生化实验血清醋酸纤维素膜电泳整理.pptx

生化生化实验血清醋酸血清醋酸纤维素膜素膜电泳整理泳整理电电 泳泳 技技 术术带电粒子在电场中移动的现象称为带电粒子在电场中移动的现象称为带电粒子在电场中移动的现象称为带电粒子在电场中移动的现象称为电泳电泳电泳电泳。电电电电泳泳泳泳技技技技术术术术即即即即是是是是利利利利用用用用样样样样品品品品中中中中各各各各种种种种带带带带电电电电粒粒粒粒子子子子的的的的带带带带电电电电性性性性质质质质、分分分分子子子子大大大大小小小小、形形形形状状状状等等等等的的的的差差差差异异异异，在在在在电电电电场场场场中中中中的的的的迁迁迁迁移移移移速速速速度度度度不不不不同同同同，从从从从而而而而对对对对样样样样品品品品分分分分子子子子进进进进行行行行分分分分离离离离、鉴鉴鉴鉴定定定定、纯纯纯纯化和制备。化和制备。化和制备。化和制备。在在在在生生生生物物物物医医医医学学学学领领领领域域域域，该该该该技技技技术术术术多多多多用用用用于于于于分分分分离离离离，纯纯纯纯化化化化、鉴鉴鉴鉴定蛋白质、核酸等大分子物质。定蛋白质、核酸等大分子物质。定蛋白质、核酸等大分子物质。定蛋白质、核酸等大分子物质。Kaurin Tiselius(1902-1971)因因研研究究电电泳泳和和吸吸附附分分析析，特特别别是是发发现现关关于于血血清清蛋蛋白白的的复复杂杂本本质质而而获获奖奖1948诺诺贝贝尔生理医学奖。尔生理医学奖。1809年年，俄俄国国物物理理学学家家Pece首首次次发发现电泳现象；现电泳现象；1937年年，Kaurin Tiselius 发发 明明 了了Tiselius电电泳泳仪仪，建建立立了了自自由由界界面面电电泳泳，首次证明人血清蛋白的组分；首次证明人血清蛋白的组分；1948年年，Wieland和和Fischer以以滤滤纸纸作作为支持介质的电泳；为支持介质的电泳；1959年年，Raymond和和Weintraub利利用用人人工工合合成成凝凝胶胶作作为为介介质质聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺 凝凝 胶胶 电电 泳泳:生生 物物 大大 分分 子子 的的“Last Check”！（）（）（）（）（+）-表面带负电荷表面带负电荷表面带负电荷表面带负电荷 +带正电荷的水层带正电荷的水层带正电荷的水层带正电荷的水层 （）（）（）（）（+）+表面带正电荷表面带正电荷表面带正电荷表面带正电荷 -带负电荷的水层带负电荷的水层带负电荷的水层带负电荷的水层+电泳的影响因素：电泳的影响因素：1、影响电泳迁移率的外界因素：影响电泳迁移率的外界因素：v电场强度电场强度v溶液的溶液的pH值值v溶液的离子强度溶液的离子强度v电渗现象电渗现象2.影响电泳迁移率的内在因素：影响电泳迁移率的内在因素：v质点所带净电荷的量质点所带净电荷的量v质点的大小和形状质点的大小和形状电泳的分类根据电泳中是否使用支持介质分为：根据电泳中是否使用支持介质分为：自由界面电泳自由界面电泳 区带电泳区带电泳根据电泳系统根据电泳系统pH是否连续分为：是否连续分为：连续连续pH电泳电泳 不连续不连续pH电泳电泳按支持物的装置形式不同按支持物的装置形式不同分为：分为：水平板式电泳水平板式电泳 垂直板式电泳垂直板式电泳 垂直柱式电泳垂直柱式电泳根据电泳物质类别不同分为：根据电泳物质类别不同分为：细胞电泳，核酸电泳，细胞电泳，核酸电泳，蛋白质电泳蛋白质电泳等等按其介质的物理性状不同可分为：按其介质的物理性状不同可分为：凝胶电泳凝胶电泳 粉末电泳粉末电泳 线丝电泳线丝电泳 纤维膜电泳纤维膜电泳等等血清醋酸纤维素薄膜电泳基基 本本 原原 理理本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。清蛋白。血清中含有清蛋白、血清中含有清蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为1-、2-、-及及-球蛋白。球蛋白。试剂试剂试剂试剂 巴比妥缓冲液，染色液，漂洗液巴比妥缓冲液，染色液，漂洗液材料材料材料材料 血清，醋酸纤维素薄膜血清，醋酸纤维素薄膜器材器材器材器材 电泳仪，培养皿，点样器，玻璃板电泳仪，培养皿，点样器，玻璃板 粗滤纸，铅笔，加样枪，镊子等。粗滤纸，铅笔，加样枪，镊子等。试剂和耗材试剂和耗材操作步骤操作步骤1.1.准备准备准备准备 醋酸纤维素薄膜的预处理：醋酸纤维素薄膜的预处理：将将将将薄薄薄薄膜膜膜膜小小小小心心心心放放放放入入入入盛盛盛盛有有有有缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液的的的的培培培培养养养养皿皿皿皿内内内内，使使使使其其其其漂漂漂漂浮浮浮浮在在在在液液液液面面面面；用用用用镊镊镊镊子子子子轻轻轻轻压压压压，使使使使其其其其全全全全部部部部浸浸浸浸入入入入缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液内内内内。待待待待膜膜膜膜完完完完全全全全浸浸浸浸透透透透（约约约约半半半半小小小小时时时时）后后后后取取取取出出出出，夹夹夹夹在在在在清清清清洁洁洁洁的的的的滤滤滤滤纸纸纸纸中中中中间间间间，轻轻轻轻轻轻轻轻吸吸吸吸去去去去多多多多余余余余的的的的缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液，同同同同时时时时分分分分辨辨辨辨出出出出光光光光滑滑滑滑面面面面和和和和粗糙面。粗糙面。粗糙面。粗糙面。标标记记：在在在在粗粗粗粗糙糙糙糙面面面面上上上上用用用用铅铅铅铅笔笔笔笔距距距距薄薄薄薄膜膜膜膜条条条条一一一一端端端端1.5cm1.5cm处处处处划划划划线即为点样线并作好标记。线即为点样线并作好标记。线即为点样线并作好标记。线即为点样线并作好标记。2.2.点样（关键）点样（关键）点样（关键）点样（关键）在在薄薄膜膜的的粗粗糙糙面面点点样样。点点样样时时，先先用用吸吸管管将将3微微升升血血清清均均匀匀地地涂涂在在点点样样器器表表面面，再再用用点点样样器器“印印”在在薄薄膜膜的的点点样样区区内内，样样品品呈呈线线状状，宽宽约约12mm。注意：注意：点样时动作要点样时动作要点样时动作要点样时动作要轻轻、稳稳，用力不能太大，以免损坏，用力不能太大，以免损坏，用力不能太大，以免损坏，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 。另外操作过程要防止指纹污染。另外操作过程要防止指纹污染。另外操作过程要防止指纹污染。另外操作过程要防止指纹污染。3.电泳电泳 将将将将点点点点样样样样后后后后的的的的薄薄薄薄膜膜膜膜使使使使粗粗粗粗糙糙糙糙面面面面（点点点点样样样样面面面面）向向向向下下下下，点点点点样样样样端端端端置置置置于于于于负负负负极极极极，贴贴贴贴在在在在电电电电泳泳泳泳槽槽槽槽支支支支架架架架的的的的“滤滤滤滤纸纸纸纸桥桥桥桥”上上上上，平平平平衡衡衡衡5min5min。打打打打开开开开电电电电源源源源，调调调调节节节节电电电电压压压压和和和和电电电电流流流流强强强强度度度度。调调调调节节节节电电电电压压压压至至至至90-90-100V100V左左左左右右右右，电电电电流流流流强强强强度度度度为为为为0.40.40.6mA/cm0.6mA/cm薄薄薄薄膜膜膜膜条条条条宽宽宽宽，电泳时间电泳时间电泳时间电泳时间40min-1h40min-1h左右。左右。左右。左右。1.滤纸桥滤纸桥 2.电泳槽电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架电泳槽膜支架 5.电极室中央隔板电极室中央隔板 点样端点样端4.染色染色 电电泳泳完完毕毕立立即即取取出出薄薄膜膜，直直接接浸浸入入染染色色液液中中，染色染色5min。5.漂洗漂洗 用用用用漂漂漂漂洗洗洗洗液液液液漂漂漂漂洗洗洗洗，不不不不停停停停摆摆摆摆动动动动薄薄薄薄膜膜膜膜条条条条，每每每每3-5min3-5min左左左左右右右右换换换换一一一一次次次次液液液液，连连连连续续续续更更更更换换换换三三三三次次次次，可可可可使使使使背背背背景景景景颜颜颜颜色色色色脱脱脱脱去去去去。将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。操操操操作作作作中中中中，注注注注意意意意控控控控制制制制染染染染色色色色和和和和漂漂漂漂洗洗洗洗的的的的时时时时间间间间，防防防防止止止止背景过深或某些区带太浅。背景过深或某些区带太浅。背景过深或某些区带太浅。背景过深或某些区带太浅。分清薄膜的点样面分清薄膜的点样面注意点样样品的宽度和力度注意点样样品的宽度和力度注意薄膜放置的方向注意薄膜放置的方向控制染色及漂洗时间控制染色及漂洗时间保持良好的实验秩序保持良好的实验秩序6、注、注 意意 事事 项项预期结果预期结果 一一一一般般般般的的的的染染染染色色色色后后后后的的的的薄薄薄薄膜膜膜膜上上上上可可可可显显显显现现现现清清清清楚楚楚楚的的的的五五五五条条条条区区区区带带带带。从从从从正正正正极极极极端端端端起起起起，依依依依次次次次为为为为清清清清蛋蛋蛋蛋白白白白、1111球球球球蛋蛋蛋蛋白、白、白、白、2222球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白和球蛋白和球蛋白和球蛋白和球蛋白。球蛋白。球蛋白。球蛋白。清蛋白清蛋白 1 2 1 1、洗脱法：、洗脱法：、洗脱法：、洗脱法：剪下各蛋白区带剪下各蛋白区带0.02mol/L NaOH0.02mol/L NaOH洗脱洗脱将洗脱液用分光光度计比色将洗脱液用分光光度计比色结果计算结果计算每种蛋白质占总蛋每种蛋白质占总蛋白质量的相对含量白质量的相对含量=该种蛋白管光密度读数该种蛋白管光密度读数各管光密度读数之和各管光密度读数之和100%各蛋白组分的定量各蛋白组分的定量 2、光密度计扫描法、光密度计扫描法清蛋白清蛋白 1 2 清蛋白清蛋白 1 2 血清中各蛋白组分的含量蛋白质类型蛋白质类型平均值平均值标准差标准差正常范围正常范围（M2SD）白蛋白白蛋白64.593.7557.45%-71.73%1-球蛋白球蛋白3.120.681.76%-4.48%2-球蛋白球蛋白6.161.064.04%-8.28%-球蛋白球蛋白9.091.156.79%-11.39%-球蛋白球蛋白17.412.7811.85%-22.9%A/G1.800.281.24-2.36临床意义急急慢慢性性肾肾炎炎、肾肾病病综综合合征征、肾肾功功能能衰衰竭竭：白白蛋蛋白白降降低低，1、2 和和球蛋白升高；球蛋白升高；慢性活动性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，慢性活动性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，、球蛋白升高；球蛋白升高；急性炎症：急性炎症：1、2球蛋白升高；球蛋白升高；慢性炎症：白蛋白降低、慢性炎症：白蛋白降低、2、球蛋白升高；球蛋白升高；红斑狼疮、类风湿关节炎：白蛋白降低，红斑狼疮、类风湿关节炎：白蛋白降低，球蛋白显著升高；球蛋白显著升高；多多发发性性骨骨髓髓瘤瘤：白白蛋蛋白白降降低低，球球蛋蛋白白升升高高，和和球球蛋蛋白白区区带带之之间间出现出现“M”带。带。小 结1 1、本次课重要概念、原理。、本次课重要概念、原理。、本次课重要概念、原理。、本次课重要概念、原理。2 2、结合基本原理和实验结果，综合分析实验、结合基本原理和实验结果，综合分析实验、结合基本原理和实验结果，综合分析实验、结合基本原理和实验结果，综合分析实验操作中存在的问题。操作中存在的问题。操作中存在的问题。操作中存在的问题。3 3、醋酸纤维素薄膜电泳实验操作的细节及影、醋酸纤维素薄膜电泳实验操作的细节及影、醋酸纤维素薄膜电泳实验操作的细节及影、醋酸纤维素薄膜电泳实验操作的细节及影响实验结果的关键因素。响实验结果的关键因素。响实验结果的关键因素。响实验结果的关键因素。4 4、电泳结果与临床意义。、电泳结果与临床意义。、电泳结果与临床意义。、电泳结果与临床意义。思考题 利利用用本本次次实实验验课课所所学学知知识识，分分析析以以下下表表格格中中个个各各蛋蛋白白质质的的混混合合物物在在醋醋酸酸纤纤维维薄薄膜膜电电泳泳实实验验中中的的电电泳泳结结果果？绘绘图表示并说明原因图表示并说明原因。蛋白质蛋白质等电点等电点分子量分子量（KDa）A4.534.000B6.260.000C8.028.000（注：使用（注：使用pH7的电泳缓冲液，点样端置于负极）的电泳缓冲液，点样端置于负极）谢谢观赏！2020/11/522