葡萄风信子愈伤组织再生体系的构建.pdf

44(2):20-26.2024,自然科学）引文格式：曹晓云，田淑婷，时春堂.葡萄风信子愈伤组织再生体系的构建 J.西南林业大学学报Mar.2024JOURNAL OF SOUTHWEST FORESTRY UNIVERSITY2024年3 月Vol.44No.2南西第2 期第44卷业林报大学学DOI:10.11929/j.swfu.202303040葡萄风信子愈伤组织再生体系的构建曹晓云田淑婷时春莹谢靖雯黎敏婕杜灵娟（西北农林科技大学风景园林艺术学院，陕西杨凌7 12 10 0）摘要：以葡萄风信子常见种亚美尼亚的花蕾和叶片作为外植体，开展不同因素对葡萄风信子愈伤组织诱导和植株再生影响的研究。结果表明：亚美尼亚的花蕾和叶片愈伤组织诱导和增殖的最佳培养基配方为：MS+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/L6-BA，其愈伤组织诱导率为10 0%，且继代3 5 d后不同培养基上的花源和叶源愈伤组织的鲜质量无显著差异；液体培养和光照培养有利于愈伤组织细胞增殖，1g亚美尼亚花源和叶源愈伤组织经液体培养4个继代周期后，平均鲜质量最高可达（10.3 6 1.13）g 和（10.5 5 2.2 9）g，表明不同培养基配方对亚美尼亚花蕾和叶片愈伤组织细胞增殖无显著影响，且液体培养和光照培养均有利于愈伤组织的增殖；胚性和非胚性2 种愈伤组织分别通过体细胞胚发生和器官发生2 种途径可再生形成完整植株，再生率均为10 0%。关键词：葡萄风信子；愈伤组织；液体培养；器官发生；体细胞胚发生中图分类号：S682文献标志码：A文章编号：2 0 95-1914(2 0 2 4)0 2-0 0 2 0-0 7Construction of CallusRegeneration System in Grape HyacinthCao Xiaoyun,Tian Shuting,Shi Chunying,Xie Jingwen,Li Minjie,Du Lingjuan(College of Landscape Architecture and Art,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)Abstract:The callus induction and plant regeneration of grape hyacinth was carried out,utilizing the flowerbuds and leaves of Muscari armeniacum as explants.The results show that the best medium for callus inductionand proliferation was MS+1.0 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA,and the callus induction rate was 100%.After 35days of subculture,there was no significant difference on callus proliferation in different medium formulations.Meanwhile,liquid culture and light culture were beneficial to the proliferation of calli.After 4 cycles of the sub-culture of 1 g M.armeniacum flower and leaf-derived callus,the maximum average fresh weight was 10.36 1.13g and 10.55 2.29 g.The results showed that different media formulations had no significant effect on flower andleaf-derived callus proliferation in M.armeniacum,and both liquid culture and light culture were beneficial to cal-lus proliferation.Furthermore,embryogenic and non-embryogenic callus could be regenerated to plants by somat-ic embryogenesis and organogenesis,respectively.The regeneration rates were all 100%.Key words:grape hyacinth;callus;liquid culture;organogenesis;somatic embryogenesis收稿日期：2 0 2 3-0 3-15；修回日期：2 0 2 3-0 5-10基金项目：国家自然科学基金项目（3 2 17 18 6 3，3 17 0 0 6 2 5）资助第1作者：曹晓云（1994一），女，博士研究生。研究方向：园林植物分子育种。Email:。通信作者：杜灵娟（198 0 一），女，博士，副教授，博士生导师。研究方向：园林植物分子育种。Email:。21曹晓云等：葡萄风信子愈伤组织再生体系的构建第2 期葡萄风信子（Muscarispp.）为百合科（Lili-aceae）蓝壶花属（Muscari）多年生球根花卉，其花莲顶端簇生，多呈现正蓝色!，是研究单子叶蓝色花形成机理的重要材料。近年来，随着分子生物技术的飞速发展，关于葡萄风信子花青苷合成的研究取得了一定进展 2-5 ，其中尤为突出的是高效组织培养及再生体系的建立。自Peck等 6 在2 0 世纪8 0 年代首次报道葡萄风信子可获得再生植株后，相关研究在多个品种的葡萄风信子中展开 7-13，但对于具有较高观赏价值的葡萄风信子亚美尼亚不同组织（花蕾和叶片）进行愈伤组织诱导研究尚未见报道。为了长期保持葡萄风信子亚美尼亚不同来源愈伤组织状态并实现快速增殖，创制快速稳定的遗传转化材料，本研究以葡萄风信子蓝紫色种亚美尼亚花蕾和叶片为材料，筛选最适诱导愈伤组织的培养基配方和适合愈伤组织快速增殖的培养方式及光照条件，并通过体细胞胚发生和器官发生2 种方式进行植株再生，以期为葡萄风信子遗传转化体系的建立提供参考。1材料与方法1.1试验材料以自然生长于西北农林科技大学林学院苗圃中的葡萄风信子亚美尼亚的花蕾和叶片为试验材料，于2 0 2 0 年4月盛花期采取花蕾和叶片清洗待用。1.2试验方法1.2.1愈伤组织的诱导诱导培养基配方参考张海芹等 13 的方法，并加以改进（表1）。选取生长良好的葡萄风信子亚美尼亚的花蕾和叶片，流水冲洗2 4h，用75%乙醇溶液消毒3 0 s，10%次氯酸钠溶液消毒10 min，无菌水清洗5 次后，用于愈伤组织的诱导。愈伤诱导率=（愈伤组织形成数/接种数）10 0%(1)表1本试验中使用的培养基Table1The formula medium in this study类型编号2,4-D/(mg:L-l)6-BA/(mg:L-)基础培养基固体培养基10.10.14.43g/LMS+30g/L蔗糖+3 g/L植物凝胶（pH-5.86.0）0.51.0IV0.50.1V0.5VI1.0VI1.00.1VII0.5X1.0液体培养基X1.00.14.43g/LMS+30g/L蔗糖（pH=5.86.0）1.2.2愈伤组织的增殖不同培养基配方培养：分别取1g初代培养产生的愈伤组织，接种于I、I、I V、V、VI、V I、V I、X 固体培养基（表1）上，并置于24黑暗条件下培养，每隔14d更换1次培养基，3 5 d后统计愈伤组织的鲜质量变化及保持情况，设置3 次生物学重复。不同培养方式培养：分别取1g初代培养产生的愈伤组织，接种于VI固体或X号液体培养基（表1）中。2 4暗培养（震荡），每隔14d更换1次培养基，并称质量记录4个继代周期内愈伤组织鲜质量变化及保持情况。同时，于显微镜下记录液体培养前后的细胞群数量变化，设置3 次重复。不同光照条件培养：分别取1g初代培养产生的愈伤组织，接种于VI固体培养基（表1）上，置于2 4，3 0 0 0 1x（12 h 光照/12 h黑暗）光照培养，每隔14d更换1次培养基，并称质量记录4个继代周期内愈伤组织的鲜质量变化及保持情况，设置3 次重复。1.2.3体细胞胚胎发生将淡黄色紧实的胚性愈伤组织（EC）接种于不含植物生长调节剂的固体培养基（表1）中，22西南林业大学学报第44卷24，3 0 0 0 1x 光照培养，同时置于体视显微镜下拍照，记录体胚的形成及生长过程1.2.4器官发生将白色松散的非胚性愈伤组织（NEC）接种于不含植物生长调节剂的固体培养基（表1）中，24，3 0 0 0 1x 光照培养，同时置于体视显微镜下拍照，记录不定芽及不定根的形成及生长过程。1.2.5移栽成苗待试管苗长出小鳞茎，并生根至3 cm左右时，即可对其进行移栽。移栽时先用清水将附着的培养基去除，随后移人装有基质的直径为7 cm的方形育苗盆中，随后用保鲜膜覆盖，置于2 4，相对湿度7 0%，3 0 0 0 lux光照条件下培养，2 周后移人温室培养1.2.6数据处理与分析使用SPSS23软件对试验结果进行单因素（A NO V A）方差分析，以Duncans方差分析法进行差异显著性分析，显著性水平为0.0 5 14；使用Origin2019b软件进行图表绘制2结果与分析2.1不同外植体类型对愈伤组织的诱导图1记录了葡萄风信子亚美尼亚叶片和花蕾愈伤诱导及再生的过程。取盛花期的葡萄风信子叶片及花蕾（图la），经消毒接种于愈伤诱导培养基上（图1bc），约15 d左右，愈伤组织首先于切口处诱导产生（图1de），后逐渐向内扩散，直至愈伤组织全部形成（图1fg）；随后将其接种于基础培养基（表1）上诱导根和芽的分化，完成小鳞茎的再生（图1hi）。最后，移栽至花盆中（图1j）。CCmcmcm9cmcmcmcm2cma.外植体的获取；bc.外植体的接种；de.愈伤组织形成；fg.胚性和非胚性愈伤组织产生；h.体胚萌发；i.不定芽、不定根伸长或小鳞茎形成；j.移栽成苗。图1亚美尼亚愈伤组织诱导、增殖及再生过程Fig.1Callus induction,proliferation,and regeneration in M.armeniacum以亚美尼亚叶片和花蕾为材料，研究不同培养基对葡萄风信子愈伤组织诱导的影响。结果表明，不同培养基配方对亚美尼亚花蕾和叶片愈伤组织的诱导有较大的影响，见图2。其中，在6-BA浓度为0.1mg/L时，随着2,4-D浓度的增高，花蕾愈伤组织诱导率也增加，在2,4-D为0.5mg/L和1.0 mg/L（IV号、VI号培养基）时达到最大值（10 0%）。6-BA浓度从0.1mg/L提高到1.0 mg/L时，诱导率整体出现下降趋势，当6-BA浓度提高到0.5 mg/L和1.0 mg/L时，诱导率显著降低（V号、VI号、VI号、X号培养基），说明高浓度6-BA可能会抑制亚美尼亚花蕾愈伤组织的形成；在2,4-D为0.5 mg/L和1.0 mg/L时，6-BA为0.1mg/L（V号培养基）、0.5 mg/L（VI号培养基）、1.0 mg/L（X 号培养基）时，亚美尼亚叶片愈伤组织的诱导率均为10 0%，说明6-BA浓度对亚美尼亚叶片愈伤组织的诱导率影响较小。因此，为了方便操作，在后续试验中，使用VI号培养基（MS+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/L6-BA）作为花蕾及叶片的愈伤诱导培养基。23曹晓云等：葡萄风信子愈伤组织再生体系的构建第2 期120花蕾100四叶片aaaaa%游b80dd60d40200VVVIVIVIIIX培养基编号不同小写字母表示差异显著（P0.05）。图2不同培养基配方下亚美尼亚愈伤组织的诱导率Fig.2 Callus induction rate under different mediaformulations of M.armeniacum2.2培养基配方对愈伤组织增殖的影响以亚美尼亚花源和叶源愈伤组织为材料，研究不同培养基配方对葡萄风信子愈伤组织保持和增殖的影响，结果见图3。各培养基上培养3 5 d的亚美尼亚花源和叶源愈伤组织鲜质量无显著差异，因此后续试验仍采用VI号培养基。使用VI号培养基，经3 5 d继代的1g亚美尼亚叶源和花源愈伤组织平均鲜质量分别为（2.2 6 0.5 8）g和(2.360.31)go2.3液体培养对愈伤组织增殖的影响由图4可知，液体培养基（X号）中培养的亚美尼亚花源和叶源（图4ab）愈伤组织鲜质量显著高于固体培养基（VI号）中培养的花源和叶源愈伤组织鲜质量。经液体培养基培养的1g亚美尼亚花源和叶源愈伤组织4次继代后，平均鲜质量分别为（10.5 5 2.2 9）g和（10.3 6 1.13）g，是固体培养基培养愈伤组织鲜质量的3.3倍和3.6 倍，而且液体培养基中培养的愈伤组织颗粒较大且均匀，有大量的细胞群产生（图4cf)。然而液体培养的愈伤组织保持情况较差，一般3 个月后部分愈伤组织会出现轻微的分化现象，愈伤组织难以长期保持。4.5花源4.0四叶源3.5aaa3.0aaaaaaaa2.5aaaa2.01.51.00.50IIVVVI VIVII培养基编号不同小写字母表示差异显著（P0.05）。图3不同培养基亚美尼亚愈伤组织继代3 5 d后的鲜质量变化Fig.3 Changes of fresh weight of M.armeniacum callusafter subculture for 35 d under different media formulations1214液体培养基a液体培养基12固体培养基10四固体培养基1088664a4b22dddddddd00014284256014284256培养时间/h培养时间/hab200um200m200um200umc.花源培养前d.花源培养后e.叶源培养前f.叶源培养后不同小写字母表示差异显著（P0.05）。图4不同培养方式对4个继代周期后亚美尼亚愈伤组织增殖的影响Fig.4Effects of different culture methods on the proliferation of M.armeniacum callus after 4 cycles of subculture24西南林业大学学报第44卷2.4光照对愈伤组织保持和增殖的影响黑暗和光照条件下4次继代的亚美尼亚花源（图5 a）和叶源（图5 b）愈伤组织鲜质量表现出一定的差异，光照条件下培养的亚美尼亚花源和叶源愈伤组织平均鲜质量为（4.3 8 0.95）g和（4.3 2 土0.6 3）g，略高于黑暗条件下培养的亚美尼亚花源和叶源愈伤组织平均鲜质量（3.17 土0.40）g 和（2.5 90.3 3）g)，且光照条件下培养的亚美尼亚花源和叶源愈伤组织颜色鲜亮，保持良好，3 个月内未出现分化现象。66光照a光照5黑暗5黑暗a4b4ba33aCb22Cde00014284256014284256培养时间/d培养时间/dab不同小写字母表示差异显著（P0.05）。图5不同光照条件对4个继代周期后亚美尼亚愈伤组织增殖的影响Fig.5Effects of different light conditions on the proliferation of M.armeniacum callus after 4 cycles of subculture2.5体细胞胚胎及器官的发育情况2.5.1体细胞胚胎的发育经1 2 次培养后，可观察到体细胞胚从愈伤组织表面产生，其发育过程经历了球形胚、梨形胚、棒状胚和子叶胚4个时期（图6），能直接诱导根和芽的分化，最后完成小鳞茎的再生（图1），这一过程大概需要4个月，再生率为10 0%，表明胚性愈伤组织可以通过体胚发生途径再生形成完整植株。1000um1.000um1.000um1000um1000uma.胚性愈伤组织b.球形胚时期c.梨形胚时期d.棒状胚时期e.子叶期图6 体视显微镜下亚美尼亚体细胞胚发育的不同阶段Fig.6Different stages of somatic embryo development in M.armeniacum under stereomicroscope2.5.2器官的发育经1 2 次培养后，可观察到不定芽由非胚性愈伤组织进一步发育分化，并突出愈伤组织表面（图7 ad）。在不含植物生长调节剂的固体培养基上可直接诱导不定根的分化（图7 e）。根和芽分别由不同的组织分化产生，而后在发育过程中逐渐连接成一个整体并完成小鳞茎的再生（图1）。通过这一途径再生植株仅需2 个月左右，再生率为10 0%，表明非胚性愈伤组织可以通过器官发生途径再生形成完整植株。1.000um1.000um1000um1000um1000uma.非胚性愈伤组织b.器官原基形成c.不定芽出现d.不定芽伸长e.不定根出现图7体视显微镜下亚美尼亚不定芽、不定根发育的不同阶段Fig.7Different stages of adventitious buds and roots development in M.armeniacum under stereomicroscope25曹晓云等：葡萄风信子愈伤组织再生体系的构建第2 期3结论与讨论前人多以鳞茎或者叶片为外植体，建立葡萄风信子外植株再生体系 7-13，这些研究多以葡萄风信子单个组织进行研究。本研究与前人不同的是，以观赏价值较高的葡萄风信子蓝紫色种亚美尼亚的花蕾和叶片为外植体，建立了高效的植株再生体系。此外，外源2,4-D和6-BA已被证明影响愈伤组织的形成以及根和芽的分化 15-19。Wang等 12 报道2,4-D和6-BA组合使用会促进杏叶梨（Pyrusarmeniacaefolia）愈伤组织的诱导，其中，MS+2.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA为杏叶梨愈伤诱导和继代培养的最适培养基配方。不同品种和取材部位对愈伤组织的诱导率具有显著差异，Dai等 2 0 对欧洲葡萄（Vitis vinifera）愈伤组织诱导条件进行优化时发现，“霞多丽花蕾的愈伤组织诱导率最高。本研究比较了亚美尼亚不同组织（花蕾和叶片）在不同激素浓度培养基上的分化表现，随着2,4-D浓度的增高，亚美尼亚花蕾和叶片愈伤组织诱导率增加，高浓度6-BA对亚美尼亚叶片愈伤组织的形成影响较小，但可能会抑制花蕾愈伤组织的形成，说明亚美尼亚花蕾和叶片的脱分化和再分化能力不同，试验证实MS+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/L6-BA为亚美尼亚花蕾和叶片愈伤组织诱导的最佳培养基配方。本研究发现，叶基部新生部分和开放初期的花蕾愈伤组织生长最快，说明幼嫩细胞的生理状态有利于亚美尼亚愈伤组织的发生。也有其他研究表明，外植体的发育阶段对愈伤组织的诱导具有重要影响 2 1-2 3。因此，在后续试验中，应尽量选用生长健壮的幼嫩组织进行培养，以提高愈伤组织诱导率。外源生长调节剂的配比、培养方式以及光照条件对愈伤组织的增殖和保持起决定性作用Du等 2 4 发现百合（Liliumtigrinum）花器官胚性愈伤组织在添加6 0 mg/L蔗糖和1.2 mg/LPIC的MS培养基上生长速度最快。而在本研究中，不同培养基配方对愈伤组织的增殖影响较小，当2,4-D浓度为0.5mg/L和1mg/L时，愈伤组织均能保持愈伤状态而不分化，但其增长速度均较慢。葡萄风信子经诱导产生的愈伤组织结构疏松，因此非常适合于液体培养体系的建立。经短暂的液体培养后，其生长速度得到了显著提高，且悬浮系分散性好、颗粒均一，生长状态良好此外，在液体培养的愈伤组织中还观察到了大量胚性细胞团的产生。Nhut等 2 5 发现，铁炮百合（L i l i u ml o n g i f l o r u m）愈伤组织经液体培养45d后获得的体细胞胚数量是固体培养的6 倍。权永辉等 2 6 在百合愈伤组织培养时发现，在固体和液体培养相结合时，愈伤组织的增殖速度最快。而在本研究中，经3个月以上液体继代培养的葡萄风信子愈伤组织保持情况较差。因此，可采用固体和液体相结合的方式进行培养，以获得较高的增殖速度，并长期维持愈伤组织的不分化状态此外，光照对愈伤组织的生长具有一定的影响，不同植物对光照的响应存在较大的差异。本研究中，光照下继代培养的愈伤组织生长速度较快，且经光照培养的愈伤组织颜色鲜亮，其他研究也支持这一观点 2 7-2 8 。在继代培养中还观察到，经长期继代培养的愈伤组织状态发生了一定的变化，尽管如此，经周期性的继代培养，愈伤组织的状态仍可保持1年以上。将多次继代产生的胚性和非胚性愈伤组织分别接种于不含植物生长调节剂的MS培养基上，即可分别通过体胚发生和器官发生2 种途径诱导植株的再生，再生率为10 0%，这与张雯等 的研究结果相一致。因此，本研究以葡萄风信子常见种亚美尼亚的花蕾和叶片作为外植体诱导获得了胚性和非胚性愈伤组织，并建立了高效的植株再生体系，为葡萄风信子的组培快繁在植物生长调节剂组合、外植体类型以及培养方式的选择等方面提供了参考参考文献1Lou Q,Liu Y L,Qi Y Y,et al.Transcriptome sequen-cing and metabolite analysis reveals the role of delphin-idin metabolism in flower colour in grape hyacinth J.Journal of Experimental Botany,2014,65(12):3157-3164.2Chen K L,Du L J,Liu H L,et al.A novel R2R3-MYBfrom grape hyacinth,MaMybA,which is different fromMaAN2,confers intense and magenta anthocyanin pig-mentation in tobacco J.BMC Plant Biology,2019,19(1):390-405.3Liu H L,Lou Q,Ma J R,et al.Cloning and functionalcharacterization of dihydroflavonol 4-reductase geneinvolved in anthocyanidin biosynthesis of grape hy-acinth J.International Journal of Molecular Sciences,2019,20(19):4743.4Liu H L,Su B B,Zhang H,et al.Identification and（责任编辑刘永梅）26西南林业大学学报第44卷functional analysis of a flavonol synthase gene fromgrape hyacinth J.Molecules(Basel,Switzerland),2019,24(8):1579.5Zhang H,Gong J X,Chen K L,et al.A novel R3 MYBtranscriptional repressor,MaMYBx,finely regulatesanthocyanin biosynthesis in grape hyacinth J.PlantScience,2020,298:110588.6Peck D E,Cumming B G.Beneficial effects of activ-ated charcoal on bulblet production in tissue cultures ofMuscari armeniacum J.Plant Cell,Tissue and OrganCulture,1986,6(1):9-14.7Uranbey S,Ipek A,Caliskan M,et al.In vitro bulbletinduction from bulb scales of endangered ornamentalPlant Muscari azureum J.Biotechnology&Biotech-nological Equipment,2010,24(2):1843-1848.8Suzuki S,Supaibulwatana K,Mi M,et al.Productionof transgenic plants of the Liliaceous ornamental plantAgapanthuspraecoxssp.orientalis(Leighton)Leighton via Agrobacterium-mediated transformationof embryogenic calli J.Plant Science,2001,161(1):89-97.9何旭东.葡萄风信子植株再生体系研究 D.南京：南京林业大学，2 0 0 7.10Azad M A K,Amin M N.Effects of hormonal and bas-al nutrient medium on in vitro 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