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荧光定量PCR简介目录目录目录4 4荧光定量PCR原理1 12 23 3定量PCR的实验流程几种定量方法的比较 StepOne Plus与ViiA7比较及应用 QPCR定量的常见问题5 5什么是PCR1.1 1.1 什么是什么是PCRPCR？1 1、荧光定量、荧光定量PCRPCR原理原理理想的理想的PCR以以2n次方扩增，即：次方扩增，即：DNAn=DNA02nQPCR定义 Real time Q-PCR 通过对 PCR 扩增反应中每一次循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。1.2 QPCR1.2 QPCR定义定义1.3 1.3 数学原理数学原理Real time Q-PCR动力学曲线可以分成四个阶段：基线阶段,指数增长期、线性增长期和平台期。基线阈值CT值 DNA0定量定量PCRPCR的几个重要的参数：的几个重要的参数：基线就是扩增曲线的水平部分。什么是阈值什么是阈值？基线（空白）信号的产生是由于背景引起的。默认阈值=基线（背景）信号标准偏差x10什么是什么是CTCT值值？荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，一般荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数被称为 CT 值（Threshold Value）。PCRPCR扩增的数学模型扩增的数学模型扩增产物遵循理论方程：DNAn=DNA0(1+E)nDNAn=扩增产物，DNA0=起始浓度，E=扩增效率，n=循环数CtCt值与起始浓度的关系值与起始浓度的关系标准曲线标准曲线利用已知拷贝数的标准品，按利用已知拷贝数的标准品，按10倍浓度稀释倍浓度稀释5个成梯度，做出标准曲线，其个成梯度，做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样值。因此，只要获得未知样品的品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。斜率斜率Ct=-klg DNA0+b 斜率=-1/lg(1+e)E=1,斜率=-3.32 扩增效率范围：90%-110%斜率范围：-3.1和-3.59之间1.4 1.4 化学原理化学原理常用荧光标记方法：荧光染料法-SYBR Green I特定位点探针法-TaqMan化学原理染料法SYBR Green I 是一种结合于DNA双链小沟的染料。游离时不发光，与DNA结合时发光。每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去。所以荧光信号强度与DNA分子总数目成正比。1.4.1 染料法化学原理染料法化学原理化学原理探针法1.4.2 探针法化学原理探针法化学原理 TaqMan探针是一种寡核苷酸探针。每产生一条DNA链，就切断一条探针，然后产生一个单位信号，信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。淬灭基团淬灭基团报报告告基基团团化学原理探针法1.4.2 探针法化学原理探针法化学原理探针法与染料法的优缺点 1.4.3探针法和染料法的比较探针法和染料法的比较几种定量方法的比较2 2、几种定量方法的比较、几种定量方法的比较定量方法定量方法优点点缺点缺点电泳成本低。样品消耗大、操作繁琐、污染环境、受人为影响。Agilent 2100准确度高，人为影响小，能检测片段大小。成本高，通量小，无特异性。荧光定量PCR准确度最高，特异性好。成本高，人为操作影响大，不能检测片段大小。几种定量方法的比较Real time Q-PCR在HiSeq2000测序上的优势1、原理优势：更适合HiSeq2000的桥式PCR。2、可依据优势：用以上机的样品作为标准品，上机目标更明确。3、通量优势：目前Caliper Gx 一次完成可完成96个样品，ViiA7一次最多完成180个样品4、稳定性优势：从cs的clusters分析，QPCR更稳定。定量PCR的实验流程3 3、定量、定量PCRPCR的实验流程的实验流程实验操作：1.稀释标准品2.稀释样品3.配制反应预混液4.加样5.设置反应程序6.运行实验7.分析数据两种仪器图片4 4、StepOne PlusStepOne Plus及及ViiA7ViiA7与荧光定量应用与荧光定量应用StepOnePlus SystemLife Tech-ViiA7VS两种仪器比较4.1 StepOne Plus4.1 StepOne Plus及及ViiA7ViiA7对比对比荧光定量的应用4.2 4.2 荧光定量的应用荧光定量的应用1、DNA或RNA的定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测等。2、基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等），特定基因在不同时期的表达差异以及cDNA芯片的确认。3、其它。例如SNP检测，性别鉴定等。曲线成弯曲的原因 5 5、QPCRQPCR定量的常见问题定量的常见问题5.1 扩增曲线弯曲扩增曲线弯曲原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。解决方案：对于能检测出Ct的样品，读出数据；浓度太高的样品，需稀释后另做实验。曲线成直线的原因5.2 直线扩增曲线直线扩增曲线部分探针降解后，部分reporter从探针上脱落，导致：基线抬高；扩增与荧光信号的增加不一致。结束课程结束20142014年年0303月月