抗松材线虫病马尾松种质资源遗传多样性分析及核心种质构建.pdf

抗松材线虫病马尾松种质资源遗传多样性分析及核心种质构建邓莉丽1,2，刘青华1，周志春1，高凯1，骆定会3（1.中国林业科学研究院亚热带林业研究所浙江省林木育种技术研究重点实验室，浙江杭州311400；2.南京林业大学林学院，江苏南京210037；3.浙江省临海市自然资源和规划局，浙江临海317000）摘要：【目的目的】对来自安徽省林业科学研究院和异地保存在浙江省临海市林业技术推广和场圃旅游服务总站的 114 份抗松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 病马尾松 Pinus massoniana 种质进行遗传多样性与群体结构分析，构建抗性马尾松核心种质库。【方法方法】对 114 份抗性马尾松种质进行检测，使用分子生物学软件计算遗传多样性参数，并进行主坐标(PCoA)和群体结构分析。利用 M 策略和随机取样策略分别构建核心种质，分析不同核心种质的的遗传多样性参数，确定最适合的构建方法。【结果结果】114 份抗性马尾松种质共检测到 115 个等位基因，平均有效等位基因数(Ne)为 5.54，平均 Shannons 多样性指数(I)为 1.51，平均多态信息含量(PIC)为 0.90，结果表明其具有较高的遗传多样性水平。群体结构分析将 114 份抗性马尾松种质分为 4 个亚群，主坐标分析结果与上述基本一致。根据遗传多样性参数和抽样数量综合考虑，M 策略构建的核心种质能以最小的种质数保留原有种质最大的遗传多样性，为最佳的取样策略。利用该策略得到了 72 份核心种质，其保留了原有种质 100%的等位基因数，Ne、I、期望杂合度(He)、PIC等遗传参数的保留率分别为95.67%、94.96%、98.12%和 100.00%，将构建的核心种质与原有种质进行 t 检验、PCoA 分析和 UPGMA 聚类分析，结果表明两者间的遗传多样性无显著差异。【结论结论】114 份抗性马尾松种质遗传多样性水平较高，构建的 72 份抗性马尾松核心种质，去除了遗传冗余，有利于抗性马尾松种质资源的有效保护和科学利用，可为优异基因发掘和新品种选育提供参考。图 7 表 8 参 37关键词：马尾松；抗松材线虫病；SSR；遗传多样性；核心种质中图分类号：S722.3文献标志码：A文章编号：2095-0756(2024)01-0067-12Geneticdiversityanalysisandcorecollectionofpinewoodnematodiasis-resistantPinus massonianagermplasmresourcesDENGLili1,2，LIUQinghua1，ZHOUZhichun1，GAOKai1，LUODinghui3（1.ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofTreeBreeding,ResearchInstituteofSubtropicalForestry,ChineseAcademyofForestry,Hangzhou311400,Zhejiang,China;2.CollegeofForestry,NanjingForestryUniversity,Nanjing210037,Jiangsu,China;3.Linhai Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang Province,Linhai 317000,Zhejiang,China）Abstract:ObjectiveThisstudy,withanalysesconductedofthegeneticdiversityandpopulationstructureof114 germplasm resources of pinewood nematodiasis-resistant Pinus massoniana from Anhui Academy ofForestryandForestryTechnologyExtensionandFarmtourismServiceCenterofLinhaiinZhejiangProvince,andtheconstructionofacorecollectionofthegermplasmresources,isaimedtoprovideatheoreticalbasisfor收稿日期：2023-05-29；修回日期：2023-10-09基金项目：浙江省“十四五”育种专项林木协作组课题(2020C02007)；江西省林业局林业科技创新专项(创新专项202113 号)作者简介：邓莉丽(ORCID:0009-0002-3535-9972)，从事林木遗传育种研究。E-mail:Lili_D。通信作者：刘青华(ORCID:0000-0002-7960-6739)，研究员，博士，从事抗性马尾松遗传改良研究。E-mail:浙江农林大学学报，2024，41（1）：6778Journal of Zhejiang A&F Universitydoi:10.11833/j.issn.2095-0756.20230333thescientificmanagementandefficientutilizationofgermplasmresourcesofP.massoniana.MethodFirst,atotalof114resistantP.massonianagermplasmsweredetectedbeforetheirprincipalco-ordinatesanalysis(PCoA),population structure and genetic diversity parameters were calculated by bioinformatics software.Then,the core collection was constructed by using M strategy and random sampling strategy so that acomparativeanalysiswasconductedofthegeneticdiversityindicatorsofdifferentcorecollectioninordertodetermine the most suitable construction method.Result 115 alleles were detected in 114 resistant P.massonianagermplasms,withanaverageeffectiveallelenumber(Ne)of5.54,anaverageShannonsdiversityindex(I)of1.51,andanaveragePICvalueof0.90forpolymorphicinformationcontent,whichhadahighgeneticdiversity.ThepopulationstructureanalysisbasedonStructuresoftwareshowedthatthe114resistantP.massoniana germplasm resources were divided into four subgroups,and the result of principal coordinateanalysiswasbasicallyconsistentwiththeabove.Basedonthegeneticdiversityparametersandthesamplingquantity,thecorecollectionconstructedbytheMstrategycouldretainthemaximumgeneticdiversityoftheoriginalgermplasmwiththeminimumsamplingquantity,whichwastheoptimalsamplingstrategy.72corecollectionswereobtainedusingthisstrategy,whichretained100%allelesoftheoriginalgermplasm,withtherationratesofNe,I,expectedheterozygosity(He),PICbeing95.67%,94.96%,98.12%,100.00%.NosignificantdifferenceingeneticdiversitywasshownbetweentheconstructedcoregermplasmandtheoriginalgermplasmaccordingtothePCoAandUPGMAclusteranalysis.ConclusionThelevelofgeneticdiversityof114resistant P.massoniana germplasm was high.The 72 core germplasm of resistant P.massoniana wereconstructed to remove genetic redundancy,which is conducive to the effective conservation and scientificutilizationofresistantP.massonianagermplasmresources,andlaysthefoundationforexcellentgenediscoveryandnewcultivarselection.Ch,7fig.8tab.37ref.Key words:Pinus massoniana;pinewoodnematodiasis-resistance;SSR;geneticdiversity;corecollection松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 病是 20世纪 80年代初传入中国的一种毁灭性森林病害，其传播速度快，防治难度大，危害中国松林面积超 180万 hm2，其中，马尾松 Pinus massoniana 最易受感染，松材线虫病对中国马尾松林业经济发展造成了极大破坏1。马尾松具有速生、耐旱等优良特点，松林面积达 804万 hm2，是中国南方荒山造林的先锋树种2。近 40a 的林业生产实践和研究发现，松树种间和种内不同个体对松材线虫病的抗性存在较大差异，且马尾松群体中存在抗病基因型，因此选育抗性品种是当前治理松材线虫病害最经济有效的途径之一3。自 2001 年开始，中国开展了马尾松松材线虫病抗性育种研究，现已收集保存一批抗松材线虫病马尾松种质资源46。种质资源是遗传改良的物质基础，种质资源收集保存的越多，其群体遗传多样性越高，但收集保存的成本也越高。FRANKEL 等7提出核心种质的概念，即用最小的遗传资源数量和最小的遗传冗余最大限度地代表整个遗传资源的多样性。通过构建核心种质，能最大限度地去除重复和遗传关系较近的种质材料，加强现有抗性马尾松种质资源的有效保护利用，降低管理成本8。分子标记法是林木遗传多样性分析、种质资源评价和核心种质库构建常用的方法913。其中简单序列重复(SSR)分子标记具有多等位基因、共显性和高度多态性等优点，能够直观反映不同种质间遗传信息差异，在遗传育种中得到广泛应用14。L等15利用SSR分子标记数据研究了桉树 Eucalyptus cloeziana 的遗传多样性并构建了核心种质；唐玉娟等16利用 12 对SSR引物对杧果Mangifera indica 种质资源的遗传多样性进行分析并构建了分子身份证；HU 等17利用SSR分子标记技术对猕猴桃 Actinidia chinensis 的遗传多样性进行研究，构建了猕猴桃核心种质。本研究利用SSR分子标记技术对前期筛选获得的 103 份抗松材线虫病马尾松种质和安徽省林业科学研究院审定的高抗良种进行遗传多样性及亲缘关系分析，并基于 M 策略和随机取样策略构建核心种质，通过分析不同构建策略的核心种质确定抗性马尾松核心种质的最适取样比例，为抗性马尾松种质资源的合理开发和利用以及挖掘优异基因提供理论支撑。68浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日1材料与方法1.1材料2018 年，在国家马尾松种质资源库中依据松脂和抗性的关系，从 1207 株树中选择 120 份候选抗性马尾松无性系，同年在松材线虫病重灾区严重感染林分中收集健康树 242 份，并将所有无性系嫁接保存于浙江省临海市林业技术推广和场圃旅游服务总站(2888N，12101E)。20182020 年连续 3a 高强度对收集区内的候选抗性马尾松无性系进行人工接种松材线虫测定，筛选存活健康株系，共获得 103 份抗性马尾松无性系，另取安徽省林业科学研究院审定的抗松材线虫病良种(为目前中国所有的抗松材线虫病良种)作为对照。合计 114 份，其中浙江 37 份、江西 26 份、安徽 42 份、福建 6 份、贵州 1 份、广西2 份。采集抗性样株幼嫩针叶，在80 冰箱中保存，各试验材料编号及来源见表 1。1.2方法1.2.1DNA 提取及 SSR 引物信息马尾松针叶基因组 DNA 采用北京艾德莱生物科技有限公司生产的改良 CTAB 植物基因组 DNA 快速提取试剂盒提取。利用超微量分光光度计，根据在 260nm 的吸光度表1材料编号及来源Table1Testmaterialsnumberandsource编号来源编号来源编号来源编号来源1广西贵港35安徽黄山DAC12浙江临海HGS5浙江临海2广西桂平36安徽黄山DAC13浙江临海HGS6浙江临海3贵州黎平37安徽全椒DAC15浙江临海HGS8浙江临海4福建南平38安徽泾县DAC17浙江临海HGS9浙江临海6福建南平39安徽休宁DAC18浙江临海HGY1浙江临海7安徽休宁40安徽休宁DAC19浙江临海LS001浙江临海9安徽休宁41安徽休宁DAC20浙江临海LS003浙江临海10安徽祁县42安徽休宁DAC21浙江临海LS005浙江临海11福建南平43安徽休宁DAC22浙江临海LS007浙江临海12浙江淳安44安徽休宁DAC23浙江临海LS008浙江临海13浙江淳安45安徽休宁DAC24浙江临海LS009浙江临海14福建南平46安徽休宁DAC26浙江临海LS010浙江临海15浙江松阳47安徽休宁DAC34浙江临海XJ003江西峡江17福建南平48安徽休宁DLS27浙江临海XJ004江西峡江19江西婺源49安徽休宁DLS28浙江临海XJ005江西峡江20福建南平71江西分宜DLS29浙江临海XJ014江西峡江21安徽广德114江西分宜DLS30浙江临海AH1安徽广德22安徽广德161江西分宜DLS31浙江临海AH2安徽滁州23安徽广德231江西分宜DLS32浙江临海AH3安徽黄山24安徽广德242江西分宜DLS33浙江临海AH4安徽休宁25安徽广德305江西分宜DLS35浙江临海AH5安徽广德26安徽广德355江西分宜DLS36浙江临海AH6安徽广德27安徽广德398江西分宜DLS37浙江临海AH7安徽广德28安徽广德413江西分宜DLS38浙江临海AH8安徽泾县29安徽广德461江西分宜DLS40浙江临海AH9安徽广德30安徽和县473江西分宜HGS11浙江临海AH10安徽休宁31安徽和县485江西分宜HGS2浙江临海AH11安徽广德32安徽和县486江西分宜HGS3浙江临海34安徽和县490江西分宜HGS4浙江临海说明：AH1AH11为安徽省林业科学研究院审定的马尾松抗松材线虫病良种皖马抗111号。第 41 卷第 1 期邓莉丽等：抗松材线虫病马尾松种质资源遗传多样性分析及核心种质构建69D(260)和 D(260)/D(280)确定 DNA 样品的纯度和质量浓度，经检验合格后的 DNA 用 TE 溶液或去离子水(灭菌后)稀释至 2050mgL1，置于20 的冰箱保存备用。参考董虹妤等18和 YANG 等19使用的马尾松SSR引物，用质量浓度为 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选条带清晰且多态性较高的 SSR 引物(图 1)，最终筛选出具有高多态性引物 14 对(表 2)，引物序列由浙江尚亚生物技术有限公司合成。引物 F06引物 D07引物 H03引物 H04MM图1引物多态性检测图Figure1Primerpolymorphismdetectiondiagram表214 对 SSR 引物信息Table214pairsofSSRprimerinformation编号引物名称正向引物(53)反向引物(53)1H03CTCCAAAGGCGAGACTGCACGAAAGCCAAGCTGAAC2D04AGGATGGTATGGTCGTGGCCCTTCTTCGCTCTGTGA3H04AAGAAGCGATCTGAGATGACTAACTGTCATTGATTGTTTCCTTTTG4B05CCGTGCCTTCAGCATCTTCTCAGTGGATCTGTCACCTCCTCAT5F05AGAAGAAGAGCAGCAGTTTCGGTTTTCCATTGTTCTCACT6H05GTGCCTTCAGCATCTTCTACATCTGTCACCTCCTCATCTT7B06TATTAGCACCCCTCCAAAGTGGGGTAGAAGAATCGTAAGT8D06GATTCGGCTTCGTGACCTTCCCCCATAACCCCTGTC9F06AAGGACTTACAGAGGTTGGGTTGCTGCGACGAGCGTTTCT10H06TTCCTACCGCTGGGTTCTTGGACCTGACCTCGGGCATTAC11D07TCGCCTGGGCTTTGTCTGGCGGGTTGCATATTTGGTG12F07CAGCATCTTCTACATCTGAGTCCAATCAAAAAGACTACATCACT13H07CACCATCGGTTTCTCCATCCTCAATCAAAAAGACTACATCACT14D08TGCTTTCAGAAGGATAAGGGGTAAATACAATACTGGGTTTCGCC1.2.2SSR-PCR 扩增和毛细管电泳利用选取的 14 对SSR引物对 114 份马尾松 DNA 样本进行 PCR 扩增，设定本研究的反应体系为 25.0L：2TaqPlusMasterMix(NazymeCode：P211-03)12.5L，引物F 和 R(10molL1)各 1.0L，DNA 模板 2.0L，ddH2O8.5L。PCR 扩增反应在 TakaraPCRThermalcycler 上进行，其程序为：95 预变性 3min；95 变性 15s，60 退火 15s，72 延伸 30s，35 个循环；72 延伸 5min，4 保存。所得 PCR 产物采用 Qsep100 全自动毛细管电泳核酸分析仪进行检测和基因分型。1.2.3遗传参数及群体结构分析利用 GenAlex6.520计算各位点的遗传多样性参数，包括等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannons 多样性指数(I)、近交系数(Fis)、固定指数(F)和基因流(Nm)，并对收集的抗松材线虫病马尾松种质进行主坐标分析(PCoA)。采用Cervus2.021获得微卫星位点的多态信息含量(PIC)。利用 Structure2.3.422对抗性马尾松种质资源进行分类，推测最佳聚类组群数目，确定群体结构，并对各亚群的遗传多样性参数进行分子方差分析(AMOVA)。1.2.4核心种质构建对抗松材线虫病马尾松种质进行群体结构分析后，利用 PowerCore23和 CoreFinder24对各亚群基于不同算法构建核心种质。其中，PowerCore 是利用随机取样策略和启发式算法，寻找从初始阶段到最终阶段的最优路径进行核心集合选择；CoreFinder 基于 NP-完全覆盖问题，采用拉斯维加斯式(LasVegas-style)随机算法的 M 策略进行样本选择。在构建核心种质过程中，PowerCore 和70浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日CoreFinder 会自动生成合理的取样比例。最后利用 SPSS26.0 和 Excel 中 t 检验对原有种质与核心种质各遗传多样性指标进行差异显著性分析，同时运用 PCoA 和 Powermarker25对所构建的核心种质构建UPGMA 进化树，确认构建的核心种质的代表性。2结果与分析2.1抗松材线虫病马尾松种质资源遗传多样性分析由表 3 可知：14 对SSR引物在 114 份抗松材线虫病马尾松样本中共检测出 115 个等位位点，Na为511，平均为 8.17。所有材料的 Ne为 3.458.05，平均为 5.54。Ho和 He的分别为 00.57 和 0.510.73，He均值(0.64)高于 Ho均值(0.06)，Fis平均为 0.92，综合表明该抗性马尾松种质中存在杂合子缺失现象。PIC为 0.820.95，平均为 0.9，I 为 1.151.90，平均为 1.51，表明所选引物多态性高。表3不同 SSR 位点的遗传多样性统计Table3GeneticdiversityofdifferentSSRmicrosatelliteloci位点NaNeHoHePICIFisFNmH0353.540.000.590.831.181.001.000.68D0474.620.010.620.891.380.980.980.60H0495.510.040.650.931.550.940.950.70B0585.930.000.660.921.570.990.990.78F0563.570.000.510.821.150.990.990.43H0596.460.000.660.951.591.001.000.63B0695.870.010.650.921.540.990.990.67D0674.720.000.620.901.391.001.000.55F0675.090.020.640.931.470.980.980.62H06118.050.570.730.931.900.210.190.92D07106.350.010.660.931.620.980.980.64F07106.990.020.680.931.700.970.980.69H07117.450.140.700.931.790.790.760.76D0863.450.000.600.821.250.990.990.50平均8.175.540.060.640.901.510.920.910.66说明：Na.等位基因数；Ne.有效等位基因数；Ho.观测杂合度；He.期望杂合度；PIC.多态信息含量；I.Shannons 多样性指数；Fis.居群近交系数；F.固定指数；Nm.基因流。2.2抗松材线虫病马尾松种质群体结构和主坐标分析Structure 分析得出的结果经 StructureHaevester 处理后发现(图 2A)：lnP(D)(马尔科夫链不作数迭代后所得的对数似然值)持续增大，没有拐点，可用KL(K)在连续 K 之间变化率的增量来确定最优分组数(K)。由图 2B 可知：当 K=4 时，K 取得最大值，表明参试的 114 份马尾松样本被划分为 4 个亚群。亚群(绿色)包含了 12 份种质资源，其中 2 份来自广西，1 份来自贵州，3 份来自福建，2 份来自安徽，4 份来自浙江；亚群(黄色)包含 24 份种质资源，其中 8 份来自安徽，7 份来自江西，9 份来自浙江，该亚群有 12 份抗性马尾松种质掺杂有来自红色部分的基因；亚群(红色)包含了 29 份种质资源，其中 10 份来自安徽(均为皖马抗良种)，8 份来自江西，11 份来自浙江，共有 12 份抗性马尾松种质掺杂有来自黄色部分的基因；亚群(蓝色)包含 49 份种质资源，其中 2 份来自福建，21 份来自安徽(其中1 份为皖马抗良种)，11 份来自江西，15 份来自浙江(图 3)。由 Structure 输出的分组结果可知(表 4)：筛选获得的抗性马尾松种质中有 75.4%的个体样本隶属不同亚群的比例(Q)0.8，仅有 12.3%的个体Q0.6，表明抗性马尾松种质群体结构较强，不同来源的个体被聚在相同的遗传结构中表明不同省间的马尾松存在基因渗入现象。基于遗传距离矩阵对抗性马尾松材料进行主坐标分析(PCoA)。由图 4 可知：全部马尾松种质资源可大致分为 3 组，主坐标 1 和 2 分别解释了位点信息数据中 10.45%和 6.74%的变异。基于抗性马尾松第 41 卷第 1 期邓莉丽等：抗松材线虫病马尾松种质资源遗传多样性分析及核心种质构建71114 份样本主坐标分析图可知：大部分地理来源一致的抗性马尾松种质分布比较集中，但来自安徽、江西、浙江的部分抗性马尾松种质在 3 个组中均有分布。结合群体结构分析结果可知：114 份抗性马尾松种质资源的分布情况基本符合群体结构分析。2.3抗松材线虫病马尾松各亚群间遗传多样性及分子方差分析由表 5 可见：抗性马尾松种质各亚群的遗传多样性整体水平较高。亚群的等位基因数在 4 个亚群表4各亚群基因型情况Table4Numberofgenotypesineachcluster亚群各亚群种质数量各亚群基因型数Q0.6Q0.812012249122951749045说明：Q为样本隶属不同亚群的比例。5 500AB6 0006 500 K7 0007 5008 0006453210234567834567lnP(D)KK图2lnP(D)和K 随 K 变化的折线图Figure2LineplotsoflnP(D)andKasafunctionofK亚群 1.00.80.60.40.201.00.80.60.40.201.00.80.6QQQ0.40.20305161HGS2HGS4HGS9LS001HGS6HGS5114231HGS11HGS8HGS3DAC22DLS40242HGY146DLS30DLS314849DLS29DLS3471DLS27DLS32DLS28476791214DLS33413DLS35231AH11321936DAC18AH71017490DAC17112135AH5AC12485DLS37DLS38374732927AH9461DAC152324AH1AH8AH3DAC1315AH2283982022DLS36AH448626AH103134355XJ014AH62530384339444134045DAC1942DAC2141DAC20LS005LS007DAC26LS008XJ003LS010XJ004LS009XJ005LS003DAC24DAC23亚群 亚群 亚群 样本编号样本编号Q为样本隶属不同亚群的比例。样本编号图3114 份抗性马尾松样本的 Structure 聚类图Figure3Structureclusterdiagramof114samplesofresistantP.massoniana主坐标 2主坐标 1广西贵州福建安徽江西浙江图4抗性马尾松 114 份样本主坐标分析Figure4Principalcoordinateanalysisof114samples72浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日中最大(13.43)，亚群具有最低的等位基因数(6.07)。抗性马尾松 4 个亚群所包含的马尾松个体数不同，但亚群间遗传多样性水平差异不明显。亚群的 Ne最高，为 7.14，而最低的是亚群，为 4.87。亚群的 Ho和 He均最高，但与具有最小值的亚群差异不显著，分别高 0.03 和 0.15。AMOVA 方差分析表明(表 6)：抗性马尾松遗传变异 14%存在于亚群间，而亚群内变异为 80%，表明亚群内的遗传变异是抗性马尾松变异的主要来源。4 个亚群间 FST为 0.143，表明亚群间存在中等程度遗传分化。2.4抗松材线虫病马尾松核心种质库构建与评价利用 M 策略和随机取样策略构建核心种质的遗传多样性指标见表 7。结果显示：基于随机取样策略的 PowerCore 和基于 M 策略的 CoreFinder 分别筛选得到的核心种质均保留了原有种质 100%的等位基因数。但 CoreFinder 核心种质包含的种质(72 份)少于 PowerCore(79 份)，且两者间各遗传多样性参数差异不显著(P0.05)。综合以上分析表明：选择 M 策略抽取 72 份抗性马尾松种质能够以最小的种质份数最大程度地代表收集区内抗性马尾松种质资源的遗传多样性。利用 M 策略构建的核心种质中包含广西 2 份(100.0%)、贵 州 1 份(100.0%)、福 建 4 份(66.7%)、安 徽 33 份(其 中 4 份 为 皖 马 抗 良 种)(78.6%)、江西 8 份(30.8%)和浙江 24 份(64.8%)种质材料。由表 8 可见：构建的 72 份抗性马尾松核心种质占 114 份原有种质的 63.16%，其 Na均值、Ne均值、I 均值分别占原有种质相应遗传参数的 100.00%、95.67%和 94.96%。t 检验结果表明：列入研究的抗性马尾松种质与入选的核心种质的遗传多样性无显著差异(P0.05)，说明本研究基于 M 策略构建的抗性马尾松核心种质能充分代表列入研究的原抗性马尾松种质资源的遗传多样性，剔除了与 114 份原有表5马尾松各亚群遗传多样性水平Table5GeneticdiversityparametersforallpopulationsofresistantP.massoniana亚群样本量/份NaNeIHoHeF126.074.871.640.060.780.93249.576.481.880.080.780.91297.504.881.590.030.700.964913.437.142.160.060.850.93说明：Na.等位基因数；Ne.有效等位基因数；I.Shannons多样性指数；Ho.观测杂合度；He.期望杂合度；F.固定指数。表6基于微卫星数据的遗传变异分析Table6AnalysisofmolecularvariancefrommicrosatellitedatausingGenALEx变异来源自由度方差总和平均方差方差分量变异百分比/%P亚群间3184.86561.6220.957140.01亚群内1101216.32811.0585.323800.01FST0.143说明：FST为遗传分化系数。表7不同策略构建的核心种质遗传多样性指标比较Table7Comparisonsofgeneticdiversityindexofcorecollectionsconstructedbydifferenttactics构建方法种质数/份NaNeIHoHeFNmPIC原有种质1141155.541.510.060.640.910.660.90M策略721155.301.430.060.630.910.610.92随机取样策略791155.531.480.060.640.910.650.92说明：Na.等位基因数；Ne.有效等位基因数；Ho.观测杂合度；He.期望杂合度；PIC.多态性信息含量；I.Shannons 多样性指数；Fis.居群近交系数；F.固定指数；Nm.基因流。*P0.05，*P0.01。表872 份抗性马尾松核心种质与 114 份原有种质遗传多样性对比Table8Comparisonofgeneticdiversitybetween72coregermplasmand114originalgermplasmofresistantP.massoniana种质种质数/份NaNeIHoHeFNmPIC原有种质11425.295.541.510.060.640.910.660.90核心种质7225.295.301.430.060.630.910.610.92保留比例/%63.16100.0095.6794.96100.0098.1299.5792.54100.00t0.0000.6521.4280.0590.8260.0520.0140.152P1.0000.5250.1770.9530.4240.9600.9890.882说明：Na.等位基因数；Ne.有效等位基因数；Ho.观测杂合度；He.期望杂合度；PIC.多态信息含量；I.Shannons 多样性指数；Fis.居群近交系数；F.固定指数；Nm.基因流。第 41 卷第 1 期邓莉丽等：抗松材线虫病马尾松种质资源遗传多样性分析及核心种质构建73种质重复或亲缘关系较近的材料。PCoA 分析(图 5)显示：抗性马尾松核心种质均匀分布在整个马尾松种质资源中，表明本研究所构建的抗性马尾松核心种质具有很好的代表性。UPGMA 进化树(图 6)显示：72 份抗性马尾松可分为 3 个类群，其中类群的 11 份抗性马尾松种质全部位于亚群(91.7%)，类群的 30 份抗性马尾松种质全部位于亚群(61.2%)，类群的抗性马尾松种质 18 份位于亚群(75.0%)，其余 13 份位于亚群(44.8%)。结合结构分析可知：位于亚群中混杂有黄色和红色的核心种质与亚群中的核心种质聚为一个亚类，亚群中以黄色为主的核心种质聚为另一个亚类，但抗性马尾松核心种质的 UPGMA 聚类结果与列入研究的原有种质结构分析和 PCoA 分析结果基本一致，进一步对核心种质进行了确认。广西福建贵州安徽江西浙江类群类群类群图672 份抗性马尾松核心种质的 UPGMA 聚类图Figure6UPGMAclusteringmapof72samplesofresistantP.massoniana3讨论3.1抗松材线虫病马尾松种质资源遗传多样性及群体结构遗传多样性在生物育种工作中至关重要，是评价生物多样性的重要组成部分，物种的遗传多样性越高或遗传变异越丰富，其对环境变化的适应能力也就越强26。本研究利用 14 对SSR引物对经高强度人工接种松材线虫后存活下来的 103 份马尾松种质和安徽省林业科学研究院审定的 11 份高抗良种进行遗传多样性和群体结构分析。Na是衡量 SSR 位点多态性高低的重要指标，其中所有种质的平均 Na为8.17，高于沈敬理等27利用 SSR 分子标记技术对 131 个马尾松无性系的研究(Na=3.67)，可能是本研究主坐标 2主坐标 1原有种质核心种质图572 份核心种质与 114 份原有种质主坐标分析Figure5Principalcoordinateanalysisof72coregermplasmand114originalgermplasm74浙江农林大学学报2024 年 2 月 20 日选择的SSR引物具有较高多态性和基因分型检测手段不一样造成的。Ne、He、I 等是评价遗传多样性的重要指标。高景斌等28利用SCAR分子标记对抗性马尾松材料进行遗传多样性研究，其 Ne和 I 分别为1.51 和 0.46；YANG 等19运用 20 对SSR引物分析马尾松二代亲本种质的遗传多样性，其 Ne为 3.01，I 为 1.26，PIC为 0.89；董虹妤等18对选自马尾松第 2 代育种群体的 12 份马尾松材料运用 13 对SSR引物进行研究，其中 Na和 I 分别为 3.17 和 0.47。与上述研究结果相比，本研究所选择的 14 对SSR引物能有效用于检测马尾松的遗传多样性(Ne=5.54、He=0.64、I=1.51、PIC=0.90)，同时表明筛选获得的 103 份抗性马尾松种质和安徽省林业科学研究院审定的 11 份良种具有丰富的遗传多样性，在未来的抗性育种进程中具有很大的遗传增益潜力。Structure 结构分析、UPGMA 聚类分析和 PCoA 分析被广泛应用于推断植物的群体结构，但三者的统计原