眼线百合花器官植株再生技术研究.pdf

Journal of Xian Natural Science Edition)U1V0ct.20232023年10 月Vol.26No.4西安文理学院自然科学版）第2 6 卷第4期文章编号：10 0 8-556 4(2 0 2 3)0 4-0 0 6 3-0 7眼线百合花器官植株再生技术研究李莺，石格格,吴永朋，康小燕3，丁群英1（1.西安文理学院生物与环境工程学院，西安7 10 0 6 5;2.陕西省西安植物园（陕西省植物研究所）陕西省植物资源保护与利用工程技术研究中心，西安7 10 0 6 1;3.西安洋东现代都市农业发展有限公司，西安7 10 10 0）摘要：以眼线百合的花器官为外植体进行组织培养，采用正交设计进行激素浓度配比，经过组织培养获得再生植株.结果表明：眼线百合花器官不同部位诱导情况不同，最容易诱导的为子房，其次为花丝，最难诱导的是花药.不同阶段的最优培养基有所不同，在诱导愈伤组织的过程中，花丝适宜培养基为MS+2,4-D0.5mg/L+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L,子房适宜培养基为MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L;在出芽诱导中，两种外植体最佳培养基均为MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L.在未添加激素的MS培养基中对试管苗进行壮苗培养，既可以诱导生根又可以达到壮苗的目的.眼线百合试管苗移栽基质配比为草炭：沙：蛭石：珍珠岩=10：2：1：1，成活率高达9 8%.关键词：眼线百合；花器官；植株再生中图分类号：Q943.1文献标志码：AResearch on the Technology of Plant Regenerationfor Flower Organ of Lilium EyelinerLI Ying,SHI Ge-ge,WU Yong-peng,KANG Xiao-yan,DING Qun-ying(1.School of Biological and Environmental Engineering,Xi an University,Xi an 710065,China;2.Shaanxi Engineering Research Centre for Conservation and Utilization of Botanical Resources,Xian Botanical Garden of Shaanxi Province(Institute of Botany of Shaanxi Province),Xian 710061,China;3.Xian Fengdong Modern Urban Agriculture Development Co.Ltd,Xian 710100,China)Abstract:The flower organs of Lilium Eyeliner were used as explants for tissue culture,andthe hormone concentration ratio was determined by orthogonal design.The regenerated plantswere obtained through tissue culture.The results showed that the induction of different parts ofthe flower organs of Lilium Eyeliner was different.The ovary was the most easily induced,fol-lowed by the filament,and the anther was the most difficult to induce.The optimal culture me-dium for different stages varies.During the process of inducing callus,the suitable culture me-dium for filaments is MS+2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L,and the suitableculture medium for ovaries is MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L.In bud induction,the opti-mal medium for both explants is MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L.Cultivating strong seed-lings in MS medium without adding hormones can not only induce rooting but also achieve the收稿日期:2 0 2 2-0 9-16基金项目：西安市科技局计划项目（2 0 NYF0054）；陕西省航天育种中心资助项目（HTYZ2101）；西安文理学院服务地方专项项目（2 0 2 2 FWDF03）作者简介：李莺（19 6 4一）,女，浙江杭州人，西安文理学院生物与环境工程学院教授，主要从事植物组织培养研究.64第2 6 卷西安文理学日然科学版goal of strong seedlings.The ratio of transplanting medium of test tube seedlings of LiliumEyeliner is peat:sand:vermiculite:Perlite=10:2:1:1,and the survival rate is as highas 98%.Key words:Lilium Eyeliner;flower organs;plant regeneration百合（Liliumbrowni var.viridulum Baker）是属于百合科百合属的多年生草本植物1，是全世界著名的观赏花卉之一 2 1.为此，国内外科学家不断通过杂交等育种途径培育新品种,其中眼线百合（LiliumbrowniiEyeliner）就是亚百合和铁炮百合杂交后获得的新品种，属于经典的LA百合，其主要特点是花量较大，花头大小适中，花姿向上开放，开花时间较早，又没有浓郁的香味，茎干粗壮且抗病性好，栽培管理方便 3 .因其花白色，花瓣边缘处具有黑色线条，故名眼线百合百合的组织培养追其溯源为2 0 世纪50 年代，Robb4首先利用百合鳞片进行组织培养并且获得了成功，为百合组培奠定了基础.后来国内的杨乃博 5 首先利用麝香百合的鳞茎进行组织培养，黄济明 6 陈为民 7 等在我国积极地开展了百合的组织培养，为后面各位学者的研究打下了坚实的基础 8 .百合的组织培养以鳞片最为普遍，近二、三十年来，利用百合的花器官进行组织培养并获得了成功.如黄天霸、西伯利亚、帝伯等品种最适外植体为花丝，马可波罗、明星等最适外植体为花托 9 .由于眼线百合为近年杂交育种的新品种，只见张伟 3 开展了以眼线百合鳞片为外植体的组织培养方面的研究，而眼线百合的花部各器官的组织培养未见报道，为此，我们开展了眼线百合花器官组织培养方面的初步研究，以期获得再生试管苗，为工厂化生产此品种的百合奠定一定的基础.1材料与方法1.1材料眼线百合花苞，来源于云南昆明鲜花种植基地1.2方法1.2.1材料的选择与灭菌本实验选取生长状况良好、未开放的眼线百合花苞（长度6 8 cm左右）为材料.首先将整朵花苞剪下放置于培养瓶，在水槽中用流水冲洗3 0 min，用7 5%酒精棉球擦试花苞表面，剥去最外轮花被片，置于无菌瓶中，在超净工作台里用7 5%的酒精消毒3 0 s，无菌水漂洗3 次，再用次氯酸钠溶液浸泡10 15min进行消毒，后用无菌水漂洗3 次，留在瓶中备用.1.2.2培养基与培养条件采用MS为基本培养基,其中添加蔗糖3 0 g/L以及琼脂6.5g,pH值调整至5.8 6.2 后添加各种浓度梯度的激素，激素配比采用3 因素3 水平正交设计（L。（3 3）正交设计），见表1所示.培养在植物组培室进行，组培室温度2 51、光照强度2 0 0 0 Lx、光照时间12 h/d.1.2.3初代培养将瓶中已经消毒的花苞放至无菌培养皿中进行解剖，分离出实验所需要的子房、花药和花丝.在培养皿内将子房、花药和花丝剪切为0.5cm左右的小段，接种于不同激素浓度的9 种初代培养基内，每种培养基分别接种花药和花丝各8 个培养皿，子房接种3 个培养皿，每个表1正交设计因素水平NAA6-BA2,4-D10.10.5020.51.00.531.01.51.0培养皿接种3 5个外植体，于组培室培养，观察并做详细记录.愈伤组织诱导率=（诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数）10 0%.1.2.4继代培养将初代培养的培养物切分至0.5cm左右,转接到新配制的培养基上，进行继代培养，培养基与初代培养基相同，每个培养皿接种3 5个外植体，于组培室培养，观察并做详细记录.出芽率=（诱导出芽的外植体数/接种的外植体数）10 0%.基65李莺，植株再生技术研究眼线第4期1.2.5芽的诱导和增殖培养根据初代培养的结果设计四种诱导再分化的培养基，分别是A：NA A 0.1m g/L+6-BA 0.5m g/L,B:NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L,C:NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L,D:NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L.将继代增殖所产生的愈伤组织和芽接种到四种再分化培养基上，每组花丝接种12 个培养基，子房接种6 个培养基，每个培养基接种3 5个外植体.3 0 d后更换培养基,观察出芽的情况和芽的增殖系数进行数据统计.1.2.6壮苗与生根选择生长良好的小苗，将其接种到未添加任何激素的MS.培养基中进行壮苗与生根的培养1.2.7炼苗与移栽将生长良好的试管苗，挑选小鳞茎约为0.2 0.5cm左右的小苗，打开瓶盖，炼苗12 d，移栽到质配比为草炭：沙：蛭石：珍珠岩=10：2：1：1的穴苗盘中，置于温室培养.1.2.8数据分析采用SPSS25.0和正交设计助手统计软件包进行数据分析，2结果与分析2.1初代培养三种外植体接种15d观察，发现花丝末端膨大，并且有少部分花丝产生了少量浅黄绿色的愈伤组织（图1A），而花药和子房只出现了末端膨大；3 0 d进行观察，发现花丝出现较多的愈伤组织并且有少量不定芽产生，也有个别花丝褐化.子房只是膨大并没有愈伤组织的出现（图1B），而花药随着时间而逐渐褐化.3 0 d进行数据统计，统计结果见表2.表2不同激素配比对眼线百合不同外植体的诱导的影响（激素单位mg/L)接种数/段30d出愈率/%30d出芽率/%试验组2,4-D6-BANAA花药花丝子房花药花丝子房花药花丝子房10.50.50.124326027.270018020.51.00.524326010000030.51.51.024326042.86000041.00.50.5243260300010051.01.01.024326027.270013.6061.01.50.124326000000700.51.0243260100000801.00.124326037.5007.14001.50.524326016.670016.60实验结果表明：花丝在8 种培育基中均诱导出愈伤组织，只有6 号尚未诱导出愈伤组织，其中，诱导愈伤组织的适宜培养基为3 号培养基，出愈率为42.8 6%.花丝在1、4、5、8、9 这5种培养基中诱导出不定芽.综上所述,在相同的培养基里不同的外植体对愈伤组织的诱导情况有所不同，花丝相较于花药和子房能在较短的时间内产生愈伤组织2.2继代培养将初代培养的培养物切割并转接至继代培AB图1眼线百合花丝和子房的初代培养A.花丝诱导出愈伤组织；B.子房膨大养基,3 0 d后进行观察，花丝愈伤组织的出愈率基本与初代培养时保持不变，只是花丝在其两端出现了较多的不定芽（图2 C），而花药全部褐化，子房除膨大外，大部分都产生了浅黄绿色的愈伤组织（图2 D），66第2 6 卷西安文理学厂然科学版并且随着时间的变化有少量不定芽产生.说明子房并不是不能产生愈伤组织，只是培养的时间较长.相较于花丝较为迅速的诱导出愈伤组织和芽，子房诱导出愈伤组织和不定芽所需要的时间长，但诱导出的愈伤组织和不定芽数量较花丝多，诱导率较花丝高.3 0 d进行数据统计，统计愈伤组织出愈率见表3.表3不同激素配比对眼线百合花丝和子房诱导愈伤组织的影响（激素单位mg/L)出愈率/%试验组2,4-D6-BANAA花丝子房10.50.50.128.8910.18b50.0025.00ab20.51.00.511.113.85c16.6714.43b30.51.51.042.2210.18a33.3328.87ab41.00.50.533.336.67ab41.6714.43ab51.01.01.031.113.85ab41.6714.43ab61.01.50.18.893.85c33.3338.19ab700.51.013.336.67c58.3314.43ab801.00.140.006.67ab66.6714.43a901.50.515.553.85c41.6728.87ab花丝极差4.4445.1508.887子房极差22.22411.11019.443经过3 0 d的继代培养，花丝和子房在这9种培养基中均可诱导出愈伤组织，只是每组的出愈率不同，花丝诱导愈伤组织的适宜培养基为3号，愈伤组织诱导率为42.2 2%；子房诱导愈伤组织的适宜培养基为8 号，愈伤组织诱导率为66.67%.利用SPSS软件进行分析，花丝在不同激素浓度的处理下具有极显著差异（P0.05）.正交设计助手中直观分析结果表明，花丝CD图2眼线百合的继代培养C.花丝诱导出芽；D.子房诱导出愈伤组织在愈伤组织诱导方面,因素影响能力从高到低为NAA,6-BA,2,4-D；子房在愈伤组织诱导方面，因素影响能力从高到低为2,4-D,NAA,6-BA.总之，花丝相较于子房来说诱导率较低，但相较于子房，花丝的诱导速度较快.不同外植体对愈伤组织诱导能力大小差异明显.诱导能力最差的是花药，其次为花丝，最强为子房.2.3芽的诱导和增殖培养将上一个阶段的培养物切割转接到再分化的培养基中，10 d左右观察到花丝就有芽分化，但是分化的不定芽的数量不是很多.3 0 d左右观察到子房分化出少量不定芽，再分化所需的时间较长.不定芽开始均为幼嫩的黄绿色，随着培养时间的增加，芽生长逐渐旺盛，颜色变为深绿色.3 0 d时进行数据统计，统计结果见表4.表4不同激素配比对眼线百合花丝和子房诱导出芽的影响（激素单位mg/L)出芽率(%)试验号NAA6-BA花丝子房A0.10.532.654.57b23.332.89bB0.11.054.6811.02a50.0010.00aC1.01.037.7810.18ab16.6714.43bD0.51.031.4813.98b30.008.66b结果表明花丝和子房均在B组培养基分化较好，出芽率分别为54.6 8%和50%.利用SPSS软件分析67李莺植株再生技术研究眼绝第4期得出子房的B组与A组、C组和D组差异显著（P=0.0160.05）.出芽诱导培养3 0 d后再更换培养基进行继代培养，2 0 d观察到花丝和子房出芽增多，花丝的出芽诱导率大致保持不变，子房的出芽率明显提高，同时形成丛生芽（图3 F）.2 0 d 对不定芽的增殖进行数据统计，统计结果见表5.表5不同激素配比对眼线百合花丝和子房不定芽增殖的影响起始芽数总出芽数增殖系数试验号花丝子房花丝子房花丝子房A5513104461.893.54B6214152612.454.36C451293392.073.25D5413105521.944.08实验结果表明花丝在B组增殖系数为2.45；子房在B组的增殖系数为4.3 6,均在B组增殖效果好，见图3.综上所述，不同的植物激素对不同外植体出芽的诱导增殖效果不同.在限定时间的情况下花丝的出芽率高于子房，但在不断进行继代培养的情况下，子房的出芽率高于花丝，且增殖系数也大于花丝.2.4壮苗与生根EF图3眼线百合芽的增殖E.接种初始状态;F.接种50 d(30+20)芽的增殖将诱导出的不定芽接种到没有添加任何激素的MS。培养基进行壮苗培养,3 0 d观察小苗长势良好小鳞茎增加了近一倍，同时产生较为纤细的根.50 d后继续观察生根情况，根相较之前更为粗壮，旺盛，生根率高达10 0%见图4.G图4眼线百合壮苗与生根G.培养3 0 d试管苗；H.50d的生根情况；I.培养50 d试管苗2.5炼苗与移栽眼线百合试管苗移栽到基质配比为草炭：沙：蛭石：珍珠岩=10：2：1：1的穴苗盘中，置于温室培养，3 0 d统计成活率高达9 8%，见图5.68第2 6 卷西安文理学院自然科学版）K图5眼线百合移栽J.30d移栽苗；K.60d移栽苗3讨论同一品种不同部位的百合的再生能力有显著差异 1,10 ,在同种培养基的条件下，不同部位的外植体愈伤组织的诱导能力并不相同 10 李莺等【10 对OT品种“黄天霸”百合的花部各器官进行了组织培养的相关研究,研究结果表明花丝的诱导率最高，是最为理想的外植体，柯防等 11 以花托、花瓣和花丝为外植体对东方百合“索邦 进行快速繁殖研究,研究表明花托诱导率最高，关文灵【12】、沙红 13 、农艳丰 14等利用花器官分别对云南大百合、金康卡百合以及东方百合“甜梦”进行了组织培养技术的研究，这三种百合的研究结果均表明子房的诱导率最高.本次眼线百合组织培养的实验表明，眼线百合的子房愈伤诱导较高，但子房产生愈伤所需时间较长，而花丝产生愈伤的时间较短，花药则全部褐化.在百合组织培养的研究中,最为常用的激素为细胞分裂素和生长素.细胞分裂素的主要生理作用是促进诱导芽的分化，而生长素的主要生理作用是促进细胞伸长和细胞分裂.细胞分裂素与生长素的比值和绝对含量，调控植物组织的形态发生和细胞分化 15】在6-BA/NAA的比值大于1时有利于芽的分化，而6-BA/NAA的比值小于1有利于根的分化 16 .由本次研究数据可得,B号培养基，即MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L为诱导芽的最佳培养基，其6-BA/NAA的比值为10,比值大于1,这个结果与苏江等 16 的观点一致.4结论采用眼线百合的花药、花丝和子房为外植体进行组织培养，在整个培养过程中，花药全部褐化，花丝可以较快地产生愈伤组织和不定芽，子房产生愈伤组织和不定芽所需的时间较长，但愈伤组织诱导率、出芽率和增殖系数都较花丝的高.子房诱导愈伤组织和芽的最佳培养基均为MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L,所以，采用子房为外植体，用MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L培养基进行培养是眼线百合获取试管苗的最便捷方法，利于工厂化生产的应用.参考文献1刘丽敏，卢赛清，陈燕霞，等.百合花器官的组织培养 J】.广西农业科学，2 0 0 7,3 8（3）：2 19-2 2 2.2蒋细旺，司怀军.百合的组织培养技术综述 J.湖北农业科学，2 0 0 4,43（1）：7 8-8 2.3张伟，贾桂霞.LA百合品种Eyeliner组培繁殖技术研究 J.江苏农业科学，2 0 10,3 2（6）：3 2-3 4.4ROBB SHEILA M.The Culture of Excised Tissue 3 Lilium speciosum ThunJ.Journal of Experimental Botany,1957,8(3):348-352.5杨乃博.十二种植物的试管无性繁殖 J.植物学报,19 8 1,2 3（4）：2 8 4-2 8 7.6黄济明.组织培养在百合花育种工作中的应用 J.自然杂志，19 8 2,5（2）：158-159.7陈为民，宋为民.卷丹和青岛百合的组织培养及植株分化 J.植物生理学通讯，19 8 2(2）：3 5-3 6.8董志渊，郑思乡.百合的组织培养及在其育种中的应用 J.西部林业科学，2 0 0 4,3 3（2）：6 4-6 8.9李莺，李昀睿，杨琨，等.百合花器官组织培养研究现状 J.陕西农业科学，2 0 16,6 2（3）：6 5-6 9.马云彤责任编辑上接第6 2 页）马云彤责任编辑69李莺再生技术研究不自不第4期10】李莺，李星，李生玲，等.“黄天霸”百合花器官愈伤组织诱导及植株再生J.热带作物学报，2 0 13,3 4（8）：150 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