金鲳鱼肠炎病的病原菌分离鉴定及其中草药防治.pdf

D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 3-0 9 7 2.2 0 2 4.0 2.0 1 5 文章编号:1 0 0 3-0 9 7 2(2 0 2 4)0 2-0 2 2 8-0 6金鲳鱼肠炎病的病原菌分离鉴定及其中草药防治姜芳燕1,2,谢浪萍2,杨 宁2,黄 海2*(1.琼台师范学院 热带生物多样性与资源利用实验室,海南 海口 5 7 1 1 2 7;2.海南热带海洋学院 热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室,海南 三亚 5 7 2 0 2 2)摘 要:从具有肠道糜烂、肛门突出体外病症的金鲳鱼(T r a c h i n o t u s o v a t u s)体内筛选致病菌株,分离纯化获得菌株0 5 A。通过活菌注射金鲳鱼腹腔回归感染试验,确定菌株0 5 A为致病菌株。经单菌落形态特征、生理生化指标以及1 6 S r R NA分子鉴定,确定其为哈维氏弧菌(V i b r o h a r v e y i)。中草药的体外抑菌实验表明,大蒜、儿茶、五倍子和石榴皮等4种中草药对病原菌0 5 A有较好的抑菌效果,其次是仙鹤草、黄连、黄芩、甘草、大黄、五味子和诃子。关键词:金鲳鱼;肠炎;哈维氏弧菌;分离鉴定;中草药防治中图分类号:S 9 6 5.3 文献标识码:A 开放科学(资源服务)标识码(O S I D):I s o l a t i o n,I d e n t i f i c a t i o n a n d C h i n e s e H e r b a l M e d i c i n e C o n t r o l o f E n t e r i t i s P a t h o g e n i c B a c t e r i a f r o m T r a c h i n o t u s O v a t u sJ I A N G F a n g y a n1,2,X I E L a n g p i n g2,Y A N G N i n g2,H U A N G H a i2*(1.T r o p i c a l B i o d i v e r s i t y a n d B i o r e s o u r c e U t i l i z a t i o n L a b o r a t o r y,Q i o n g t a i N o r m a l U n i v e r s i t y,H a i k o u 5 7 1 1 2 7,C h i n a;2.K e y L a b o r a t o r y o f U t i l i z a t i o n a n d C o n s e r v a t i o n f o r T r o p i c a l M a r i n e B i o r e s o u r c e s o f M i n i s t r y o f E d u c a t i o n,H a i n a n T r o p i c a l O c e a n U n i v e r s i t y,S a n y a 5 7 2 0 2 2,C h i n a)A b s t r a c t:S t r a i n 0 5 A w a s i s o l a t e d f r o m T r a c h i n o t u s o v a t u s s p e c i m e n s w i t h i n t e s t i n a l e r o s i o n a n d a n a l o u t b r e a k.C h a l l e n g e e x p e r i m e n t s u s i n g s t r a i n 0 5 A o n h e a l t h y T.o v a t u s a n d b a c t e r i a l r e-i s o l a t i o n f r o m c h a l l e n g e d d i s e a s e d g o l d e n p o m p a n o s h o w e d t h a t t h e b a c t e r i a s t r a i n n a m e d 0 5 A i n d u c e d i d e n t i c a l p a t h o l o g i c a l s y m p t o m s,i n d i c a t i n g t h a t i t i s t h e c a u s a t i v e p a t h o g e n o f t h e d i s e a s e.A c c o r d i n g t o t h e m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s,p h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s,a n d 1 6 S r R NA s e q u e n c e s,t h e i s o l a t e 0 5 A w a s i d e n t i f i e d a s V i b r o h a r v e y i.B a c t e r i o s t a t i c t e s t o f C h i n e s e h e r b a l m e d i c i n e r e v e a l e d t h a t g a r l i c,c a t e c h u,g a l l n u t a n d p o m e g r a n a t e p e e l h a d g o o d b a c t e r i o s t a t i c e f f e c t o n t h e s t r a i n 0 5 A,f o l l o w e d b y A g r i m o n i a p i l o s a,C o p t i s c h i n e n s i s,S c u t e l l a r i a b a i c a l e n s i s,G l y c y r r h i z a u r a l e n s i s,R h e u m p a l m a t u m,S c h i s a n d r a c h i n e n s i s,a n d T e r m i n a l i a c h e b u l a.K e y w o r d s:T r a c h i n o t u s o v a t u s;E n t e r i t i s;V i b r o h a r v e y i;i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n;C h i n e s e h e r b a l m e d i c i n e c o n t r o l0 引言金鲳鱼学名卵形鲳鲹(T r a c h i n o t u s o v a t u s),属暖水性鱼类,在中国、美洲热带、东南亚、澳大利亚、日本和温带大西洋海岸均有分布1-2。金鲳鱼的体表光滑,鳞细小、形体颜色鲜艳美丽、鱼肉多刺 收稿日期:2 0 2 3-0 6-2 0;修回日期:2 0 2 3-1 2-1 1;*.通信联系人,E-m a i l:j j i a n g f y 2 0 0 51 2 6.c o m;H u a n h a i 7 41 2 6.c o m 基金项目:国家自然科学基金项目(3 2 1 6 0 8 6 1);琼台师范学院高层次人才科研启动项目(3 0 0 3 0 0 0 7 0 4 0);2 0 2 1年度海南热带海洋学院科研启动资助项目(RHD R C 2 0 2 1 0 1);广东省海洋经济发展(海洋六大产业)专项资金项目(粤自然资合2 0 2 22 3号)作者简介:姜芳燕(1 9 8 4),女,浙江衢州人,副教授,博士,主要从事水产病害防治的研究;黄海(1 9 7 4),男,海南三亚人,研究员,博士,主要从事水产养殖的研究。引用格式:姜芳燕,谢浪萍,杨宁,等.金鲳鱼肠炎病的病原菌分离鉴定及其中草药防治J.信阳师范学院学报(自然科学版),2 0 2 4,3 7(2):2 2 8-2 3 3.J I AN G F a n g y a n,X I E L a n g p i n g,YAN G N i n g,e t a l.I s o l a t i o n,I d e n t i f i c a t i o n a n d C h i n e s e h e r b a l m e d i c i n e C o n t r o l o f E n t e r i t i s P a t h o g e n i c B a c t e r i a f r o m T r a c h i n o t u s o v a t u sJ.J o u r n a l o f X i n y a n g N o r m a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n),2 0 2 4,3 7(2):2 2 8-2 3 3.822信阳师范学院学报(自然科学版)J o u r n a l o f X i n y a n g N o r m a l U n i v e r s i t y第3 7卷 第2期 2 0 2 4年4月N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n V o l.3 7 N o.2 A p r.2 0 2 4少,鱼肉中含有不饱和脂肪酸和硒、镁等微量元素,鱼肉质细嫩、味道鲜甜,带有鲳鲹鱼类特殊的香味,是高档食用海洋养殖鱼类,深受人们喜爱,是海南、广东沿海城市主要高档海水养殖品种之一3。细菌性疾病是金鲳鱼养殖中主要的病害之一,一旦防控不当,常常导致金鲳鱼大规模死亡,造成严重的经济损失,成为制约金鲳鱼养殖产业发展的主要障碍之一4。哈维氏弧菌是海洋生物常见的细菌性病原菌,可导致三疣梭子蟹蟹足腐烂5;长牡蛎闭壳缓慢或不闭壳6;方斑东风螺患“翻背症”,背腹面颠倒,壳口朝上,腹足发黑7;抗红鳍东方鲀表皮溃烂,伴随全身性出血,肝脏等组织严重坏死8;珍珠龙趸鱼体烂身,肾脏和脾脏肿大9;圆眼燕鱼鳍条末端颜色变浅,头部呈现充血和局部溃烂1 0;海水杂交罗非鱼鳃内出血1 1;花鲈内脏有明显的出血症状1 2等。涂志刚等1 3从深海人工养 殖 网 箱 患 烂 身 病 的 金 鲳 鱼 分 离 到 哈 维 弧 菌QT 5 2 0,发现利福平、庆大霉素和多西环素等9种抗生素对哈维弧菌QT 5 2 0敏感。丁泽昊等1 4从海南临高网箱养殖患腹水症的金鲳鱼分离到海豚链球菌(S t r e p t o c o c c u s i n i a e),研究表明其对庆大霉素、红霉素和氨苄西林等2 5种抗生素高度敏感。王一帆等2从湛江特呈岛深水网箱养殖患链球菌病的金鲳鱼分离到4株链球菌,结果表明,这些菌株对恩诺沙星、头孢曲松、头孢吡肟等6种抗生素高度敏感。以上几种金鲳鱼细菌性疾病发生后,仍以抗生素治疗为主,而抗生素的使用则会影响金鲳鱼自身的抗病能力,并且造成环境污染和病原抗药性的增加。在我国,为加强抗菌药物管理,遏制细菌耐药,制定出台了 遏制细菌耐药国家行动计划(2 0 1 62 0 2 0 年)1 5。自 2 0 2 0年1月1日起,我国饲料中全面禁止添加抗生素,减少滥用抗生素造成的危 害,维护动物 源食品安全 和公共卫 生安全1 6。基于此,本研究对患肠炎病的金鲳鱼进行病原菌分离纯化、分子测序鉴定和中草药体外抑菌实验,为金鲳鱼绿色、健康养殖提供理论指导。1 材料与方法1.1 材料及试剂患病的金鲳鱼由海南省三亚市崖州湾某养殖户提供,鱼平均体质量约6 0 g,感染实验采用同体质量、健康的金鲳鱼,取自热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室养殖水族箱。儿茶、五倍子、黄连、石榴皮和大蒜等1 8种中草药购于当地的中药药店,其他化学试剂均为国产分析纯。1.2 实验方法1.2.1 金鲳鱼肠炎病病原菌的分离选择患病腹部肿大的金鲳鱼个体,7 5%乙醇酒精棉严格擦拭消毒。超净工作台中,使用剪刀、镊子等工具解剖金鲳鱼,接种环酒精灯火焰上烧红冷却后,从糜烂肠道取样,接种于L B固体培养基平板上,置于生化培养箱中,3 0 培养2 4 h。在培养基上出现单菌落后,用接种环挑取优势单菌落,反复进行划线分离纯化2次,直至获得纯化后菌株,4 短期储存备用,用1 5%甘油洗菌株保种,-8 0 超低温冰箱冷冻保存备用。1.2.2 人工感染实验将健康的金鲳鱼在水族箱中暂养1周后,选择健康的金鲳鱼个体用于感染试验,设实验组3组和对照组3组。每组用金鲳鱼1 0尾,将分离到的细菌用0.9%生理盐水稀释成11 08 C F U/m L菌悬液,每尾金鲳鱼腹腔注射0.1 m L菌悬液,对照组注射同剂量的无菌生理盐水。试验期间水族箱正常投饵,充气,每天更换水族箱中一半的水,记录7 d内水族箱中各组金鲳鱼的死亡情况。死亡的个体需及时捞出,以免污染水质,观察死亡个体的症状,并对其糜烂肠道进行细菌分离,比较分离获得的细菌是否与初筛病原菌形态特征一致。1.2.3 病原菌的形态观察和生理生化特征观察观察培养2 4 h后L B固体培养基上的菌落特征,根据革兰氏染色试剂盒的操作步骤对细菌进行染色,1 0 0倍油镜下显微观察细菌形态特征。对病原菌进行生理生化实验,对照产品说明书,判断生化鉴定管细菌生化反应阴阳性,结合相关文献及查阅 伯杰细菌鉴定手册 和 常见细菌系统鉴定手册 等1 7-1 8,对病原菌进行初步鉴定。1.2.4 病原菌的1 6 S r R NA分子鉴定按照细菌基因组试剂盒的说明书,提取细菌基因组。病原菌的1 6 S r R NA分子鉴定参照参考文献1 9 方法进行。P C R产物送至深圳华大基因有限公司进行测序。1 6 S r R NA序列分析及系统发育树构建参照文献2 0 方法进行。1.2.5 中草药药液的制备中草药药液的制备方法参照文献2 1 进行,1 8种中草药原药液质量浓度为1 0 0 g/L。1.2.6 中草药抑菌实验所分离菌株的中草药抑菌实验采用常规琼脂922姜芳燕,谢浪萍,杨宁,等.金鲳鱼肠炎病的病原菌分离鉴定及其中草药防治扩散(K-B)法,具体操作和敏感性判定标准参照文献2 1 进行。以无菌水作为阴性对照,以氯霉素作为阳性对照,共测定1 8种中草药对病原菌0 5 A的抑菌效果。2 结果与分析2.1 金鲳鱼肠炎病原菌的分离患肠炎病的金鲳鱼,其病症表现为鱼体腹部肿大,身体其他部位无病灶,轻轻按压鱼体腹部,肛门有黄色流体流出(图1 a),解剖鱼体发现肠道糜烂,有黄色积液的腹水(图1 b)。从糜烂的肠道中分离较杂的细菌群落,挑取优势菌落,进行分离纯化培养,获得1株优势菌株,并命名为菌株0 5 A。图1 金鲳鱼肠炎病的发病病症F i g.1 T h e c l i n i c a l s y m p t o m s o f T.o v a t u s e n t e r i t i s2.2 人工感染试验在水族箱中,以纯培养的菌株0 5 A菌悬液,采用腹腔注射法感染健康金鲳鱼,对照组注射无菌生理盐水。3个实验组7 d内死亡率均为1 0 0%,死亡金鲳鱼症状表现为腹部肿大,鱼体其他部位无病灶,解剖鱼体发现肠道糜烂,有黄色积液的腹水,感染实验金鲳鱼发病症状与采样获得的患病金鲳鱼相似。对照组无发病现象。从人工感染发病的金鲳鱼中再次分离纯化获得病原菌,从菌落形态特征上判断与菌株0 5 A为同种细菌,因此判断菌株0 5 A是金鲳鱼肠炎病的病原菌。2.3 病原菌0 5 A的鉴定在无 菌条件下,取保存 备 用 的 菌 株0 5 A于T C B S培养基上接种活化,3 0 恒温培养2 4 h后,T C B S培养基上菌落的颜色为黄色,菌落的直径大小为1.52.5 mm,呈圆形,周边较规则不透明,菌苔湿润光滑不发光。革兰氏染色显微观察,该菌株为革兰氏阴性菌,钝形,呈短杆状,油镜下观察大小约2.0 m0.8 m。根据其生理生化特征结果,2 1项指标中1 5项生理生化特性与标准哈维氏弧菌(V i b r o h a r v e y i)完全一致(表1),初步鉴定菌株0 5 A为哈维氏弧菌。致病菌0 5 A的1 6 S r R NA序列扩增产物电泳结果,1 6 S r R NA目的片段约为1 5 0 0 b p,测序结果显示扩增产物的片段为1 3 5 0 b p,利用ME GA 6.0软件中M a x i m u m L i k e l y h o o d方法构建0 5 A菌的系统发育树(图2),以嗜水气单胞菌(A e r o m n a s h y d r o p h i l a)为外类群,构建系统发育树。结果表明0 5 A菌与哈维氏弧菌(V i b r i o h a r v e y i)的同源性为1 0 0%,鉴定菌株0 5 A为哈维弧菌(G e n B a n k:ON 8 9 2 0 7 7)。表1 菌株0 5 A的生理生化特征T a b.1 P h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f s t r a i n 0 5 A项目生理生化特征0 5 AV i b r o h a r v e y i尿素-葡萄糖-阿拉伯糖-硫化氢-半乳糖-6 7%蔗糖-8 3%水杨素-七叶苷+-果糖-N D木糖-棉子糖-项目生理生化特征0 5 AV i b r o h a r v e y i甘露糖-4 0%乳糖-甘露醇-+纤维二糖-+肌醇-山梨醇-卫茅醇-N D麦芽糖+鼠李糖-亚硝酸盐-N D 注:“+”代表阳性,“-”代表阴性,百分数代表阳性所占百分率,N D表示未检测。图2 基于菌株0 5 A的1 6 S r R NA序列所构建的系统发育树F i g.2 P h y l o g e n e t i c t r e e c o n s t r u c t e d b a s e d o n t h e 1 6 S r R N A s e q u e n c e o f s t r a i n 0 5 A 金鲳鱼肠炎病由V.h a r v e y i 0 5 A引起,其致死率较高,给金鲳鱼养殖业造成重大的经济损失。更为严峻的是哈维弧菌还表现出了较强的耐药性。032第3 7卷 第2期信阳师范学院学报(自然科学版)h t t p:/j o u r n a l.x y n u.e d u.c n2 0 2 4年4月蒋魁等2 2对南海沿岸鱼类养殖水域中采集到9 0株哈维弧菌进行抗生素耐药分析,结果表明这些菌株具有复杂多样的耐药谱,给哈维弧菌病的防治带来了极大的挑战。此外,抗生素的使用也会影响养殖鱼类自身的抗病能力,而且抗生素残留还会污染养殖水域,将严重威胁人类的健康。2.4 中草药对病原菌0 5 A的抑菌效果本研究通过单因素实验,考察儿茶、五倍子、黄连、石榴皮和大蒜等1 8种中草药对菌株0 5 A的抑菌效果(表2)。结果表明大蒜、儿茶、五倍子和石榴皮等4种中草药有较好的抑菌效果,对菌株0 5 A表现为高度敏感,抑菌圈直径为2 13 3 mm。其次是仙鹤草、黄连、黄芩、甘草、大黄、五味子和诃子,抑菌圈直径为1 02 0 mm。而其余7种中草药则完全没有抑菌效果。1 8种中草药的抑菌效果最好的是大蒜,其对病原菌0 5 A的抑菌效果略高于氯霉素的效果。表2 不同中草药对菌株0 5 A的抑菌效果T a b.2 A n t i b a c t e r i a l e f f e c t o f d i f f e r e n t C h i n e s e h e r b a l m e d i c i n e o n t h e s t r a i n s 0 5 A中草药抑菌圈直径/mm敏感性儿茶2 1+五倍子2 2+黄芪0-马齿苋0-仙鹤草1 3+黄连1 4+黄芩1 4+甘草1 4+断血流0-C K无菌水0-中草药抑菌圈直径/mm敏感性半边莲0-地锦草0-大黄1 5+五味子1 0+诃子1 4+石榴皮2 1+线椒0-大蒜3 3+急性子0-C K氯霉素3 0+注:“+”代表高度敏感;“+”代表中度敏感;“+”代表敏感;“-”代表不敏感。中草药富含多种活性物质,既可以抑菌杀菌也能增强机体的免疫力,而且价格低廉,取材方便,具有无抗药性、无残留和无染污等特性,已成为水产养殖动物防治病害的理想药物2 3。樊英等2 0考察1 6种 中草药对中 国对虾致病 菌哈维氏弧 菌(V.h a r v e y i T C B S-G)的抑制效果,黄芪和地锦草对病原菌T C B S-G表现出了极强的抑制效果,其抑菌圈均达到 2 5 mm。王洪彬等2 4测定2 4味中草药对哈维氏弧菌的体外抑菌效果,结果表明黄芩、连翘、女贞子、乌梅、苏木、夏枯草这6种药物抑菌效果较好。在本研究中,黄芪和地锦草对哈维氏弧菌(V.h a r v e y i 0 5 A)无抑菌作用,黄芩对病原菌0 5 A为中度敏感。而大蒜、儿茶、五倍子和石榴皮等4种中草药对病原菌0 5 A有较好的抑菌效果。其中大蒜对病原菌0 5 A的抑菌效果略高于氯霉素的效果,且未表现出耐药性。分析原因,可能是与哈维弧菌菌株的不同来源以及中草药的制备方式等相关。与常规的抗生素相比,大蒜、儿茶、五倍子和石榴皮均为天然药食用成分,完全可以通过金鲳鱼自身进行代谢,无药物残留,同时也不会污染金鲳鱼养殖水环境,而且来源方便,价格低廉,是可用于金鲳鱼病害防治的理想药物。3 结束语本研究从患肠炎病的金鲳鱼肠道、腹水中分离纯化获得致病菌0 5 A,通过显微镜观察细菌的形态特征、生理生化特征以及1 6 S r R NA分子鉴定,确定其为哈维弧菌(V.h a r v e y i 0 5 A)。通过单因素实验考察儿茶、五倍子、黄连、石榴皮和大蒜等1 8种中草药对菌株0 5 A的抑菌效果。结果表明,大蒜、儿茶、五倍子和石榴皮等4种中草药有较好的抑菌效果,为高度敏感。为了进一步提高这4种中草药对哈维弧菌的抑菌效果,本课题组将通过响应面优化实验获得它们的复方制剂。此外,目前尚未弄清这几种中草药对哈维弧菌的抑菌机理,还要做进一步的研究和开发,才能更好地减少哈维弧菌对金鲳鱼养殖行业的影响,从而为金鲳鱼的养殖生产实践提供一种安全、健康、环保的养殖方式。参考文献:1 虞为,李欣,林黑着,等.不同密度的卵形鲳鲹与凡纳滨对虾混养效果研究J.水产学杂志,2 0 2 1,3 4(2):8 6-9 3.YU W e i,L I X i n,L I N H e i z h a o,e t a l.E f f e c t s o f d i f f e r e n t d e n s i t i e s o f g o l d e n p o m p a n o T r a c h i n o t u s o v a t u so n e c o n o m i c a n d e c o l o g i c a l b e n e f i t s i n p o l y c u l t u r e o f p a c i f i c w h i t e l e g s h r i m p L i t o p e n a e u s v a n n a m e i w i t h g o l d e n p o m p a n oJ.C h i n e s e J o u r n a l o f F i s h e r i e s,2 0 2 1,3 4(2):8 6-9 3.2 王一帆.北部湾海域深水网箱养殖卵形鲳鲹链球菌病的流行病学研究及环境驱动因素分析D.湛江:广东海洋大学,2 0 2 2.132姜芳燕,谢浪萍,杨宁,等.金鲳鱼肠炎病的病原菌分离鉴定及其中草药防治WANG Y i f a n.E p i d e m i o l o g i c a l s t u d y a n d e n v i r o n m e n t a l d r i v i n g f a c t o r s o f s t r e p t o c o c c o s i s i n d e e p-w a t e r c a g e c u l t u r e o f T r a c h i n o t u s o v a t u s i n B e i b u g u l f s e aD.Z h a n j i a n g:G u a n g d o n g O c e a n U n i v e r s i t y,2 0 2 2.3 农业农村部渔业渔政管理局,全国水产技术推广总站,中国水产学会.中国渔业统计年鉴 2 0 2 3M.北京:中国农业出版社,2 0 2 3.F i s h e r i e s a n d F i s h e r i e s A d m i n i s t r a t i o n o f t h e M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n d R u r a l A f f a i r s,N a t i o n a l A q u a t i c T e c h n o l o g y P r o m o t i o n S t a t i o n,C h i n a S o c i e t y o f F i s h e r i e s.C h i n a f i s h e r y s t a t i s t i c a l y e a r b o o k:2 0 2 3M.B e i j i n g:C h i n a A g r i c u l t u r e P r e s s,2 0 2 3.4 李安.患刺激隐核虫病卵形鲳鲹的继发细菌疾病研究D.海口:海南大学,2 0 2 0.L I A n.S t u d y o n s e c o n d a r y b a c t e r i a l d i s e a s e s o f T r a c h i n o t u s o v a t u s w i t h c r y p t o c a r y o n i a s i sD.H a i k o u:H a i n a n U n i v e r s i t y,2 0 2 0.5 周永强,李登峰,彭姣,等.养殖三疣梭子蟹体内哈维氏弧菌的分离与致病性鉴定J.应用海洋学学报,2 0 1 3,3 2(2):2 1 5-2 2 1.Z HOU Y o n g q i a n g,L I D e n g f e n g,P E NG J i a o,e t a l.I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f p a t h o g e n i c V i b r i o h a r v e y i f r o m s w i mm i n g c r a b,P o r t u n u s t r i t u b e r c u l a t u sJ.J o u r n a l o f A p p l i e d O c e a n o g r a p h y,2 0 1 3,3 2(2):2 1 5-2 2 1.6 高晓建,姚东瑞,孙晶晶,等.4株长牡蛎(C r a s s o s t r e a g i g a s)致病性哈维氏弧菌(V i b r i o h a r v e y i)鉴定及其毒力基因检测J.海洋湖沼通报,2 0 1 5(3):8 7-9 6.G AO X i a o j i a n,YAO D o n g r u i,S UN J i n g j i n g,e t a l.I d e n t i f i c a t i o n o f 4 p a t h o g e n i c V i b r i o h a r v e y i s t r a i n s i s o l a t e d f r o m d i s e a s e d o y s t e r(C r a s s o s t r e a g i g a s)a n d d e t e c t i o n o f t h e i r v i r u l e n c e g e n e sJ.T r a n s a c t i o n s o f O c e a n o l o g y a n d L i m n o l o g y,2 0 1 5(3):8 7-9 6.7 赵旺,吴开畅,王江勇,等.方斑东风螺“翻背症”的病原及初步治疗研究J.水产科学,2 0 1 6,3 5(5):5 5 2-5 5 6.Z HAO W a n g,WU K a i c h a n g,WANG J i a n g y o n g,e t a l.P a t h o g e n a n d t r e a t m e n t o f“r e v e r s e b a c k s y n d r o m e”o f w h e l k B a b y l o n i a a r e o l a t aJ.F i s h e r i e s S c i e n c e,2 0 1 6,3 5(5):5 5 2-5 5 6.8 秦艺丹,李男,李洋,等.抗红鳍东方鲀皮肤溃烂病病原哈维弧菌单克隆抗体的制备及特性分析J.现代农业科技,2 0 1 6(8):2 3 9,2 6 0.Q I N Y i d a n,L I N a n,L I Y a n g,e t a l.P r e p a r a t i o n a n d e v a l u a t i o n o f m o n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t V i b r i o h a r v e y i i s o l a t e d f r o m d e r m a l u l c e r o f F u g u r u b r i p e sJ.M o d e r n A g r i c u l t u r a l S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y,2 0 1 6(8):2 3 9,2 6 0.9 蒋魁,徐力文,苏友禄,等.两株珍珠龙趸病原性哈维弧菌(V i b r i o h a r v e y 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n d a n t i b i o t i c s e n s i t i v i t y o f a p a t h o g e n i c