微生物代谢综合项目工程答案整理.doc

1. 微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段。定义：通过某些特定生化反映修饰来定向改进细胞特性功能，运用重组DNA技术来创造新化合物。研究内容：生物合成有关代谢调控和代谢网络理论；代谢流定量分析；代谢网络重新设计；中心代谢作用机理及有关代谢分析；基因操作。研究手段：代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域最新成果。因而，在研究办法和技术方面重要有下列三大惯用手段：(1)检测技术：常规化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程研究，如物料平衡、同位素标记示踪法、酶促反映动力学分析法、光谱学法、生物传感器技术。(2)分析技术：采用化学计量学、分子反映动力学和化学工程学研究办法并结计算机技术，阐明细胞代谢网络动态特性与控制机理，如稳态法、扰动法、组合法和代谢网络优化等。(3) 基因操作技术：在代谢工程中，代谢网络操作实质上可以归结为基因水平上操作：涉及几乎所有分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇克隆、表达、调控，DNA 杂交检测与序列分析，外源DNA转化，基因体内同源重组与敲除，整合型重组DNA 在细胞内稳定维持等。2. 2.代谢改造思路和代谢设计原理。代谢改造思路：依照微生物不同代谢特性，常采用变化代谢流、扩展代谢途径和构建新代谢途径三种办法。(1)变化代谢途径办法：加速限速反映，增长限速酶表达量，来提高产物产率。变化分支代谢途径流向，提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其他分支代谢途径竞争中占据优势，从而提高目代谢产物产量。(2)扩展代谢途径办法：在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌可以运用自身酶或酶系消耗本来不消耗底物。(3)转移或构建新代谢途径：通过转移代谢途径、构建新代谢途径等办法来实现。代谢设计原理：现存代谢途径中变化增长目产物代谢流：增长限速酶编码基因拷贝数；强化核心基因表达系统；提高目的途径激活因子合成速率；灭活目的途径抑制因子编码基因；阻断与目的途径相竟争代谢途径；变化分支代谢途径流向；构建代谢旁路；变化能量代谢途径；在现存途径中变化物流性质：运用酶对前体库分子构造宽容性；通过修饰酶分子以拓展底物辨认范畴；在现存途径基本上扩展代谢途径：在宿主菌中克隆、表达特定外源基因可以延伸代谢途径，从而生产新代谢产物、提高产率。3. 微生物基因操作技术有哪些？（举两例阐明） 微生物基因操作技术有：核酸凝胶电泳、核酸分子杂交技术、DNA序列分析、基因定点诱变、细菌转化、运用DNA与蛋白质互相作用进行核酸研究、PCR技术等。基因定点突变(site-directed mutagenesis)：通过变化基因特定位点核苷酸序列来变化所编码氨基酸序列，用于研究氨基酸残基对蛋白质构造、催化活性以及结合配体能力影响，也可用于改造DNA调控元件特性序列、修饰表达载体、引入新酶切位点等。重要采用两种PCR办法，涉及重叠延伸技术和大引物诱变法。在硫化细菌核苷水解酶对底物专一性研究中，采用定点突变技术，对编码221位和228位氨基酸DNA序列进行突变，变化两个位点氨基酸，从而研究氨基酸残基对底物结合影响。基因敲除(gene knock-out)：又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间同源重组，进行精准定点修饰和基因改造，具备专一性强、染色体DNA可与目片段共同稳定遗传等特点，可分为完全基因敲除和条件型基因敲除。在谷氨酸棒杆菌生产缬氨酸研究中，采用基因敲除办法进行高产菌株构建。如ilvA基因敲除，使苏氨酸脱氨酶合成减少，减少异亮氨酸合成前体，从而减少异亮氨酸合成，增长缬氨酸生成。4. 什么是酶反馈抑制，以缬氨酸代谢途径来举例阐明。酶反馈抑制：指最后产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径终点产物对该途径酶活性调节，所引起抑制作用，涉及顺序反馈抑制、同工酶反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制、增效反馈抑制。以缬氨酸为例：缬氨酸由丙酮酸合成，涉及四个反映，分别由四个酶催化，依次为乙酰羟酸合酶(AHAS)、乙酰羟酸同分异构酶(AHAIR)、二羟酸脱水酶(DHAD)和支链氨基酸转氨酶(TA)。一方面，由AHAS将两分子丙酮酸缩合成2-乙酰乳酸；另一方面，AHAIR将2-乙酰乳酸转化为双羟基异戊酸；再次，由DHAD将双羟基异戊酸脱水形成2-酮异戊酸；最后，TA将2-酮异戊酸转化为L-缬氨酸。L-缬氨酸和L-异亮氨酸合成共享AHAS 、AHAIR、DHAD和TA等4种酶。如AHAS以丙酮酸为底物则合成L-缬氨酸，而用丙酮酸和2-酮丁酸为底物则合成L-异亮氨酸。缬氨酸合成反馈抑制重要对象是其合成途径上第一种核心酶乙酰羟酸合酶（AHAS），同步缬氨酸和异亮氨酸合成酶系受三个末端产物缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸多价阻遏。因而，如果解除AHAS反馈抑制和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物酶系阻遏，必将大大提高缬氨酸积累。为此可选育缬氨酸构造类似物抗性突变株来解除缬氨酸反馈调节。如抗缬氨酸突变株获得，或者运用分子手段对核心酶基因进行定点突变。5. 微生物酶自动调节方式（举两例阐明）。微生物并不是在所有空间、时间内合成它所能合成所有酶，在一定生理条件下只合成它当时所需要酶，且酶活力受到控制。微生物重要在转录水平、翻译水平、蛋白质水平、不同空间分布和细胞水平上进行酶调节，此外对信号传导响应也起到调节作用。（1）以转录水平上营养阻遏机制为例来阐明酶调节： 转录水平上调节是通过调节酶量进行。在细胞培养过程中，当培养基中具有能被细胞迅速运用碳源（如葡萄糖）时，其在降解过程中某代谢产物阻遏了别的降解酶系合成，这种现象被称为“降解物阻遏”。 环腺苷酸受体蛋白（CRP）能与环腺苷酸（cAMP）结合形成cAMP-CRP复合物。当cAMP-CRP结合于DNA时，能增进RNA聚合酶与启动子结合，从而增进转录。葡萄糖分解代谢物能抑制腺苷酸环化酶活性并活化磷酸二酯酶，从而减少cAMP浓度，不能形成cAMP-CRP复合物，减少了各种酶蛋白基因转录，起到调节有关代谢酶作用。（2）以蛋白质水平上酶共价修饰为例来阐明酶调节：酶共价修饰时调节酶活性重要方式，通过其她酶对多肽链上某些基团进行可逆共价修饰，使处在活性与非活性互变状态，从而调节酶活性，如磷酸化、腺苷酰化、甲基化等。磷酸化酶激酶催化反映既可以是通过磷酸化作用使无活性磷酸化酶b转化为有活性磷酸化酶a ，也可以是通过磷酸化酶磷酸酶水解作用使磷酸化酶a脱去磷酸而转化为无活性磷酸化酶b。6. 微生物基因水平调控方略，请举例阐明 基因调控是生物体内控制基因表达机制。基因表达重要过程是基因转录和信使核糖核酸(mRNA)翻译。基因调控重要发生在三个水平上,即DNA水平上调控、转录控制和翻译控制；微生物通过基因调控可以变化代谢方式以适应环境变化，此类基因调控普通是短暂和可逆；多细胞生物基因调控是细胞分化、形态发生和个体发育基本,此类调控普通是长期,并且往往是不可逆。基因调控研究有广泛生物学意义，是发生遗传学和分子遗传学重要研究领域。原核生物基因调控重要发生在转录水平上。依照调控机制不同可分为负转录调控和正转录调控。真核生物基因调控比原核生物复杂得多。(1)负控诱导系统：大肠杆菌lac i基因与乳糖操纵子（lactose operon）作用是典型负控诱导系统。在这个系统中，i基因是调节基因，当它产物阻遏蛋白与操纵区（lac O）结合时，RNA聚合酶便不能转录构造基因，因而，在环境中缺少诱导物（乳糖或IPTG）时，乳糖操纵子是受阻。而当环境中有乳糖时，进入细胞乳糖在细胞内尚存在很少量-半乳糖苷酶作用下而发生分子重排，由乳糖变成异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白紧密结合，使后者构型发生变化而不能辨认lac O，也不能与之结合，因而RNA聚合酶能顺利转录构造基因，形成大分子多顺反子mRNA，继而在翻手水平上合成三种不同蛋白质：-半乳糖苷酶、透性酶以及乙酰基转移酶。（2）负控阻遏系统：大肠杆菌色氨酸操纵子（tryptophan operon）具有5个构造基因，编码色氨酸生物合成途径中 5种酶。这些基因从一种启动子起始转录出一条多顺反子mRNA，与lac操纵子同样，这个启动子受毗邻操纵区顺序控制。转录是通过操纵区和阻遏蛋白控制，它效应物分子是色氨酸，也就是由tr操纵子基因所编码生物合成途径中末端产物。当色氨酸很丰富时，它结合到游离阻遏物上诱发变构转换，从而使阻遏物紧紧结合在操纵区。另一方面，当色氨酸供应局限性时，阻遏物失去了所结合色氨酸，从操纵区上解离下来，tr操纵子转录就此开始。色氨酸起着tr操纵子辅阻遏物功能。（3）染色质丢失：在发育过程中某些体细胞失去了某些基因，这些基因便永不表达，这是一种极端形式不可逆基因调控。在某些线虫、原生动物、甲壳动物发育过程中体细胞有遗传物质丢失现象。在这些生物中，只有生殖细胞才保存着该种生物基因组全套基因。例如在马副蛔虫(Ascaris megacephala)卵裂初期就发既有染色体丢失现象。蜜蜂工蜂和蜂后是二倍体，而单倍体则发育成为雄蜂。这也可以以为是一种通过染色体丢失基因调控。7. 如何采用代谢工程进行缬氨酸育种？答案一缬氨酸生物合成过程分别由四个酶催化，分别为乙酰羟酸合酶(AHAS，ilvBN基因产物)、乙酰羟酸同分异构酶(AHAIR，ilvC基因产物)、二羟酸脱水酶(DHAD，ilvD 基因产物)和支链氨基酸转氨酶(TA，ilvE基因产物)。1)缬氨酸生物合成调节，普通采用办法是用多拷贝质粒表达ilvBNC、ilvD和ilvE基因。2)运用启动子强弱来控制基因表达。这个方略避免了两个极端，避免了太强基因过表达会对给菌体自身带来压力，也避免了通过基因敲除会彻底切断支路或者互相竞争途径带来麻烦。运用不同强度启动子，可以保证涉及生物合成所有基因都会表达在最适当代谢流量。3)切断或变化平行代谢途径：缬氨酸和异亮氨酸生物合成途径是平行进行，缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸生物合成 途径中公用了三种酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸公用酶系完全用于缬氨酸生物合成，进而提高缬氨酸产量。4)解除菌体自身反馈抑制：缬氨酸合成中第一种限速酶乙酰乳酸合成酶受缬氨酸反馈抑制，同步缬氨酸和异亮氨酸合成酶系受三个末端：即缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸多价阻遏。因而，如果解除乙酰乳酸合成酶反馈抑制和缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物酶系阻遏，必将大大提高缬氨酸积累。为此可选育缬氨酸构造类似物抗性突变株来解除缬氨酸反馈调节。5)增长前体物质合成：生物合成前体物质是丙酮酸，为了积累更多缬氨酸，必要提高丙酮酸产量。通过筛选丙酮酸脱氢酶（PDHC）缺陷菌株或者抑制醌氧化还原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）活性都可以来增长丙酮酸积累。答案二工业发酵若想获得较高产量目产物，必要突破（或解除）微生物细胞自我调节控制机制，最惯用且最有效办法就是从遗传角度选育解除微生物正常代谢调节机制突变株。L-缬氨酸发酵生产代谢调控育种基本途径有：切断或变化平行代谢途径（选育营养缺陷型突变株），解除菌体自身反馈抑制（选育抗反馈调节突变株），选育营养缺陷型恢复突变株，增长前体物质合成，切断进一步代谢途径和运用基因工程技术构建缬氨酸工程菌。 (1)切断或变化平行代谢途径由图，缬氨酸和异亮氨酸生物合成途径是平行进行，缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸生物合成途径中公用了三种酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸公用酶系完全用于缬氨酸生物合成，进而提高缬氨酸产量。同步-乙酰异戊酸是合成缬氨酸和亮氨酸共同前体物。切断亮氨酸合成途径不但可以节约碳源并且解除了菌体生成缬氨酸酶系反馈抑制和多价阻遏，使-异丙基苹果酸合成酶脱敏明显提高缬氨酸产量。通过抑制醌氧化还原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）活性来切断与缬氨酸合成无关代谢流分支对碳源消耗。使碳架物质相对集中地流向缬氨酸。2)解除菌体自身反馈抑制缬氨酸合成中第一种限速酶乙酰乳酸合成酶受缬氨酸反馈抑制，同步缬氨酸和异亮氨酸合成酶系受三个末端：即缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸多价阻遏。因而，如果解除乙酰乳酸合成酶反馈抑制和缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物酶系阻遏，必将大大提高缬氨酸积累。为此可选育缬氨酸构造类似物抗性突变株来解除缬氨酸反馈调节。惯用缬氨酸构造类似物有2-噻唑丙氨酸（2-TA）、-氨基丁酸（-AB）、氟亮氨酸、缬氨酸等。(3)增长前体物质合成由图可以看出生物合成前体物质是丙酮酸，为了积累更多缬氨酸，必要提高丙酮酸产量。通过筛选丙酮酸脱氢酶（PDHC）缺陷菌株或者抑制醌氧化还原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）活性都可以来增长丙酮酸积累。依照上述选育突变株几条途径可选育组合型突变株，如营养缺陷型突变株和抗性构造类似物双重突变株，以提高目产物产量。8. 简述工业发酵五字方略。（结合研究实例阐明） 工业发酵五字方略为“进、通、节、堵、出”，含义分别为：进，增进细胞对碳源等营养物质吸取；通，使来自代谢流上游和各个“注入分支”碳架物质能畅通地流向目产物；节，阻塞与目产物形成无关或关系不大代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目产物；堵，消除或削弱目产物进一步代谢途径；出，增进目产物向胞外空间分泌。 通：缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸生物合成途径中公用了三种酶，即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸公用酶系完全用于缬氨酸生物合成，进而提高缬氨酸产量。 节：通过筛选丙酮酸脱氢酶（PDHC）缺陷菌株来增长缬氨酸前提物质丙酮酸积累。通过敲出编码苏氨酸脱氢酶ilvA基因，可以阻断亮氨酸和泛酸合成，她们与缬氨酸竞争前体物质酮异戊酸。通过抑制醌氧化还原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）活性来阻断与缬氨酸合成无关碳硫分支对碳源消耗。阻塞与缬氨酸形成无关或关系不大代谢支流，使碳架物质相对集中地流向缬氨酸堵：缬氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌育种过程中，筛选终产物分解抑制菌株，达到提高产物目。出：通过抑制相应运送载体蛋白基因表达，从而抑制缬氨酸向胞内运送载体蛋白表达，增进目产物向胞外空间分泌。9 简述微生物基因克隆办法与流程答案一：1. 鸟枪法：将某种微生物所有基因组切成大小适当DNA片段，分别连接到载体DNA上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，从而筛选出具有目基因盼望重组子。基本程序1）目基因DNA片段制备，有机械法和限制性内切酶切割法2）外源DNA片段全克隆3）盼望重组子筛选4）目基因定位2. cDNA法：将供体生物细胞mRNA分离出来，运用逆转录酶在体外合成cDNA，并将之克隆在受体细胞内，通过筛选获得具有目基因编码序列重组克隆。基本程序：1）mRNA分离纯化双链cDNA克隆3）cDNA重组克隆筛选3. PCR扩增法：在DNA单链模板、引物、DNA聚合酶以及缓冲体系中，依照生物DNA复制原理在体外合成DNA。操作环节：1）将待扩增双链DNA加热变性，形成单链模板2）加入两种不同单链DNA引物，并分别与两条单链DNA模板退火3）DNA聚合酶从两个引物3羟基端按照模板规定合成新生DNA链，构成一轮复制反映重复上述操作n次，即可从1分子双链DNA扩增到2n个分子。4. 化学合成法：对于几十个碱基小片段目基因序列，可以分别直接合成气两条互补链，然后退火即可。而大片段双链DNA或目基因合成普通采用单链小片段DNA模块拼接办法，有三种基本形式，小片段粘接法、补丁延长法和大片段酶促法。5. 基因文库法：将微生物所有基因提成若干DNA片段，分别与载体DNA在体外拼接成重组分子，然后导入受体细胞中，形成一套具有微生物全基因组DNA片段克隆，即基因文库。这样就可以从基因文库中点出其中任何DNA片段或目基因。答案二 办法：基因克隆是指应用酶学办法，在体外将目基因与载体DNA结合成一具备自我复制能力DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出具有目基因转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量相似DNA分子拷贝。流程：1) 目基因制备：基因文库 ；cDNA文库。2) 载体选取和制备 ：基本规定：.复制单位;. 克隆位点(各种单克隆位点);. 筛选标记;. 分子量尽量小；. 分子量尽量小;. 外源DNA插入后不影响载体自身复制能力.3) 载体与目基因连接-构建重组体 ：粘性末端连接法（连接效率高）、去5磷酸连接法、人工接头法、同聚物接尾法4) 将重组DNA导入宿主细胞 ： 转化 ：通过自动获取或人为地供应外源DNA，使细胞或培养受体细胞获得新遗传表型过程。 感染(infaction)：由噬菌体和细胞病毒介导遗传信息转移过程 转染(transfection)：真核细胞积极摄取或被动导入外源DNA片段而获得新表型过程。5) 目基因筛选和鉴定 ：免疫学办法；分子杂交 （探针）；原位杂交； PCR；限制性酶切图谱；遗传学办法插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选取（蓝白斑筛选）。10.工业生物技术中亟待解决技术问题有哪些，请举例阐明答案一工业生物技术是指在工业规模生产过程中以微生物或酶为催化剂进行物质转化，大规模地生产人类所需化学品、医药、能源、材料等产品生物技术，它是人类由化石经济向生物经济过渡必要工具，是解决人类当前面临资源、能源及环境危机有效手段。工业生物技术存在着某些核心技术问题亟待解决，目的是大大提高工业生物技术效能。1.微生物资源库和微生物功能基因组学技术：微生物菌种或酶是工业生物技术基本。从自然界中筛选所需要菌种是当前工业生物技术重要特点，大某些成功高产工业化菌株是从自然界筛选得到野生型菌株。但是当前人类筛选范畴十分有限，仅占微生物总数0.1%1%，需要拓展筛选范畴。新型生物催化剂来源是工业生物技术发展基本。正如耐高温DNA聚合酶发现，才导致了PCR技术诞生，从而才会有今天分子生物学巨大成就，并且变化了人类生活面貌。2.生物催化剂迅速定向改造新技术：定向进化当前重要研究方向是：提高热稳定性、提高有机溶剂中酶活性和稳定性，扩大底物选取性，变化光学异构体选取性等。定向进化核心技术为易错PCR技术、DNA shuffling技术及高通量筛选技术。各类工业微生物基因组学和蛋白质组学研究飞速发展，产生了海量信息，随着高性能计算机和数据管理分析办法进步，大大增进了工业微生物生物信息学发展，从而使得人们对酶结识加深，使得应用老式理性分子设计办法制造新酶更加容易。这些技术在增长酶反映多样性、变化酶各种性能等方面已有应用。3. 重要工业微生物代谢工程：随着对微生物代谢网络研究进一步及DNA重组技术日趋完善，通过基因克隆技术变化微生物代谢途径某些核心环节，大大提高了产物产率；通过基因重组技术变化微生物代谢途径，还生产出老式发酵工业无法获得新产品。微生物基因组学和代谢组学迅速发展，对代谢工程有极大推动作用。大量新生物化学合成途径解析，为生产化学品创造了前所未有特殊机会。例如在分析代谢流基本上，找到刚性节点，通过化学小分子调节核心酶，从而可以实现1，6二磷酸果糖超量生产。在木素纤维素为原料燃料酒精工艺中，美国学者运用基因工程手段，将五碳糖产乙醇代谢途径和六碳糖产乙醇代谢途径整合到一种微生物中，构建出优良产乙醇重组菌（Zymomonas mobilis），能同步发酵运用五碳糖和六碳糖产乙醇，大大减少了燃料乙醇生产成本。 答案二工业生物技术中亟待解决技术问题1、 目的产物产量进一步提高高产量2、 副产物含量减少/消除高转化率3、 尽量短时间内完毕发酵过程高生产强度4、 异源蛋白高效合成与理性修饰氨基酸前体供应系统能量/辅因子系统转录水平优化启动子设计与人工启动子RNA加工(剪接、加尾)翻译水平优化核糖体为中心翻译过程优化密码子偏爱性修饰基因OR 宿主翻译后修饰糖基化(真核生物：恰当糖基化水平)、乙酰化伴侣蛋白共表达蛋白质分泌系统优化信号肽、前导肽5、 合成微生物本来不能合成物质萜类： 单萜：芳樟醇、柠檬烯、薄荷醇 倍半萜：青蒿素 二萜：紫杉醇 三萜：熊果酸 四萜：番茄红素、虾青素黄酮： 槲皮素、水飞蓟素、生松素生物碱： 咖啡因、长春新碱、乌头碱、吗啡、可待因n 苯丙素类天然产物：n 维生素： 维生素A 维生素Kn 动物多糖、功能糖 肝素； 氨基葡萄糖6、 扩展底物运用范畴非常规底物耐受性问题n 高分子量底物分解(蛋白质、多糖、脂类)n 底物修饰磷酸化过程n 吸取过程所需转运蛋白n 降解所需要转运蛋白n 降解中间产物耐受性问题n 高效降解所需额外能量供应n 非常规底物降解辅因子/氧化还原平衡问题7、 对极端环境耐受性更酸/更碱对于有机酸而言，更低最适发酵pH值，意味着更少和剂添加和产物分离过程中更少强酸消耗；