氟氯氰菊酯通过GADD45...K通路对大鼠肾脏损伤的影响_孙祎平.pdf

宁夏医科大学学报45卷收稿日期：2022-08-30基金项目：国家自然科学基金项目（81960584）作者简介：孙祎平（1993），男，在读硕士研究生，研究方向：环境有害因素的健康效应研究。通信作者：杨惠芳，女，教授，博士研究生导师，研究方向：环境有害因素的健康效应研究。E-mail：农药的广泛使用可以提高农作物的产量，但在环境中的农药残留会对人和动物的身体健康造成很大的影响。拟除虫菊酯因具有高效、易降解、低毒等特点，在全球范围内都有着广泛的应用1。课题组前期研究2发现，在银川市近郊蔬菜大棚内农药残留中，氟氯氰菊酯的残留量最多。氟氯氰菊酯作为重要的型拟除虫菊酯类农药，广泛应用于卫生害虫防治3。有研究4显示，拟除虫菊酯可引起肾脏形态结构异常改变、肾功能障碍，而氟氯氰菊酯对肾脏的毒性机制尚不清楚。生长停滞和 DNA 损伤诱导 （growth arrest andDNA damage-inducible 45，GADD45B）是一种应激蛋白，与细胞周期停滞、细胞凋亡和致癌应激的反应等密切相关5。抑制 GADD45B 可以防止蛋白尿以及减轻足细胞的损伤，从而保护肾小球6。在肾脏损伤过程中，MAPK 作为一条关键的信号通路，其中的关键因子 p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）明显上调7。GADD45B 介导 JNK/p38MAPK通路在氟氯氰菊酯所致大鼠肾脏损伤中的关系尚不明确，因此，本研究旨在探讨在氟氯氰菊酯诱导大鼠肾脏损伤中 MAPK 通路的作用，为进一步阐明毒性机制，建立早期预防策略提供理论依据和方法。1资料与方法1.1实验动物选择 40 只 Wistar 雄性大鼠，SPF 级，体质量260280 g，购自辽宁昌盛生物技术有限公司 动物合格证号：SCXK（Liao）2015-0001。所有大鼠氟氯氰菊酯通过 GADD45B 介导 JNK/p38MAPK通路对大鼠肾脏损伤的影响孙祎平1，2，李晓玉1，2，谢永鑫1，2，赵吉1，2，孙健1，2，王瑞1，2，宋亚男1，2，杨惠芳1，2（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川750004；2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川750004）摘要：目的探讨氟氯氰菊酯暴露通过影响生长停滞和 DNA 损伤诱导 （GADD45B）水平并介导 JNK/p38MAPK 通路对大鼠肾脏损伤的影响。方法将 40 只 SPF 级 Wistar 雄性大鼠按随机数表法分为 4 组，即对照组、氟氯氰菊酯低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组 10 只。隔天灌胃连续染毒 28 d，取肾脏组织称量后计算脏器系数。HE 染色光镜下观察大鼠肾脏组织病理形态变化；透射电镜观察肾脏细胞超微结构变化；应用试剂盒检测肾脏组织中氧化损伤指标超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量变化；应用 Western blot、qPCR检测 GADD45B、p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK mRNA 及蛋白表达水平变化。结果与对照组相比，氟氯氰菊酯染毒大鼠体质量增长、肾脏质量和脏器系数的差异均无统计学意义（P 均0.05）；HE 染色结果显示：与对照组相比，随着氟氯氰菊酯染毒剂量的增加，肾小管肿胀越发明显，肾小管上皮细胞大量脱落，肾小球萎缩。透射电镜结果显示：与对照组相比，随着氟氯氰菊酯染毒剂量的增加，基底膜逐渐增厚，线粒体和内质网出现不同程度损伤。与对照组比较，低、中、高剂量组 MDA 含量均升高（P 均0.05）、SOD 活力均降低（P 均0.05）。与对照组相比，氟氯氰菊酯低、中、高剂量组中 GADD45B 的 mRNA 表达水平均升高（P 均0.05）；JNK和 p38MAPK 的 mRNA 表达水平均降低（P 均0.05）。Western blot 结果显示，与对照组比较，氟氯氰菊酯低、中、高剂量组中 GADD45B、p-JNK、p-p38 的蛋白表达水平均升高（P 均0.05）；JNK 和 p38 的蛋白表达水平均降低（P 均0.05）。结论在氟氯氰菊酯致大鼠肾脏损伤中，GADD45B 可通过激活 JNK/p38MAPK 通路诱导大鼠肾脏损伤。关键词：GADD45B；氟氯氰菊酯；肾脏；JNK/p38MAPK 通路中图分类号：R114文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.03.003文章编号：1674-6309（2023）03-0230-06论著第 45 卷3 期2023 年 3 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University2303期基因名称方向序列GADD45BForwardReverseJNK1ForwardReverseJNK2JNK3ForwardReversep38MAPKForwardReverseTGCCTCCTGGTCACGAACTGTCCCACTGGTTATTGCCTCTGCTCTCTGACAGGACAGGACGAGCAGTAGTGTGTGGGTGTGTGGCAGAAACCAGTCGTGTGGTGTCCTTGGTGTGGGCAAGTTCAAGCAAGCATTTGACGCCAACTTGTGTCAGGTGATTCCAGCGGAGTGGAGGTGTTTGATGACAGTCCTCTCCTCTCCTCTCCTCTCGGTTCTCCCTTTGTTCGGTTTGForwardReverse饲养于标准动物房，饲料喂养，自由饮水，饲养环境温度（222），相对湿度 60%70%，保持 12 h光照（8：3020：30）和 12 h 黑暗（20：30 至次日8：30）交替循环。大鼠适应性喂养 1 周后，设置对照组（玉米油），氟氯氰菊酯低剂量组（6.25 mg kg-1）、中剂量组（12.50 mg kg-1）和剂量组（25.00 mg kg-1），每组 10 只。对大鼠进行隔天称重，根据前一天称取的体质量配制染毒药物。采用等浓度法进行灌胃染毒，对照组大鼠灌胃等量玉米油，隔天染毒，持续 28 d，随后麻醉处死大鼠，在无菌条件下收集肾脏组织，各动物处理方法均严格遵守中华人民共和国实验动物操作的相关规定，本研究项目获得宁夏医科大学伦理委员会（IACUC-NYLAC-2021-101）批准。1.2主要试剂与仪器氟氯氰菊酯（德国 Dr.Ehrenstorfer 公司）；丙二醛（malondialde hyde，MDA）试剂盒（北京索莱宝公司）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白检测试剂盒（江苏凯基公司）；全蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒（上海碧云天公司）；GAPDH、GADD45B、p-p38MAPK、p-JNK、p38MAPK、JNK 抗体（中国 Affinity 公司）。蛋白Marker（美国 Thermo Fisher 公司）；Trizol（美国 Invitrogen 公司）；引物由上海生工公司合成。1.3观察指标1.3.1HE 染色取出切割好的肾脏组织和对应的标签放入脱水箱，分别在 75%、85%、90%和95%的乙醇梯度中脱水 1 h，在无水乙醇和无水乙醇中分别脱水 30 min，接着放置于二甲苯和二甲苯中分别脱水 5 min。经过包埋、切片、染色，用显微镜（40）观察肾脏组织的形态结构变化。1.3.2透射电镜取 3 mm1 mm1 mm 的新鲜肾脏组织，放入 4 固定液中 24 h，然后放入1%渗透压 0.1 mol L-1磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中固定 2 h。经过 50%70%80%90%95%100%100%乙醇100%丙酮脱水，每次 15 min；环氧树脂包埋样本；超薄切片机切 6080 nm 超薄切片；醋酸铀染色 30 min，待切片室温干燥后，在透射电子显微镜下观察，采集图像分析。1.3.3MDA 检测使用 MDA 试剂盒检测其含量，取 0.1 g 肾脏组织，加入 1 mL 提取液进行冰浴匀浆；8 000g 4 C 离心 10 min，取上清，置冰上待测。根据说明书将样本加入 96 孔板中，测定各样本在 532 nm 和 600 nm 处的吸光度，计算MDA 含量，实验重复 3 次。1.3.4SOD 检测称取 50 mg 组织，加入 0.45 mL生理盐水，剪碎组织，冰水浴制备匀浆，3 000 r min-1，离心 10 min，取 10%匀浆上清液冰上待测。样本准备好后用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。根据说明书将样本加入 96 孔板中，测定各样本在 450 nm处的吸光度。SOD 抑制率（%）=（A对照-A对照空白）-（A测定-A测定空白）/（A对照-A对照空白）100%，SOD活力（U mg prot-1）=SOD 抑制率（%）/50%12/待测样本蛋白浓度（mg prot mL-1），实验重复 3 次。1.3.5qPCR 检测取出肾脏组织放置于冰上，使用 Trizol 法提取总 RNA，逆转录合成 cDNA。引物序列见表 1，扩增条件为：95 预变性 5 min，95 变性 10 s、60 退火 30 s、60 延长 30 s，45 个循环。根据扩增曲线数据，分析扩增曲线后计算 2-Ct，分析相关因子的 mRNA 表达水平，每个样品重复试验 3 次。1.3.6Western blot 检测取 50 mg 肾脏组织，加入 0.5 mL 的组织裂解液进行冰浴匀浆研磨，12 000 r min-1，4 离心 10 min，提取肾脏组织表 1引物序列孙祎平，等.氟氯氰菊酯通过GADD45B介导JNK/p38MAPK通路对大鼠肾脏损伤的影响231宁夏医科大学学报45卷全蛋白，采用 BCA 法测定蛋白浓度，配制 SDS-PAGE 凝胶，80 V 稳定电压电泳后转模，3%BSA封闭 1 h，于 11 000 稀释的一抗中 4 孵育过夜，经 TBST 清洗 3 次，10 min/次，再于 11 000稀释的二抗室温孵育 1 h，用 TBST 清洗 3 次，10 min/次，使用 ECL 发光液于避光条件下进行曝光。应用 Image J 软件计算各条带的灰度值。1.4统计学方法采用 SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数标准差（xs）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用 Dunnett-t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1氟氯氰菊酯对大鼠体质量的影响经过氟氯氰菊酯染毒，各组大鼠体质量差异无统计学意义，染毒前与染毒 14 d、28 d 相比，差异无统计学意义（P 均0.05），见表 2。表 2氟氯氰菊酯对大鼠体质量的影响（xs，g）组别n染毒前染毒 14 d染毒 28 d对照组10336.2010.18417.0218.16471.2020.16低剂量组10338.907.25421.6518.29472.4019.87中剂量组10336.3014.02422.1017.15433.9043.22高剂量组10347.5011.27419.3016.51425.1027.84F 值1.7530.9412.197P 值0.1710.4270.1282.2氟氯氰菊酯对大鼠肾脏质量及脏器系数的影响经过氟氯氰菊酯染毒各组大鼠肾脏质量和脏器系数差异均无统计学意义（P 均0.05），见表 3。表 3氟氯氰菊酯对大鼠肾脏质量及器官系数的影响组别肾脏质量/g器官系数/%对照组2.700.230.570.04低剂量组2.800.270.610.04中剂量组2.630.230.580.05高剂量组2.600.250.560.05F 值P 值0.6290.3930.6160.7622.3氟氯氰菊酯染毒对大鼠肾脏组织结构的影响2.3.1光镜下 HE 染色病理切片观察大鼠肾脏形态结构变化对照组显示，肾小球和肾小管形态和结构清晰，未见明显异常，肾小球系膜细胞、内皮细胞等结构均正常，毛细血管腔未见异常扩张；氟氯氰菊酯染毒组显示肾小管水肿，肾小管上皮细胞脱落，肾小球萎缩，且随染毒剂量增加损伤越明显，见图 1。2.3.2透射电镜观察大鼠肾脏超微结构变化电镜下对照组可见肾小管上皮细胞排列规则，线粒体、内质网结构正常。氟氯氰菊酯染毒组显示肾脏小管细胞基底膜逐渐增厚，线粒体出现肿胀，在高剂量组中出现了空泡样病变，见图 2。对照组低剂量组中剂量组高剂量组图 1各组大鼠肾脏形态病理切片（HE40，：肾小球）2323期2.4氟氯氰菊酯染毒对大鼠肾脏组织氧化应激指标 SOD、MDA 水平的影响与对照组相比，随着氟氯氰菊酯染毒剂量的升高，SOD 活力呈现降低趋势，MDA 含量呈现升高趋势（P 均0.05），见图 3。2.5氟 氯 氰 菊 酯 染 毒 对 大 鼠 肾 脏 组 织 中GADD45B、JNK和p38MAPK、p-JNK和p-p38MAPK表达的影响qPCR 与 Western blot 结果均显示，与对照组相比，中、高剂量组 GADD45B 的 mRNA 和蛋白表达水平均随染毒剂量的增高而上调（P 均0.05），JNK 和 p38MAPK 的蛋白和 mRNA 表达水平均随染毒剂量的增高而下降（P 均0.05），p-JNK 和p-p38MAPK 的蛋白表达水平均随染毒剂量的增高而上调（P 均0.05），见图 4图 6。A、B.Western blot 检测氟氯氰菊酯暴露后 GADD45B 的表达情况；C.定量分析 GADD45B mRNA 和蛋白表达水平；与对照组比较*P0.01。图 4氟氯氰菊酯染毒后大鼠肾脏中 GADD45B 的表达变化A.Western blot 检测结果；B.蛋白相对表达量；与对照组比较*P0.05，*P0.01。图 5氟氯氰菊酯染毒后大鼠肾脏中 MAPK 通路相关因子的蛋白表达变化图 2透射电镜观察氟氯氰菊酯暴露对大鼠肾脏细胞影响（标尺=1 m）对照组低剂量组中剂量组高剂量组孙祎平，等.氟氯氰菊酯通过GADD45B介导JNK/p38MAPK通路对大鼠肾脏损伤的影响A.氟氯氰菊酯染毒后大鼠肾脏SOD含量变化；B.氟氯氰菊酯染毒后大鼠肾脏MDA含量变化；与对照组比较*P0.05，*P0.01。图 3氟氯氰菊酯染毒后大鼠肾脏中 SOD 及 MDA 的变化*对照组低剂量组中剂量组高剂量组12080400SOD 活力/（U mg prot-1）150100500MDA 含量/（nmol g-1）对照组低剂量组中剂量组高剂量组GADD45BGAPDH22 kDa37 kDaGADD45B 蛋白相对表达量3210*对照组低剂量组中剂量组高剂量组对照组低剂量组中剂量组高剂量组对照组低剂量组中剂量组高剂量组*GADD45B mRNA 相对表达量3210ABCAB对照低中高对照组低剂量组中剂量组高剂量组JNKp38MAPKp-JNKp-p38MAPK43210蛋白相对表达量46/54 kDa46/54 kDa41 kDa43 kDa37 kDaJNKp-JNKp38MAPKp-p38MAPKGAPDH*233宁夏医科大学学报45卷JNK1*15100500mRNA 相对表达量对照组低剂量组中剂量组高剂量组JNK2JNK3p38MAPK*3讨论拟除虫菊酯对人类和哺乳动物具有不同程度的毒性，包括神经系统毒性、生殖毒性、肝脏毒性和肾脏毒性8。研究9显示，拟除虫菊酯的蓄积可通过多种机制导致肾脏损害，如氧化应激、细胞凋亡、炎症等。高效氯氟氰菊酯和溴氰菊酯对鹌鹑肾脏的损伤体现在肾小管和肾小球组织结构的破坏10-11。本研究通过 HE 染色显微镜下观察发现，随着染毒剂量的增加，肾小管浑浊肿胀，肾小球萎缩，肾小管上皮细胞逐渐坏死脱落，伴有炎性细胞浸润，与 Deng 等12的研究结果一致。研究13发现，溴氰菊酯可导致大鼠肾脏中核染色质浓缩，细胞核浓缩分裂，线粒体肿胀，嵴断裂或消失，说明氟氯氰菊酯可对大鼠肾脏超微结构造成损伤，与本实验结果一致。研究14表明，拟除虫菊酯会打破体内氧化-抗氧化平衡状态，导致过量的 ROS 产生，从而影响肾脏结构、代谢功能，进而对机体造成危害。ROS是导致肾脏损伤发生和发展的关键因素15。ROS可以使机体产生脂质过氧化反应，从而引发链式反应，最终将损伤放大。而 MDA 作为脂质过氧化反应的标志性产物，能够间接地反映机体氧化损伤的程度16。SOD 是一种抗氧化酶，在体内能够清除氧自由基，促进氧自由基分解，使其处于生成与消除的平衡状态，降低自由基对细胞膜的损伤17。本研究显示，随着染毒剂量的增加，SOD 活力下降，MDA 含量增加，说明氟氯氰菊酯染毒使大鼠肾脏组织氧化应激水平增加，最终导致氧化损伤的发生。GADD45B 是一种普遍表达的蛋白质，是GADD45 基因家族的成员，参与介导细胞周期停滞、DNA 损伤修复和细胞凋亡等18。在肾脏疾病中，GADD45B 可激活 MAPK 通路导致疾病进一步发展，通过调控 MAPK 级联反应，使 p38MAPK 磷酸化从而诱导足细胞凋亡19。有报道7称，Heymann肾炎大鼠和足细胞特异性缺失小鼠中 GADD45B表达上调，表明其参与对肾脏的损伤。有研究20观察到，斑马鱼肾小球足细胞损伤中，GADD45B过表达会促进足细胞的凋亡和蛋白尿，同时抑制GADD45B 的表达可以缓解足细胞损伤并减少蛋白尿，ROS 可介导 GADD45B 的上调，同时GADD45B 过表达可激活 p38MAPK 通路，使其诱导足细胞损伤。在本研究中，GADD45B、p-JNK、p-p38MAPK 表达水平均随染毒剂量的升高而升高，JNK、p38MAPK 表达水平均随染毒剂量的升高而降低，提示氟氯氰菊酯暴露可引起GADD45B表达异常，进而诱导 JNK 和 p38MAPK 信号通路的磷酸化导致肾脏损伤。综上所述，氟氯氰菊酯具有一定的肾脏毒性，可使大鼠肾脏氧化应激水平增加，GADD45B可能通过调控 JNK/p38MAPK 促使大鼠肾脏损伤，后续还将构建细胞模型进一步证明及研究。参考文献：1 Ravula AR，Yenugu S.Effect of oral administration ofa mixture of pyrethroids at doses relevant to humanexposure on the general and male reproductive physiology in the ratJ.Ecotoxicol Environ Saf，2021，208（1）：111714.2 吴冰.银川市郊蔬菜大棚农药残留现况及种植人员心血管健康影响因素分析 D.银川：宁夏医科大学，2016.3 Syed F，Chandravanshi LP，Khanna VK，et al.Beta-cyfluthrin induced neurobehavioral impairments in adultrats J.Chem Biol Interact，2016，243（1）：19-28.4 Liu C，Wu M，Qu J，et al.JNK and Jag1/Notch2 co-regulate CXCL16 to facilitate cypermethrin-inducedkidney damage J.Ecotoxicol Environ Saf，2022，238（2）：113582.5 Yilmaz M，Rencuzogullari E，Canli M.The effects ofcyfluthrin on some biomarkers in the liver and kidneyof Wistar rats J.Environ Sci Pollut Res Int，2015，22（6）：4747-4752.6 Pippin JW，Durvasula R，Petermann A，et al.DNAdamage is a novel response to sublytic complementC5b-9-induced injury in podocytes J.J Clin Invest，2003，111（6）：877-885.7 Tang W，Wang D，Wang J，et al.Pyrethroid pesticideresidues in the global environment：An overviewJ.Chemosphere，2018，191（1）：990-1007.8 Ncir M，Saoudi M，Sellami H，et al.In vitro and in vivo与对照组比较*P0.05，*P0.05）.The results of HE staining showed that compared with the control group，with the（下转第 257 页）孙祎平，等.氟氯氰菊酯通过GADD45B介导JNK/p38MAPK通路对大鼠肾脏损伤的影响2353期increase of cyfluthrin dose，the renal tubule swelling became more and more obvious，a large number of renaltubular epithelial cells fell off，and the glomeruli atrophied.The results of transmission electron microscopeshowed that compared with the control group，with the increase of the dose of cyfluthrin，the basement membranethickened gradually，and the mitochondria and endoplasmic reticulum were damaged in different ways.Com-pared with the control group，the content of MDA in low，medium and high dose groups increased（Pall0.05），SOD activity decreased（P all0.05）.Compared with the control group，the protein expression levelsof GADD45B，p-JNK and p-p38MAPK were increased in low，middle and high dose cyfluthrin groups（Pall0.05），while the protein expression levels of JNK and p38MAPK were decreased in cyfluthrin groups（Pall0.05）.Western blot showed that compared with the control group，the mRNA expression levels ofGADD45B，p-JNK and p-p38MAPK in the low，middle and high dose groups of cyfluthrin were all increased（Pall0.05），and the mRNA expression levels of JNK and p38MAPK were decreased（P all0.05）.ConclusionGADD45B can induce renal injury in rats by activating the JNK p38MAPK pathway during cyfluthrin in-duced renal injury.Key words：GADD45B；cyfluthrin；kidney；JNK/p38MAPK signaling pathway（上接第 235 页）马世玲，等.FGF21过表达抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭并促进细胞凋亡ing FGF21 were detected by Western blot and RT-qPCR.Apoptosis of PANC-1 cells overexpressing FGF21was detected by flow cytometry，proliferation was detected by CCK-8 assay，migration and invasion ability weredetected by scratch healing assay and Transwell assay.ResultsAfter transfection of human pancreatic cancercell line PANC-1 with HBLV-h-FGF21-3xflag-ZsGreen-PURO，the expression level of FGF21 protein washigher than that of the empty vector infected group，and the expression levels of apoptosis protein Caspase3，Cleaved-caspase3，and Caspase9 were also higher（P all0.01）.The mRNA expression level of FGF21 washigher than that of the empty vector infected group，and the mRNA expression levels of TNF-a and IL-6 werelower（P all0.01）.FGF21 overexpression increased the apoptosis rate of gemcitabine induced pancreatic cancercell line（PANC-1），and decreased the proliferation，migration and invasion ability（P all0.01）.ConclusionFibroblast growth factor 21 can inhibit the proliferation，migration and invasion of pancreatic cancer cells andpromote cell apoptosis.Key words：pancreatic cancer；transfection；slow virus；fibroblast growth factor 21257