血清免疫球蛋白IgG提取.ppt

血清免疫球蛋白IgG提取实验目的实验目的掌握掌握盐析法盐析法提取血清免疫球蛋白提取血清免疫球蛋白IgGIgG抗体的原理抗体的原理熟悉血清熟悉血清IgGIgG提取纯化操作过程和方法提取纯化操作过程和方法二、实验原理蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，它在一定蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，它在一定浓度的中性盐溶液中易于沉淀，而其他蛋白质组分在此时浓度的中性盐溶液中易于沉淀，而其他蛋白质组分在此时不易沉淀，通过离心可将两者分离。不易沉淀，通过离心可将两者分离。透析法脱盐:透析透析是将含有小分子杂是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透质的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等）膜（玻璃纸、火绵纸等）制的透析袋里放在透析缓制的透析袋里放在透析缓冲液中进行，可不断更换冲液中进行，可不断更换缓冲液，直至杂质被除去缓冲液，直至杂质被除去四、四、操操作作步步骤骤室温静置室温静置30min,4离心，离心，4000rpm,10min上清液（上清液（球蛋白球蛋白）沉淀为沉淀为球蛋白球蛋白紫外分光光度计测定紫外分光光度计测定蛋白蛋白含量含量沉淀溶于沉淀溶于1mL生理盐水生理盐水移入透析袋，充分透析，移入透析袋，充分透析，沉淀溶于沉淀溶于1mL生理盐水生理盐水,滴加饱和硫酸铵溶液滴加饱和硫酸铵溶液0.5mL弃去上清液（含清蛋白）弃去上清液（含清蛋白）弃去上清液（弃去上清液（、球蛋白球蛋白）沉淀溶于沉淀溶于1mL生理盐水生理盐水,滴加饱和硫酸铵溶液滴加饱和硫酸铵溶液0.5mL室温静置室温静置30min,4离心，离心，4000rpm,10min1mL血清血清1mL生理盐水生理盐水滴加饱和硫酸铵溶液滴加饱和硫酸铵溶液2mL 室温静置室温静置30min,4离心，离心，4000rpm,10min五、结果判断 分别测分别测OD280和和OD260处的光密度值，按照公式计算处的光密度值，按照公式计算蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml）=1.45OD2800.74 OD260 IgG正常参考值正常参考值：8001600gL1.效价可用免疫双扩散试验判断；效价可用免疫双扩散试验判断；2.特异性则可通过双扩、免疫电泳或交叉凝集试验进行考察；特异性则可通过双扩、免疫电泳或交叉凝集试验进行考察；3.浓度也浓度也 可通过免疫浊度法等检测。可通过免疫浊度法等检测。六、注意事项盐的饱和度：盐的饱和度：影响盐析的重要因素，不同蛋白质的盐析 要求盐的饱和度不同pHpH值值：在等电点时，蛋白质溶解度最小越易沉淀析出。蛋白质浓度蛋白质浓度：越大越易沉淀，使用盐的饱和度的极限愈低。过高也易引起其他杂蛋白共沉。温度温度：一般可在室温下进行，某些对热特别敏感的酶，则宜低温。脱盐脱盐：透析时间较长，常在低温下进行，并加入防腐剂避免变性或微生物的污染。饱和硫酸铵溶液的滴加方式：饱和硫酸铵溶液的滴加方式：逐滴，搅拌盐析后放置时间、离心操作的速度、时间盐析后放置时间、离心操作的速度、时间透析袋的使用透析袋的使用 七、方法学评价硫酸铵水中溶解度高，受温度影响小，不易使蛋白质硫酸铵水中溶解度高，受温度影响小，不易使蛋白质变性，操作简单，为盐析中常用的中性盐变性，操作简单，为盐析中常用的中性盐硫酸铵中含有氮，会干扰蛋白质的测定，且溶液的缓硫酸铵中含有氮，会干扰蛋白质的测定，且溶液的缓冲能力差，故多用于大量蛋白的粗提。若要获得纯化冲能力差，故多用于大量蛋白的粗提。若要获得纯化的免疫球蛋白，必须经过凝胶过滤、离子交换层析和的免疫球蛋白，必须经过凝胶过滤、离子交换层析和亲和层析进一步提纯亲和层析进一步提纯八、思考题透析缓冲液与洗涤液有什么不同透析缓冲液与洗涤液有什么不同医学资料仅供参考,用药方面谨遵医嘱