柑橘溃疡病生物防治技术研究进展_张程杰.pdf

绿色防控2023 年第 3 期收稿日期:2022 11 27作者简介:张程杰(1980 )，男，硕士，中级工程师，研究方向:合成生物学、生物工程和技术。E mail:705519061 qq com。柑橘溃疡病生物防治技术研究进展张程杰1，2(1 田边三菱制药研发(北京)有限公司上海分公司，上海200030;2 上海国广生物科技有限公司，上海201801)摘要:柑橘是我国重要经济作物，且广泛种植于世界其他国家，为各种植地区带来不小的经济效益。然而柑橘经常会遭受到病虫害等侵袭，柑橘溃疡病便是其中较频发的一种。该病对植株造成枯枝落枝、树势衰弱等严重伤害，并使果实产生病疤，品质降低，更甚者会导致果实脱落，产量下降，影响种植户的经济收入，且使得整体柑橘产业发展迟滞。当前已有化学、生物、物理等多种类防治方法，有效抑制了柑橘溃疡病的扩散，但该病尚无法得到根本性的控制。本文总结了几类常用的柑橘溃疡病生物防治技术，并对柑橘溃疡病生物防治技术未来趋势进行展望，以期能为柑橘溃疡病的防治做出贡献。关键词:柑橘;柑橘溃疡病;生物防治柑橘(Citrus reticulata Blanco)是芸香科(uta-ceae)、柑橘属草本植物，为热带、亚热带水果。柑橘是全世界最大批量的水果作物，在我国已具有 4000余年的栽培历史。随着国内水果产业的发展，柑橘种植面积逐年增加。当柑橘产业规模扩大的同时，柑橘病虫害也给其发展带来了不可忽视的负面影响，甚至限制了柑橘产业的进一步扩大。而柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker)是一个严重影响柑橘生产的病理因素，它广泛传播于全球各柑橘种植区域，给柑橘产业带来了不可估量的损失1。此病的病原菌主要有 3 种，分别是柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp citri)、棕色黄单胞莱檬亚种(X citri subsp aurantifolii)和苜蓿黄单胞枳柚亚种(X alfalfa subsp citrumelonis)，这三种病菌分布地区各不相同，在中国致使柑橘溃疡病发生的罪魁祸首主要是柑橘黄单胞杆菌2。该病一般会直接造成柑橘苗木染病部位的枝叶、果实表面产生火山状病斑，感染较为严重时，会出现叶片脱落、枝桠枯萎、果实非自然掉落，并使果实减产，质量受损。而此病菌如果在柑橘产地范围性扩散，将会直接或间接的使该区域的所有柑橘产业遭受巨大的负面冲击，果农将承受不可估量的损失3。为防止柑橘溃疡病所造成的柑橘产业停滞甚至下滑等严重后果，对该病的防治刻不容缓。而目前暂没有能够完全抑制柑橘黄单胞杆菌彻底根除柑橘溃疡病的技术。化学方法是当前最为普及的一种防治手段，通常是对柑橘施以包括铜制剂、农用抗生素、噻唑类和微生物制剂等防治药剂。此方法虽卓有成效，但其对环境如土壤、水体的破坏和污染等负面影响已不容忽视1。因此，一种新的、破坏更小、效果优良的柑橘溃疡病技术生物防治技术应运而生。柑橘溃疡病的生物防治是使用生物代谢产物或基因异源表达等，提高植株抗病性，限制溃疡病菌的生存空间，达到抑制病原菌或防止菌株侵染目的的一种环境友好型技术。随着研究的深入，已有越来越多的生物手段用于柑橘溃疡病的防治，本文对近年来的一些柑橘溃疡病侵染机理与生物防治方式进行综述，以期能为柑橘溃疡病的进一步防治研究提供参考，为推进高效、科学治理柑橘溃疡病，促进柑橘行业的发展做出贡献。1柑橘溃疡病的发生与传播柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞菌亚种引起的一种检疫传染病。柑橘品种及其亲缘品种对柑橘溃疡病的易感性各有不同，但大多数商业化种植的柑橘品种是中至高度易感宿主。柑橘溃疡病菌主要以感病植株的枝叶以及主干为再侵染源，病菌寄生于植株的病斑中，并且能够在其中蛰伏几年。待到气候回暖、空气湿润的春天时节，病菌在寄主体内迅速繁衍，致使表皮组织肿胀破裂，菌脓从裂口渗出，病菌凭借风雨、昆虫以及枝叶间的来回摩擦等方式传播到健康柑橘植株上，而发病植株会在木栓化后死亡4。病菌会利用自身的鞭毛通过气孔或受伤部位感染植物体，因此有枝桠断裂、表皮受损的柑橘植株更容易遭到病菌的侵染，此外，亚洲潜叶蛾(Phyl-locnistis citrella)的啃食会导致植株感染风险直线上升。而由于病菌的潜伏性，染病植株难以在第一时间被发现或被检查出来，待到来年气候等条件适宜时，病菌又开始增殖、传播，如此循环往复，柑橘溃疡病一直得不到控制，从而使得更多苗木受害，造成难062023 年第 3 期绿色防控以估量的损失2。2生物防治方法2 1植物源杀菌剂植物源杀菌剂是一种或多种来自植物体内的次生代谢产物，或通过在植物生产过程中自然形成的物质，用作种植行业的杀虫、消毒以及除草制剂，具有生物活性高、目标性强以及对非靶标生物安全等优点，且毒性低、可分解、不易形成耐药性1。廖石榴等5 曾采用苋菜乙酸乙酯提取物对柑橘溃疡病菌进行了处理，检测处理后的柑橘溃疡病菌活性以及几种关键酶的抗菌能力。研究发现，苋菜乙酸乙酯提取物使柑橘溃疡病菌的菌体皱缩，发生了严重形态变化，从而打破了菌体的正常保护功能，并造成细胞质内蛋白质等物质发生外泄的现象，进而使病原菌发育和生殖遭到巨大破坏。根据该实验结果可知晓，苋菜乙酸乙酯提取物对柑橘溃疡病菌有良好的抑制和致死功效，可以进一步尝试对感病或健康柑橘植株施加该物质，研究其在农田等自然环境下对柑橘溃疡病的实际治疗或者预防能力，并研究该物质是否会导致负面效果的产生以及具体产生何种负面效果，进而研发出新型的植物来源抗菌、除菌农用药剂。此外，在自然界中的复杂生态环境中，植物多种多样，这其中能够对溃疡病菌产生抑制或消灭功能的植物及其产生的代谢物同样种类庞杂，未来或可以在这些未经探索的植物上研究它们产生的物质对柑橘溃疡病的治疗或抑制功效。2 2基因工程随着基因工程的发展与深入研究，以及一些柑橘溃疡病抗病基因的发现，为柑橘溃疡病生物防治创造了新的方式。该技术可通过控制植物自身基因的表达(一般为抗病基因的过表达)来提高对病菌的抵抗能力，也可以通过异源表达对柑橘溃疡病菌具有抗性的基因，从而使植株产生抗病功能。李强等6 从甜橙中克隆了 1 个 NBS L 基因 CsNBS L，NBS L 蛋白在病原体识别和防御反应信号转导中有着至关重要的功效，该基因在晚锦橙中过表达，以验证其功能。经检测发现，该基因受溃疡病菌诱导而表达水平上调且在柑橘高感品种群体中水平下调，转基因晚锦橙机体内与水杨酸合成有密切关联的基因转录水平显著上升，表明 CsNBS L 的过量表达能够有效通过调节柑橘中水杨酸信号通路来提升柑橘机体自身对溃疡病的抵抗能力。因此，CsNBS L 能够被考虑用作柑橘分子育种基因的候选基因之一，来研究其对溃疡病的防治效能。不过，或许是因为柑橘溃疡病滋生、发展过于复杂，亦或者是由于 CsNBS L 不是防治溃疡病的主要基因，此项实验没能成功培育出对柑橘溃疡病产生免疫功能的柑橘植株。Omar 等4 通过原生质体转化技术，利用绿色荧光蛋白(GFP)和水稻抗黄单胞菌基因 Xa21 的 cDNA 构建的 pAO3 基因，对水稻的原生质体进行了转化，构建了含有水稻抗黄单胞菌基因 Xa21 的 W 默科特 宽皮柑橘植株，转基因植株接种柑橘溃疡病病原菌后与非转基因对照植株相照，病斑数量和病斑内细菌数量都有减少，表明这些转基因品系的抗病性均有提升。并且，该转基因植株已经实地场地种植，以评估其园艺性状和抗病性。柑橘中响应柑橘溃疡病菌侵染的原生基因和及其构建的防御体系不止 NBS L，而来源于其他植物或微生物中的抗病基因更是繁多，这些已被发现或未发现的柑橘抗病基因的具体种类和作用机制等待我们的探索，并进一步研究增强它们应对柑橘溃疡病菌的能力。2 3微生物防治植物体内存在着大量的微生物资源，它们长期生活在植物中，能与宿主和谐共处，而不会引起宿主植物产生明显的病理反应，它们还可以通过生理代谢形成与宿主产物相同或相似的物质。相较于暴露于阳光直射等糟糕的环境条件下的细菌，植物内生菌有着充足的生命活动所需的各类物质，且受到植物组织的保护，其生存条件更加的优渥、稳定，因而能有效地抑制病原菌的入侵或能提高宿主的抗病能力，具有独特的生物防治效能。目前已发现的能够阻抑柑橘溃疡病菌侵染的微生物有枯草芽孢杆菌、草生欧文氏菌、荧光假单胞菌等7。颜桢灵等8 利用柑橘抗病品种的正常植株进行组织培养实验，得到了一定数量内生真菌，采用带毒平板涂布法测定内生菌乙酸乙酯提取物是否具有阻抑柑橘溃疡病菌感染的功效，经实验得知大部分的菌株都能够阻抑病菌的生长繁殖，由此可知柑橘抗病植株的内生菌不光是种类繁多，它们的代谢产物也大都能够遏止柑橘溃疡病菌的繁殖甚至使其死亡。不过，由于实验中柑橘品种、采集时间地点、及操作方法等多方面的因素影响，该实验分离的菌株数量明显小于前人报道的从柑橘中分离的内生菌数量，也没有考虑内生菌的组成情况及其抗菌能力与植株自身抗病能力之间的关系，后续可从这些方面继续将研究深入，探索更多的成果。柑橘抗病品种是很好的抗柑橘溃疡病内生菌的16绿色防控2023 年第 3 期来源，但植物的种类多种多样，且微生物可生存于世界的各个角落，如土壤、水体、动植物甚至空气，它们的种类也各异，比如自然界广泛存在的芽孢杆菌、假单孢菌，以及一些生防放线菌、生防真菌，甚至是噬菌体都可能对杆菌溃疡病菌产生拮抗作用，如表 1所示，这为后续的研究方向提供了更多的选择。表 1对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的微生物序号微生物种类名称来源1芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 B subtilis LE24柑橘叶2假单胞菌铜绿假单胞菌 P aeruginosa SWUC02感染柑橘溃疡病的柠檬植株3放线菌海洋放线菌 Streptomyces sp A3202鳞笠藤壶4真菌间座壳属菌株 Diaporthe WZMG Y 12柑橘健康植株5噬菌体丝状噬菌体 F1日本柑橘园土壤2 4壳聚糖壳聚糖(chitosan，CTS)，化学名称为聚葡萄糖胺(1 4)2 氨基 B D 葡萄糖，可从蚕蛹、蛋壳以及海生生物的贝壳中提取，是甲壳素脱乙酰化后的产物，是自然界中仅有的聚阳离子多糖，在医疗保健、环保、食品、饲料等众多领域有广泛的应用9。壳聚糖对细菌、真菌和病毒表现出良好的抑制作用，且对哺乳动物低毒，生物相容性好、易于降解，因而被广泛研究作为抗微生物制剂。岑铭松10 等用平板菌落计数法评价不同粘度壳聚糖对柑橘溃疡病菌的杀菌效果，得出 3 种粘度壳聚糖对柑橘溃疡病的杀菌能力大小依次为:粘度12 粘度100 粘度20，且粘度12 的壳聚糖处理05 h 就可完全将柑橘溃疡病菌杀灭。根据此实验可知，壳聚糖在防治柑橘溃疡病领域具有一定的潜力。壳聚糖的抑菌效果受其本身性质，如分子量、晶体外观和脱乙酰的程度大小等因素的影响，而且壳聚糖的分子量大小直接影响壳聚糖的理化性质和生理活性。此外，时间、浓度等因素的变化也同样会对实验的最终结果造成影响。上述实验考虑的影响因素不够全面，后续可将多方面的因素加入到实验中，以求得到更准确、有效壳聚糖抑菌浓度和条件，为柑橘溃疡病提供新的防治技术。3总结与展望柑橘溃疡病日趋严重，一旦爆发柑橘溃疡病，会致使柑橘产业发展进程缓慢，果农收入减少，甚至对柑橘及其附加产业的经济效益带来巨大损失。目前的化学防治手段虽行之有效，但农药残留、耐药性增强等负面影响也较为显著，而生物防治技术没有这方面的劣势，因此，研究并选用生物手段来进行柑橘溃疡病的防治是大势所趋。上文总结的 4 类生物防治技术中，虽已探明对柑橘溃疡病菌有防治作用，但还有待继续研究改进，例如微生物防治中，各类微生物的次生代谢产物尚不明确，对柑橘溃疡病菌起抑制或灭杀作用的活性成分还未分离纯化，因此，这些菌类的具体作用机制也不能确定。此外我国对微生物防治研究范围不广，层次不深，大部分微生物防治技术只停留于实验阶段，距离实地测试或应用还有一段距离。同样的，壳聚糖的抑菌机制并没有统一定论，也未进行农田实地抗病实验，其真实抗病能力有待进一步探究。现阶段，柑橘溃疡病的生物防治技术虽然还不成熟，但可以沿着已有的思路继续摸索，并在此基础上推陈出新，为更好的防治柑橘溃疡病菌，促进柑橘溃疡病生防技术的开发应用及柑橘产业的可持续发展，笔者总结出以下几点，以供参考:柑橘溃疡病潜伏期长，有时很难判定植株是否染病，因此可针对溃疡病菌研发便捷快速的检测技术，如此可在溃疡病爆发前将其扼杀于摇篮之中。针对植物源杀菌剂与微生物防治技术，因其来源广泛，获取较为容易，但现阶段研究层面不深，其作用机制需要有深入的研究，以期早日研发出适用的抗菌剂。各类技术各有其优劣，如若单个技术达不到抗菌要求，可考虑多种技术综合使用，如转基因植株预防病菌侵染，各类生物抗菌剂灭杀病菌。由于生物防治技术大都止于实验室，可考虑加强田间实验，广泛测试自然中的诸多因素对实验结果的影响，以求更精确合理的实验结果。针对溃疡病菌的传播因素和途径，或可切断其传染源，诸如杂草、昆虫此类。参考文献:1 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