乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的检测.ppt

乙型肝炎病毒核苷（酸）类似物耐药的检测p一、耐药的有关定义p二、各种耐药检测技术的评价p三、需要重视的几个问题一、耐药的有关定义一、耐药的有关定义 p病毒学突破（病毒学突破（）p病毒反跳（病毒反跳（）p生化学突破（生化学突破（）p基因型耐药（基因型耐药（）p表型耐药（表型耐药（）p临床耐药（临床耐药（）耐药的有关定义耐药的有关定义p 病毒学突破（）p指在核苷类药物治疗过程中，患者的血清 水平一度被抑制，但在继续治疗中血清 水平与最低值相比上升或超过个（倍）。耐药的有关定义耐药的有关定义p 病毒反跳（病毒反跳（）p指核苷类药物治疗过程中患者的血清指核苷类药物治疗过程中患者的血清 水平一度被抑制，但在继续治疗中血清水平一度被抑制，但在继续治疗中血清 升高至升高至或高于治疗前水平。或高于治疗前水平。耐药的有关定义耐药的有关定义 生化学突破（生化学突破（）指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（）水平一度复常，但在继续治疗转移酶（）水平一度复常，但在继续治疗中血清水平又再次升高。肝脏生活指标很中血清水平又再次升高。肝脏生活指标很多，但是在此仅指。多，但是在此仅指。耐药的有关定义耐药的有关定义p 基因型耐药（）p指基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对的抑制作用下降或消失。这种基因变异与的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断有无耐药性。耐药的有关定义耐药的有关定义 表型耐药（表型耐药（）通过体外细胞培养方法，直接测定对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表通过体外细胞培养方法，直接测定对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐药。型耐药。通常以来评估通常以来评估 倍倍:敏感敏感 在倍在倍:部分耐药部分耐药 倍倍:耐药耐药耐药的有关定义耐药的有关定义p 临床耐药（）p指临床出现病毒复制不能被抑制，或复制一度被抑制后又出现 反跳，同时伴有升高，或肝炎复发的其他临床证据。二、各种耐药检测技术及评价二、各种耐药检测技术及评价p病毒学反跳或突破的监测病毒学反跳或突破的监测p基因型耐药监测基因型耐药监测p表型耐药检测表型耐药检测p临床耐药监测临床耐药监测病毒学反跳或突破的监测病毒学反跳或突破的监测基于对血清基于对血清 载量的动态监测载量的动态监测需重视以下三点：需重视以下三点：.载量检测手段的敏感性载量检测手段的敏感性 .检测技术的可靠性和稳定性检测技术的可靠性和稳定性 .监测的间隔时间监测的间隔时间基因型耐药监测基因型耐药监测时机时机非必须非必须不主张常规、广泛应用不主张常规、广泛应用基因型耐药相关变异的命名基因型耐药相关变异的命名基因型耐药相关变异基因型耐药相关变异在多聚酶序列中的位置在多聚酶序列中的位置基因型耐药的主要技术基因型耐药的主要技术p碱基序列分析法碱基序列分析法p 直接测序直接测序p 克隆测序克隆测序p聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术()()p反向杂交分析技术（反向杂交分析技术（）p基因芯片技术基因芯片技术 p实时荧光定量技术实时荧光定量技术p 探针定点突变技术探针定点突变技术p 引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术p 熔解曲线法熔解曲线法 p基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱()()直接测序法直接测序法末端末端终终止法止法化学裂解法化学裂解法测测序自序自动动化化使用特异性引物与使用特异性引物与单单链链模板退火，在聚合模板退火，在聚合酶酶作用下作用下进进行延伸反行延伸反应应，用，用终终止，用区分止，用区分长长度度仅仅相差个核苷酸相差个核苷酸的，从而完成的，从而完成测测序的序的方法。方法。用化学用化学试剂试剂在、在、处处特定的裂解片段，特定的裂解片段，产产生一簇各种生一簇各种长长度度的短的短链链，经过经过放射放射自自显显影可直影可直读顺读顺序。序。类类似末端似末端终终止法，所不同的止法，所不同的是用是用荧荧光染料光染料标记标记，计计算机算机自自动读动读出。出。优优点点简简便、迅速、便、迅速、应应用广用广泛。泛。不需不需酶酶促反促反应应，可，可以以对对寡核苷酸寡核苷酸测测序。序。简便、快速、准确可靠。简便、快速、准确可靠。安全、无放射性污染。安全、无放射性污染。模板用量大大减少。模板用量大大减少。测序能力增强。测序能力增强。变异直接测序结果图谱变异直接测序结果图谱直接测序的局限性直接测序的局限性p.设备贵、技术高、耗材、费时。设备贵、技术高、耗材、费时。p.必须有充足目的基因片段。必须有充足目的基因片段。p.突变株比例小于时，由于竞争抑制作用不能被扩增。直突变株比例小于时，由于竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法检测接测序法检测 变异变异克隆测序法克隆测序法克隆测序法克隆测序法p优点：优点：p .有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株p 之间的相对比。之间的相对比。p .提高了检测的灵敏度。提高了检测的灵敏度。p局限性：局限性：p .技术难度较高。技术难度较高。p .检测周期更长。检测周期更长。p .检测的费用大大增加。检测的费用大大增加。碱基变异可能导致：碱基变异可能导致：原有位点消失原有位点消失 产生新的位点产生新的位点 识别位点移位识别位点移位 利用错配引物使利用错配引物使 产物中产生产物中产生 特异的酶切位点特异的酶切位点结果结果:酶切片段长、短变化和多、少变化酶切片段长、短变化和多、少变化聚合酶链式反应及限制性片段长度聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术多态性技术()()限制性内切核酸酶的作用限制性内切核酸酶的作用它们能识别的特异序列，并在识别序列内或其旁切它们能识别的特异序列，并在识别序列内或其旁切割双链。如：割双链。如：限制酶的识别序列和切割位点：限制酶的识别序列和切割位点：限制酶的识别序列和切割位点：限制酶的识别序列和切割位点：检测检测 变异变异PCR错配引物设计错配引物设计检测检测 变异变异检测检测 变异变异技术的评价技术的评价p优点：优点：p 简单、广泛易开展。简单、广泛易开展。p缺点：缺点：p .限制性内切酶种类有限。限制性内切酶种类有限。p .错配引物将导致退火温度降低、非特异条带增多。错配引物将导致退火温度降低、非特异条带增多。p .引物非完全匹配，可能导致扩增效率降低、检测引物非完全匹配，可能导致扩增效率降低、检测p 敏感的下降。敏感的下降。反向杂交分析技术（反向杂交分析技术（）诊断诊断 变异变异芯片技术芯片技术BiologicalSampleAnalyze dataScannermicroarray“”arrayerp p p p 芯片技术诊断芯片技术诊断 变异变异 。;:.芯片技术芯片技术 优点优点 局限性局限性 大通量大通量 技术和设备的要求高技术和设备的要求高 快速快速 检测成本高检测成本高 灵敏度高灵敏度高 可平行检测可平行检测 实时荧光定量在基因变异中的应用实时荧光定量在基因变异中的应用p探针定点突变技术探针探针定点突变技术探针p引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术p高分辨熔解曲线法高分辨熔解曲线法探针定点突变技术探针定点突变技术探针技术检测变异探针技术检测变异 ：探针定点突变技术探针定点突变技术p 优点 不足 p p 灵敏度高 需要相对较贵的荧光仪p 特异性好 需要多条荧光探针，成本高p 费时短 影响因素多，存在一定误判引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术检测变异检测变异熔解曲线法检测变异熔解曲线法检测变异特异性探针，其值不同特异性探针，其值不同溶解曲线分析溶解曲线分析基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱()()原理原理 检测检测 变异的原理变异的原理酶切分子量酶切分子量基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱()优点：优点：高灵敏度、准确度、分辨率高灵敏度、准确度、分辨率 能发现相对比例小于的变异株。能发现相对比例小于的变异株。局限性：局限性：设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。耐药不同检测技术的比较 。.()：().,.,.,.表型耐药检测表型耐药检测p有两种途径：有两种途径：p.细胞外聚合酶活性分析。细胞外聚合酶活性分析。p.细胞药物敏感性实验。细胞药物敏感性实验。细胞外聚合酶活性分析细胞外聚合酶活性分析p目前常用的研究聚合酶活性模型是将基因组插入目前常用的研究聚合酶活性模型是将基因组插入杆状病毒载体，继而转染昆虫细胞而表达颗粒，杆状病毒载体，继而转染昆虫细胞而表达颗粒，应用亲和层析法纯化颗粒后，在细胞外评价药物应用亲和层析法纯化颗粒后，在细胞外评价药物对聚合酶活性的影响。对聚合酶活性的影响。细胞外聚合酶活性分析细胞外聚合酶活性分析细胞药物敏感性实验细胞药物敏感性实验p该方法类似于细菌药物敏感试验。目前多采用病该方法类似于细菌药物敏感试验。目前多采用病毒载体将含有被检测的含变异位点的全基因组导毒载体将含有被检测的含变异位点的全基因组导入肝细胞源性细胞株，然后将各种浓度的核苷类入肝细胞源性细胞株，然后将各种浓度的核苷类药物加入培养液，经过一定时间培养后检测细胞药物加入培养液，经过一定时间培养后检测细胞上清中的上清中的 含量。含量。细胞药物敏感性实验细胞药物敏感性实验细胞药物敏感性实验细胞药物敏感性实验p该技术在操作上非常繁琐，目前仅限于研究之需，该技术在操作上非常繁琐，目前仅限于研究之需，主要用于药物开发研究，尚不能用于常规临床分主要用于药物开发研究，尚不能用于常规临床分析。析。临床耐药监测临床耐药监测变异前后病毒载量和的变化变异前后病毒载量和的变化 变异与病毒学突破变异与病毒学突破判断临床耐药时的建议判断临床耐药时的建议p.结合核苷类药物的应用史、起始病毒载量、是结合核苷类药物的应用史、起始病毒载量、是否合并其他肝病等。否合并其他肝病等。p.注意甄别依从性不良。注意甄别依从性不良。p.结合基因变异位点。结合基因变异位点。三、需要重视的几个问题三、需要重视的几个问题p慎重对待天然耐药的结论。慎重对待天然耐药的结论。p不要过分依基因型耐药检测技术。不要过分依基因型耐药检测技术。p正确对待基因分型技术。正确对待基因分型技术。自然变异的几组数据自然变异的几组数据p 等采用等采用 法检测例未经抗病毒的成年慢性乙肝携法检测例未经抗病毒的成年慢性乙肝携带者，结果有例检测到变异株。带者，结果有例检测到变异株。p 等采用引物末端碱基定点突变扩增技术对例拉米等采用引物末端碱基定点突变扩增技术对例拉米夫定治疗前的患者血清进行了变异毒株检测，发夫定治疗前的患者血清进行了变异毒株检测，发现有例（）存在自然变异毒株。现有例（）存在自然变异毒株。p日本等检测例无症状携带者日本等检测例无症状携带者,发现例变异发现例变异,占。占。本实验室关于自然变异本实验室关于自然变异的组数据的组数据例患者中，检出存例患者中，检出存在变异毒株者共例，在变异毒株者共例，检出率为。其中阳检出率为。其中阳性例，阳性例，和性例，阳性例，和同时阳性者例。同时阳性者例。例患者中，检出存例患者中，检出存在突变毒株者共例，在突变毒株者共例，检出率为。其中阳检出率为。其中阳性例，阳性例，和性例，阳性例，和同时阳性者例。同时阳性者例。不要过分依基因型耐药检测技术不要过分依基因型耐药检测技术 p基因型耐药变异并非必须。基因型耐药变异并非必须。p目前我国尚无批准的商品化试剂盒或被普遍认可目前我国尚无批准的商品化试剂盒或被普遍认可的检测技术。的检测技术。正确对待基因型正确对待基因型与核苷类似物疗效之间的关系与核苷类似物疗效之间的关系 p基因型是一种人为的分类方式。基因型是一种人为的分类方式。p的基因型与各种核苷类药物的疗效之间的关系还的基因型与各种核苷类药物的疗效之间的关系还没有确定的结论。没有确定的结论。p区基因的变异对区基因的影响。区基因的变异对区基因的影响。结语结语p加深认识加深认识p适时监测适时监测p及时发现及时发现p正确管理正确管理