“南湖学者奖励计划”青年项目 作者简介:闫明慧(1 9 8 8),女,河南安阳人,讲师,博士,主要从事植物系统进化研究。引用格式:闫明慧,孙文光,张银,等.银钟花根尖染色体制片及核型分析J.信阳师范学院学报(自然科学版),2 0 2 4,3 7(2):2 2 2-2 2 7.YAN M i n g H u i,S UN W e n g u a n g,Z HAN G Y i n,e t a l.O p t i m i z a t i o n o f C h r o m o s o m e P r e p a r a t i o n T e c h n o l o g y a n d K a r y o t y p e A n a l y s i s o f P e r k i n s i o d e n d r o n m a c g r e g o r i i(C h u n)P.W.F r i t s c hJ.J o u r n a l o f X i n y a n g N o r m a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n),2 0 2 4,3 7(2):2 2 2-2 2 7.222信阳师范学院学报(自然科学版)J o u r n a l o f X i n y a n g N o r m a l U n i v e r s i t y第3 7卷 第2期 2 0 2 4年4月N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n V o l.3 7 N o.2 A p r.2 0 2 4并且2支的距离较远2-3。F R I T S CH等4将银钟花属的3个种与木瓜红进行形态特征比较,发现银钟花与2个北美银钟花和木瓜红在茎、果实、花等形态存在较为明显的区别,所以建议将银钟花从银钟花属中提出单独成立新属 P e r k i n s i o d e n d r o n,更名为 P.m a c g r e g o r i i。银钟花作为一种落叶乔木,其形态优雅、花量大、根系发达,具抗风、耐旱等特性,是非常优秀的绿化观赏树种5。由于生境破坏和自身天然更新不良,银钟花已经被列为珍稀濒危物种6。由于植物的染色体核型相对固定,因此细胞学核型分析是植物学分类以及遗传学研究的重要依据。对染色体进行压片是核型分析的前提,制片步骤一般包括取材、预处理、固定、解离、染色、压片、镜检等。其中,取材、预处理和解离是决定压片效果的关键步骤7。根尖8、芽尖9、愈伤组织1 0等旺盛分裂的植物组织都可以作为染色体压片的材料。而种子初生根由于结构简单、取材不受季节限制等优点,是最常用的染色体压片材料1 1。石从广等1 2利用初生根对安息香属的3个物种进行核型分析,而MO R AWE T Z9则利用花芽压片来确定北美银钟花属和白辛树属的核型。在根尖压片制作的过程中,不同物种的高效预处理试剂和最佳预处理时间有所差异,常用的预处理试剂有8-羟基喹啉和对二氯苯饱和溶液。用0.0 0 2 m o l/L 8-羟基喹啉预处理56 h可以得到3个品种油茶根尖的清晰染色体图像1 3;用对二氯苯饱和溶液作预处理试剂获得了清晰的姜科凹唇姜属的根尖压片1 4。而与银钟花同属于安息香科的芬芳安息香、赛山梅和越南 安 息 香 等 也 是 使 用 饱 和 对 二 氯 苯 溶 液 处 理2.53.0 h,获得清晰的染色体形态1 2。解离的目的是软化并去除植物的细胞壁,使细胞容易被压制分散,另一方面清除细胞内的果胶,使细胞质透明,使后续观察染色体更清晰。解离时间短则解离不彻底,细胞壁束缚染色体不能充分分散,而解离时间过长则容易导致染色体缺失和变形,不利于观察和计数1 5。解离常用的方法有酸解法和酶解法,其试剂分别为盐酸溶液和低浓度的纤维素酶+果胶酶溶液1 6。酸解法中盐酸可以单独使用或与乙醇混合使用,例如,用1 m o l/L盐酸在6 0 下酸解1 0 m i n(或者在2 5 下酸解1 8 m i n),可以获得美洲黑杨大青杨根尖分散效果较好的染色体压片1 7;用体积比11的无水乙醇和浓盐酸解离液处理1 3 m i n,可以获得清晰分散的掌叶梁王茶和八角金盘根尖染色体压片1 8。确定染色体数目和核型是银钟花系统进化、基因组学和保育遗传学研究的基础。目前对银钟花的研究主要集中在野外调查、生长习性、人工促进种子萌发技术等方面1 9-2 1,尚未见对银钟花的染色体数目、核型及染色体压片技术的报道。因此,本研究利用传统的根尖压片技术,从预处理试剂、预处理时间和解离方法等3个方面,探究效果较好的银钟花根尖压片技术,并对银钟花的核型进行分析,以期为银钟花基因组测序、群体遗传分析以及保育遗传学等研究提供基础。1 材料和方法1.1 种子采集与培养于湖南省南岳树木园采集当年生成熟银钟花干燥果实。剥去果实棱翅获得种子,用浓硫酸腐蚀种皮后,在赤霉素溶液中浸泡,并将种子沙藏于冰箱1个月,解除休眠。将冷藏后的种子置于2 5 温室,平铺于托盘,用灭菌纱布保持水分促进萌发。1.2 取材、预处理及固定由于植物细胞分裂具有周期性,取材时间不同会影响压片结果中处于分裂中期细胞的数目。对于大多数种子,初生根在上午8:0 01 0:0 0取材会获得更多的分裂期细胞2 2-2 3。因此,待银钟花种子初生根长至11.5 c m时,在上午8:3 09:0 0切取1 c m左右的根尖进行预处理。预处理试剂的作用是破坏纺锤体的形成,阻止细胞继续分裂,使细胞停留在分裂中期,从而增加压片中分裂中期细胞的数目,便于染色体数目的计算。预处理最佳时间因研究材料和试剂不同而有所差异,预处理时间过短则分裂中期细胞数量少,预处理时间过长则染色体将出现粘连和过度凝缩等现象。为了探究不同试剂的最佳处理时间,本研究对银钟花根尖的预处理试剂和处理时间按照表1进行设置。预处理后,立即用蒸馏水清洗3次,用卡诺氏固定液(V无水乙醇V冰乙酸=31)对根尖进行固定,放置于4 的冰箱中,固定时间为1 0 h。1.3 解离采用酸解法对银钟花根尖细胞进行解离。将根尖从固定液中取出,用蒸馏水清洗3次后,加入1 m o l/L HC l 在6 0 的恒温水浴锅中解离1 0、1 2、1 4 m i n。1.4 染色与压片解离后将材料取出,用蒸馏水轻柔冲洗3次,322闫明慧,孙文光,张银,等.银钟花根尖染色体制片及核型分析用2 0%的卡宝品红染色2 4 h。然后取根尖置于载玻片上,用刀片切下根尖0.51.0 mm,滴加少量染液后盖上盖玻片,用滤纸压紧盖玻片,再轻敲使细胞分散,便于镜检。挑选染色体处于分裂中期的分散良好的细胞进行拍照。表1 根尖预处理方法T a b.1 T h e p r e t r e a t m e n t m e t h o d s o f r o o t t i p序号预处理试剂预处理时间/h10.0 0 3 m o l/L 8-羟基喹啉246820.2%秋水仙素34563饱和对二氯苯23451.5 图像处理与分析参考李懋学等2 4提出的标准,选取来自不同细胞的6 0个染色体分散较好的中期细胞统计染色体数目。取5个染色体形态轮廓清晰且无重叠的细胞进行核型分析。染色体纵向收缩程度均匀一致,缢痕区显示清晰的染色体中期照片进行核型分析。参考 L E VAN 等2 5方法分别计算相对长度、相对长度系数等相关核型参数,参考A R ANO2 6的方 法 计 算 核 型 不 对 称 系 数。利 用A d o b e P h o t o s h o p 2 0 2 2对同源染色体进行配对,并制作核型模型图。用迅捷C A D编辑器测定染色体长度,用E x c e l进行数据汇总和核型参数的计算2 7。2 结果与分析2.1 银钟花根尖压片技术优化3种不同预处理试剂,在不同处理时间下对银钟花根尖染色体压片的影响不同。首先,0.0 0 3 m o l/L的8-羟基喹啉、0.2%秋水仙素、饱和对二氯苯等3种试剂作为预处理试剂,均可以获得较为清晰 的 银 钟 花 根 尖 染 色 体 压 片,而 使 用0.0 0 3 m o l/L的8-羟基喹啉避光处理6 h获得的压片效果最佳(图1 C);其次,0.2%秋水仙素处理5 h及饱和对二氯苯处理4 h,效果次之。其中,用0.0 0 3 m o l/L的8-羟基喹啉避光处理4 h时,染色体分散良好,但形态较长(图1 B),而预处理时间达到8 h时,染色体则过度浓缩(图1 D)。注:AD:0.0 0 3 m o l/L 8-羟基喹啉处理2、4、6、8 h;EH:0.2%秋水仙素处理 3、4、5、6 h;IL:饱和对二氯苯处理2、3、4、5 h。图1 不同预处理方法获得的银钟花根尖染色体形态F i g.1 C h r o m o s o m e m o r p h o l o g y o f t h e r o o t t i p s o f P.m a c g r e g o r i i o b t a i n e d b y d i f f e r e n t p r e-t r e a t m e n t m e t h o d s422第3 7卷 第2期信阳师范学院学报(自然科学版)h t t p:/j o u r n a l.x y n u.e d u.c n2 0 2 4年4月 解离时间探究结果表明,用1 m o l/L HC l在6 0 解离1 2 m i n的解离效果最好,获得的压片细胞分散均匀,染色体清晰(图2 B);而其他处理时长条件下的解离效果不佳,镜检视野中细胞未分散开或染色体变形,不易观察和计数(图2 A、C)。注:A为解离1 0 m i n;B为解离1 2 m i n;B为解离1 4 m i n。图2 不同解离时间的银钟花染色体形态F i g.2 C h r o m o s o m e m o r p h o l o g y o f P.m a c g r e g o r i i w i t h d i f f e r e n t d i s s o c i a t i o n t i m e2.2 核型分析通过统计来自不同根尖的细胞染色体数目,银钟花体细胞染色体条数为2 4。核型公式为2n=2 4=2 0 m+4 S m,n为配子体染色体个数,m为中着丝粒染色体,S m为近中着丝粒染色体,主要的核型特征见表2。银钟花的2 4条染色体中1 0对为中部着丝点染色体,2对为近中部着丝点染色体,无随体(图3)。染色体相对长度为2.0 4%6.1 7%,臂 比 值 为1.0 31.8 6,着 丝 点 指 数 为3 1.5 5%4 9.1 5%,染色体相对长度组成为2n=4 L+6 M 2+1 2 M 1+2 S,最长染色体与最短染色体相对长度之比为3.0 2,没有臂比值大于2的染色体。核型不对称系数(A s.K.%)为5 5.7 7%,为1 B核型。表2 银钟花染色体核型参数T a b.2 K a r y o t y p i c p a r a m e t e r s o f P.m a c g r e g o r i i c h r o m o s o m e s染色体编号相对长度(长臂+短臂)/%臂比(长臂/短臂)着丝点位置 着丝点指数/%相对长度系数相对长度类型13.0 2+3.1 5=6.1 71.0 4m4 8.9 51.4 7L22.4 8+3.3 5=5.8 31.3 5m4 2.5 41.4 0L32.3 1+2.7 4=5.0 51.1 9m4 5.7 41.2 1M 241.5 3+2.8 1=4.8 51.8 4S m3 1.5 51.1 6M 251.8 9+2.4 5=4.3 41.3 0m4 3.5 51.0 4M 261.5 3+2.5 6=4.0 91.6 7m3 7.4 10.9 8M 171.3 0+2.4 2=3.7 21.8 6S m3 4.9 50.8 9M 181.7 1+1.9 6=3.6 71.1 5m4 6.5 90.8 8M 191.6 8+1.8 9=3.5 71.1 2m4 7.0 60.8 6M 11 01.7 4+1.8 0=3.5 41.0 3m4 9.1 50.8 5M 11 11.5 1+1.7 0=3.2 11.1 3m4 7.0 40.7 7M 11 20.9 4+1.1 0=2.0 41.1 7m4 6.0 80.4 9S 注:m为中着丝粒染色体;S m为近中着丝粒染色体;L为长染色体;M 1为中染色体;M 2为中短染色体;S为短染色体。注:A为银钟花染色体中期分裂相;B为染色体核型分析;C为染色体核型模式。图3 银钟花染色体核型分析及模式图F i g.3 K a r y o t y p e a n a l y s i s a n d p a t t e r n d i a g r a m o f P.m a c g r e g o r i i3 讨论3.1 银钟花染色体压片技术虽然石从广等1 2使用饱和对二氯苯溶液处理2.53.0 h获得了银钟花近缘种 芬芳安息香、赛山梅和越南安息香等染色体的清晰形态。但在本研究中,饱和对二氯苯溶液和0.2%秋水仙素处理后的压片效果都不理想,只有0.0 0 3 m o l/L 8-羟基喹啉处理的材料获得了清晰的染色体压片。而银钟花根尖压片的最佳解离试剂和解离条件为1 m o l/L的HC l在6 0 的恒温水浴锅中解离1 2 m i n,此时,可以获得分散、清晰的银钟花根尖染色体形态图像。3.2 安息香科核型分析银钟花有2 4条染色体,与安息香科北美银钟花属、白辛树属和部分安息香属等3属的染色体数目一致。安息香科分布最广、物种数最多的安息香属,其大部分物种的染色体数目为1 69,少数染色体数目为4 02 8,因此,判断安息香科的染色体基数为8。银钟花浓缩中期的染色体相对长度在2.0 46.1 7,小于前期研究中芬芳安息香(1 0.6 32 0.8)、522闫明慧,孙文光,张银,等.银钟花根尖染色体制片及核型分析越南安息 香(1 0.0 31 5.0 3)、赛 山 梅(1 0.0 41 4.6 9)1 2、中华安息香(3.2 47.9 1)和中越安息香(8.6 91 4.2 1)2 8的染色体相对长度。此外,核型的对称与不对称程度根据臂比大于2的染色体百分比和染色体的长度比这两项特征进行区分,划分为1 2种类型2 9。安息香属的核型多为A型,表明其进化地位较低,物种较为原始,而银钟花属于1 B核型,相比于安息香属植物,银钟花的进化地位较高。在安息香科的系统发育基因组学研究中,利用叶绿体基因组数据构建的系统进化关系表明,安息香属是安息香科最先出现的类群,是祖先类群,而银钟花是较晚出现的类群,是进化类群3,本研究的核型结果支持前期基因组数据分析的结论。4 结束语本研究优化了银钟花染色体制片技术,明确了银钟花的染色体数目和核型,丰富了安息香科物种的染色体数据,但安息香科的染色体数据仍不充分,核型进化分析无法有效开展,对于染色体基数的推测还需要更多相关类群染色体数据的补充。致谢:感谢南岳树木园谢咏红老师在种子收集上给予的帮助;感谢云南师范大学李志敏教授在实验技术方面给予的指导和帮助。参考文献:1 A P G.A n u p d a t e o f t h e A n g i o s p e r m P h y l o g e n y G r o u p c l a s s i f i c a t i o n f o r t h e o r d e r s a n d f a m i l i e s o f f l o w e r i n g p l a n t s:A P G I VJ.B o t a n i c a l J o u r n a l o f t h e L i n n e a n S o c i e t y,2 0 1 6,1 8 1(1):1-2 0.2 F R I T S CH P W,MOR T ON C M,CHE N T a o,e t a l.P h y l o g e n y a n d b i o g e o g r a p h y o f t h e S t y r a c a c e a eJ.I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f P l a n t S c i e n c e s,2 0 0 1,1 6 2(S 6):9 5-1 1 6.3 YAN M i n g h u i,F R I T S CH P W,MOOR E M J,e t a l.P l a s t i d p h y l o g e n o m i c s r e s o l v e s i n f r a f a m i l i a l r e l a t i o n s h i p s o f t h e S t y r a c a c e a e a n d s h e d s l i g h t o n t h e b a c k b o n e r e l a t i o n s h i p s o f t h e E r i c a l e sJ.M o l e c u l a r P h y l o g e n e t i c s a n d E v o l u t i o n,2 0 1 8,1 2 1:1 9 8-2 1 1.4 F R I T S CH P W,YAO X i a o h o n g,S I M I S ON W B,e t a l.P e r k i n s i o d e n d r o n,a n e w g e n u s i n t h e S t y r a c a c e a e b a s e d o n m o r p h o l o g y a n d D NA s e q u e n c e sJ.J o u r n a l o f t h e B o t a n i c a l R e s e a r c h I n s t i t u t e o f T e x a s,2 0 1 6,1 0(1):1 0 9-1 1 7.5 WU Z h e n g y i,R AV E N P H.F l o r a o f C h i n aM/O L/L OU I S S T.M i s s o u r i b o t a n i c a l g a r d e n 1 9 9 4-2 0 1 3.B e i j i n g:S c i e n c e P r e s s(2 0 2 2-0 5-2 1)2 0 2 2-1 1-2 5.h t t p s:/s e a r c h w o r k s.s t a n f o r d.e d u/v i e w/1 1 3 4 6 9 5 5.6 傅立国.中国植物红皮书.第一册M.北京:科学出版社,1 9 9 1.F U L i g u o.T h e r e d b o o k o f C h i n e s e p l a n t s.V o l u m e IM.B e i j i n g:S c i e n c e P r e s s,1 9 9 1.7 丁鸿,邱东萍,陈少雄.植物染色体标本的制备和染色体核型分析研究进展J.南方农业学报,2 0 1 2,4 3(1 2):1 9 5 8-1 9 6 2.D I NG H o n g,Q I U D o n g p i n g,CHE N S h a o x i o n 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