肯尼亚拟盘多毛孢几丁质酶基因鉴定及表达分析.pdf

引文格式：隋文静，杨俊聪，范世昌，等.肯尼亚拟盘多毛孢几丁质酶基因鉴定及表达分析.西南林业大学学报（自然科JOURNAL OF SOUTHWEST FORESTRY UNIVERSITYJan.20242024年1月大Vol.44No.1南西报学学业第44卷林第1期DOI:10.11929/j.swfu.202210038学）,2 0 2 4,44(1):2 1-30.肯尼亚拟盘多毛孢几丁质酶基因鉴定及表达分析文静杨俊聪范世昌李明娇张琰卿李靖（西南林业大学生命科学学院，云南昆明6 50 2 33）摘要：利用生物信息学方法从重寄生肯尼亚拟盘多毛孢（Pestalotiopsiskenyana）PG 52 菌株基因组中挖掘几丁质酶基因并分析，通过检测锈孢子诱导不同时间段基因的表达情况筛选重寄生相关几丁质酶基因。结果表明：在PG52中共鉴定到2 0 个GH18家族和1个GH19家族几丁质酶基因，分子量38.0 17 7.2 kDa，理论pI值范围3.97 9.2 5；其中7 个有信号肽，13个定位在胞外。所有PGChns基因都含有GH18家族或GH19家族保守结构域；与木霉几丁质酶序列聚类分析显示，PG52含有7 个sgA、4个sgB、8 个sgC、1个sgD几丁质酶基因。锈孢子诱导下共18 个几丁质酶基因在转录组中被检测到表达，7 个基因在诱导2 4h时表达量最高，6 个基因在经诱导后持续下调表达，4个基因在诱导7 2 h时表达量最高。对6 个表达量高以及表达倍数高的基因进行RT-qPCR分析，所有基因均出现显著差异表达，并在诱导7 2 h时表达量最高。经诱导后上调表达的PGChns很可能在PG52菌株重寄生过程中发挥破坏锈孢子壁的作用，需要后续进一步验证。关键词：拟盘多毛孢；几丁质酶；重寄生；表达分析；实时荧光定量PCR中图分类号：S182文献标志码：A文章编号：2 0 95-1914(2 0 2 4)0 1-0 0 2 1-10Identification and Expression Analysis of the Chitinases Gene Familyin Pestalotiopsis kenyanaSui Wenjing,Yang Juncong,Fan Shichang,Li Mingjiao,Zhang Yanqing,Li Jing(College of Life Science,Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650233,China)Abstract:Bioinformatics methods were used to detect and analyze chitinase genes from the genome ofPestalotiopsis kenyana PG52.The chitinase genes related to mycoparasitism were screened by detecting the ex-pression of genes induced by aecidiospores at different time periods.Results showed the PG52 harbors 20 GH18family chitinase genes and a GH19 family gene with molecular weights of 38.0-177.2 kDa and theoretical pl of3.97-9.25,7 genes had signal peptides and 13 genes were located in extracellular.PGChns gene contained theconserved domains of the GH18 family or the GH19 family.Additionally clustering analysis with Trichodermaspp.showed that PGChns of GH18 family can be classified to 7 sgA,4 sgB,8 sgC,and 1 sgD chitinase genes.After rust spore induction,18 genes were differentially expressed,7 genes were most highly expressed at 24h in-duction,6 continuously down-regulated genes after induction,4 genes with most high expression after 72h induc-tion.Subsequently,6 genes with high expression or great fold change were selected for RT-qPCR,and the resultssuggested the highest expression level of dfferently expressed genes was observed after 72h induction.The up-regulated expression of PGChns after induction is likely to play a role in destroying the rust spore wall during the收稿日期：2 0 2 2-10-19；修回日期：2 0 2 3-0 2-14基金项目：云南省农业基础研究专项面上项目（2 0 2 10 1BD07001-056)资助；生物学质量工程项目（50 3190 10 6）资助。第1作者：隋文静（1998 一），女，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学。Email:。通信作者：李靖（197 8 一），女，博士，副教授，硕士生导师。研究方向：生物化学与分子生物学。Email:22第44卷西南林业大学学报reparasitization of PG52 strain,while the mechanism of its reparasitization action is not yet clear.Key words:Pestalotiopsis sp.;chitinase;hyperparasitization;expression analysis;RT-qPCR植物锈病在全球范围内危害严重，不仅造成农作物减产，还会影响园林植物的观赏价值1-2。对于植物病原菌的防治以化学制剂为主3，间作种植辅助4，但是这不但影响粮食安全也不利于提高产量。具有重寄生能力的真菌被发现能够抑制植物病原菌的生长，其中在病害的生物防治应用潜力成为一大热点，木霉属（Trichoderma）真菌可以通过多种作用方式抑制植物病原菌，在生物防治过程中发挥重要作用5-6，并且已经得到了广泛的研究和应用7。除木霉属真菌以外，盾壳霉（Coniothyriumminitans）、枝孢菌（Cla-dosporium sp.）和拟盘多毛孢（Pestalotiopsissp.）等真菌同样具有重寄生作用18-10，其中有关重寄生拟盘多毛孢的报道较少，有深入研究的价值。拟盘多毛孢属真菌生活方式多样，相关报道以其作为能够引起植物叶斑病的病原菌为主-13;此外王秀娜14对内生无花果拟盘多毛孢（Pestalotio-psisfici）基因组进行了初步分析并初次研究了次级代谢产物，说明了其产毒能力；Zhao等15从拟盘多毛孢中分离到5种化合物，其中的四氢苯并呋喃衍生物在高剂量下对肝癌HuH-7细胞有很强的抑制作用。李靖等16 从感病石楠（Photiniaglomerata）叶片的锈孢子堆分离得到具有重寄生能力的肯尼亚拟盘多毛孢（Pestalotiopsiskenyana）PG52菌株，其产生的毒性物质对锈孢子破坏作用显著17；Li等18 从Pestalotiopsis sp.cr013中分离到的聚酮类化合物，对癌细胞有明显毒性。几丁质酶（E.C.3.2.1.14）是一种糖苷水解酶（GH），能够催化水解真菌的细胞壁中的几丁质成分，与真菌生长过程的自溶、营养吸收和形态发生有关，也是生物防治重要方式之二19。重寄生木霉中有关chit42、c h it 33和chil8-5等几丁质酶基因的研究较为深人2 0-2 2；Deng等2 3报道了哈茨木霉（Trichoderma harzianum）中chit46在毕赤酵母（Pi c h i a p a s t o r i s）中过表达3h内的分解率高达80.5%，具有非常好的抑菌活性。在转基因烟草（Ni c o t i a n a t a b a c u m）中过表达哈茨木霉chit33和chit42基因，增强了烟草对植物病原体、盐度和重金属胁迫的耐受能力2 4，转几丁质酶基因的番茄（Lycopersicon esculentum）2 5和大豆（Gly-cine max）2 6 也同样获得了抗病能力。前期研究已经证实PG52菌株产生的毒素对锈菌（Aecidiumwenshanense）锈孢子有抑制作用2 7，初步推测与木霉菌重寄生机制有明显差异，但是关于该菌株中胞壁降解酶在重寄生过程中发挥的作用以及作用效果尚不清楚，具有一定的研究价值。本研究针对PG52中几丁质酶基因进行挖掘，利用生物信息学方法进行基本性质分析，结合转录组与实时荧光定量PCR（RT-q P-CR）筛选重寄生相关的几丁质酶基因，为拟盘多毛孢几丁质酶基因的功能研究以及拟盘多毛孢的生防潜力开发提供理论依据1材料与方法1.1供试菌株从西南林业大学校园内石楠叶锈病孢子堆分离出的1株重寄生真菌经鉴定为肯尼亚拟盘多毛孢（P.kenyana），编号为PG52（G e n e Ba n k：A SM1809259v1)161.2方法1.2.1几丁质酶基因挖掘参考Junges等2 8 的挖掘几丁质酶基因方法，通过组装数据以及注释的基因组数据，以GH18家族保守结构域（S/AxGG和DxxDxDxE）为模板进行几丁质酶基因挖掘，选择已报道的GH19家族几丁质酶基因（登录号：EOB14068.1）2 1为模板，将PG52菌株基因组的氨基酸序列分别在NCBI进行blastP比对；通过db-CAN网站（https:/bcb.unl.edu/dbCAN2/index.php）预测GH18和GH19家族基因，合并2 部分预测结果，删除重复序列，通过SMART（h t t p s:/s ma r t.embl.de/）2 9、Pf a m（h t t p:/p f a m.x f a m.o r g/）30 和CDD databases(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc-ture/cdd/wrpsb.cgi）网站进行结构域预测，筛选出含有GH18和GH19家族保守结构域的序列1.2.2几丁质酶基因理化性质预测对筛选得到的几丁质酶基因用ExPASy31中ProtParm工具（https:/www.psort.org/psortb/）在线预测编码蛋白的基本理化性质；用SignalP5.0(https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?Sig-nalP-5.0）32 预测信号肽位点，TMHMM（h t t p s:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）进行跨膜结构预测，使用WoLFPSORT（h t-tps:/wolfpsort.hgc.jp/）3进行亚细胞定位；Sompa(http:/npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?pa-23第1期隋文静等：肯尼亚拟盘多毛孢几丁质酶基因鉴定及表达分析ge=npsa sopma.html)34进行二级结构预测1.2.3几丁质酶基因结构、结构域预测和染色体定位根据华大基因公司提供的P.kennayaPG52基因组文件和注释文件，对几丁质酶基因结构进行可视化；用CDDdatabases和MEME（h t t p s:/meme-suite.org/meme/tools/meme）35 进行结构域和模块预测，使用TBtools36的Gene structures功能进行组合美化；根据PG52的基因位置文件使用TBtools的Gene distribution功能对PGChns进行染色体定位1.2.4GH18家族系统进化参考Junges等2 8、Goughenour等37 和Seidl等38-39对几丁质酶的分类方法，从NCBI数据库中下载木霉Trichoderma atrovirideIMI206040（G e n Ba n k:G CA _0 0 0 17 10 15.2）和 TrichodermavirensGv29-8（G e n Ba n k:G CA _0 2 0 6 47 6 35.1）的基因组文件。筛选出两株菌的几丁质酶序列，使用MEGA11.0软件40 与PGChns构建系统发育树，并用iTOL在线网站（https:/itol.embl.de/itol.cgi）4进行美化。1.2.5几丁质酶基因启动子顺式作用元件预测在基因组中提取2 1个PGChns基因上游2 0 0 0bp的序列，并通过在线预测网站Plantcare（h t t p s:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ht-ml/）进行启动子顺式作用元件预测。对预测结果进行统计，并筛选出病原菌诱导型以及重寄生相关的顺式作用元件，用TBtools软件进行绘图。1.3几丁质酶基因的诱导表达1.3.1样品制备参考梅超等42】处理锈孢子的方法制备锈孢子壁，在PDA培养基上活化PG52菌株后，接种在液体改良Fries培养基上，2 8，140 r/min培养48h，用2.5g/L的锈孢子诱导0、2 4、48、7 2 h，收集菌丝体用液氮速冻备用。取样后进行转录组测序，测序比对全过程由百迈客生物科技有限公司完成。1.3.2文库构建与上机测序取出4个不同时间段的样品菌丝，采用天根RNA提取试剂盒对总RNA进行提取，用Nano-Drop2000分光光度计（赛默飞，美国）检测RNA的浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，利用Agilent2100生物分析仪（安捷伦，美国）测定RIN值。单次建库的标准为RNA总量1g，浓度50 ng/L，O D 2 6 0/2 8 0 介于1.8 2.2 之间。将符合要求的总RNA利用Aid-lab公司反转录试剂盒（TUREscript1stStandcDNASYNTHESIS Kit）合成cDNA，构建cDNA文库。样品检测合格后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度（文库有效浓度 2 nM）进行准确定量。库检合格后，不同文库按照目标下机数据量进行汇集，用Illumina平台测序仪（因美纳，美国）进行测序。1.3.3转录组数据与参考基因组序列比对利用HISAT2系统对RNA测序实验的读长进行高效比对；利用StringTie对比对上的reads进行组装，比对分析完成后利用StringTie对比对上的Reads进行组装和定量，通过最大流量算法，采用每千碱基转录本的片段数百万映射的片段（FPK M）作为衡量转录本或基因表达水平的指标。将PGChns在转录组的FPKM结果取log2归一化，用TBtools软件的Heatmep功能进行分析。筛选出部分表达量较高或表达倍数差异较大的PGChns进行RT-qPCR反应，以cDNA为模板，肌动蛋白（Actin）为内参基因，用PrimerPremier5软件设计引物，见表1。相对定量的计算采用2-ACt方法，用SPSS26.0软件对数据进行单因素方差分析。表1RT-qPCR引物信息Table1Primer information of RT-qPCR基因序号引物序列53Actin-FAGATCATTGCTCCTCCTGActin-RCACATTTGCTGGAAGGTCPGChn1-FCCAGTCCAACCTGTATCCPGChn-RGCGACGTGTAGTAATCCAPGChn5-FGTCACCAAGATCGTCAACPGChn5-RAATGGCGGTATTTGTCTGPGChn9-FATCAGTACGTTGTCAATGGTPGChn9-RCATAGTTCATGGTTGTTGGCPGChn10-FTTCACTACACAAGTCGTCPGChn10-RCTTGACAGCTTCATTGATGPGChn14-FCATATCGGCGACAGATCAPGChn14-RGCGGTGAATTTGGAACAGPGChn15-FTGTTAGCCTCATCCTAAGGPGChn15-RACATCATACGGATTGCCT2结果与分析2.1几丁质酶基因基本性质预测结果通过筛选，PG52中共有2 1个几丁质酶基因，PGChnlPGChn20（G e n e Ba n k：O N0 0 92 96 24西南林业大学学报第44卷ON009315）、和 PGChnGH19（G e n e Ba n k：O N0 09316）已上传到NCBI数据库。表2 中2 0 个GH18家族几丁质酶基因，编码蛋白长度在3511600aa；分子量大小在38.0 17 7.2 kDa；pI值范围3.97 9.2 5，只有PGChn17和PGChn20两个碱性蛋白；PGChnGH19分子量为2 6.9kDa，pI值为5.2 5。共7 个几丁质酶有信号肽位点；有13个胞外蛋白，5个线粒体蛋白，PGChn7为核蛋白，PGChn11为过氧化物酶体，PGChnGH19是胞质蛋白，PGChn4、PG Ch 2 0 和PGChnGH19均有1个跨膜区域；PGChns二级结构以无规则卷曲和-螺旋或延伸链为主。对PG52几丁质酶基因在NCBI数据库进行比对，共匹配到11个物种，其中16 条基因序列与Pestalotiopsissp.相似性高，8 条基因序列与Neopestalotiopsissp.相似性高。表2 PGChns 理化性质、信号肽、亚细胞定位、二级结构及跨膜结构预测Table 2Physicochemical properties,signal peptides,subcellular localization,secondary structure andprediction of transmembrane structure of PGChns氨基酸分子量/亚细胞-螺旋延伸链-转角无规则卷曲跨膜序列编号数目kDapI信号肽定位占比/%占比/%占比/%占比/%区域PGChn140244.65.25extr32.3415.425.2247.01PGChn240844.34.61extr33.3315.25.6445.83PGChn340243.86.75mito29.3517.166.9746.52PGChn435538.86.36mito32.3915.775.0746.76PGChn51186130.26.08mito56.917.763.232.12PGChn61026110.64.49+extr32.3615.49.1643.08PGChn71544168.84.21nucl20.1421.055.0553.76PGChn81147124.14.72+extr26.4216.045.1452.4PGChn91173129.54.81extr24.0417.224.7753.96PGChn101600177.24.57extr27.6214.813.6253.94PGChn111050113.46.17+pero25.8116.15.0553.05PGChn1244147.04.37+extr33.7914.974.9946.26PGChn131272135.53.97+extr24.7619.55.6650.08PGChn1439343.54.96+extr39.1914.256.8739.69523PGChn1585191.94.36+extr30.222.449.5237.84PGChn1635138.04.54mito32.4818.236.5542.74PGChn171420150.07.83mito21.8318.879.0150.28PGChn1846648.85.55+extr25.1118.454.7251.72PGChn1934738.74.51+extr42.0717.588.3631.99PGChn20909100.58.52+extr37.0719.588.6934.65726PGChnGH1940244.65.25cyto43.9815.357.8832.78206225注：extr：胞外，mito：线粒体，nucl：细胞核，pero：过氧化物酶体，cyto：细胞质。2.2几丁质酶结构域预测及染色体定位2.2.1几丁质酶结构域预测对几丁质酶结构域预测结果见图1，PG52的GH19家族序列PGChnGH19含有1个不完整结构域，其他所有GH18家族序列均含糖苷水解酶18家族结构域，此外还有11种特殊功能域，其中Vps54-N结构域只存在于PGChn5，Ly s M（l y s i n l mo t i f）结构域只存在于PGChn13，H c e 2只存在于 PGChn15，D A O、C BM _4_9、f7 n 3这3个结构域只存在于PGChn17，CBM _1只存在于PGChn18，说明PG52中的基因的多样性。大多序列的GH18结构域靠近N端，PGChn13和PGChn17的保守区域更靠近C端。所有几丁质酶序列基本都含底物结合域S/AxGG和催化域DxxDxDxE这两个基序，但是PGChn18和PGChn20缺失底物结合域，PGChn16、PG Ch n 19和PGChn17缺失25第1期隋文静等：肯尼亚拟盘多毛孢几丁质酶基因鉴定及表达分析催化域，PGChn15缺失这2 个基序，但是在CDD和Pfam预测中均有预测到保守结构域，可能是由于网站不同预测方式导致的差异。PG52中有4个基因只有外显子，7 个基因含有10 个及以上的外显子，其中PGChn7和PGChn10含有的外显子高达15个以上。Motif!Motif5Motif2Motif3Motif4GH18_chitinase_D-likeDAOCBM_4_9FN3GH18_chitinase-likeCBM1Glyco_18Vps53NGH18_chitinaseGlyco_hydro_18Chitin_bind_iChtBDIHHDNase_NucA_NucB1ChtBDI_GHI8_1HHGH18_zymocin_alphaHLysMChtBD1IHHHce2CDSHIHH353530300600900120015001800030060090012001500180001000200030004000500060007000Motifl:DDDE,Motif5:A/SGG图1PG52几丁质酶蛋白序列聚类分析、蛋白基序、结构域及基因结构预测Fig.1Phylogentic tree,protein motifs,structural domain and gene structure prediction of chitinase from PG522.2.2几丁质酶基因染色体定位分析对PG52菌株中几丁质酶基因进行染色体定位结果见图2，该菌株中几丁质酶基因不均匀的分布在9 条染色体上，其中在tig5、t i g 7 和tig58928上均有4个几丁质酶基因。9 条染色体下端均有几丁质酶基因分布，其中唯一的GH19家族基因位于tig89号染色体上。共有2 对基因出现了串联重复现象，分别是PGChn6、PG Ch n 15和PGChn10、PGChnll。6881-0MbPGChnGHI9-PGChn17PGChn2-PGChn71Mb-PGChn162Mb-PGChn18-PGChn12-PGChn193Mb-PGChn481814Mb-PGChn8PGChn3PGChn135Mb-PGChn20-PGChn9PGChnoPGChnl56Mb-7MbPGChnsPGChn14-8MbPGChnllPGChnio-9Mb图2PGChns几丁质酶基因在染色体上的分布Fig.2Distribution of PGChns on chromosomes2.3GH18家族序列系统进化分析PG52中几丁质酶基因数目少于木霉菌，图3中3株菌的几丁质酶一共可以被分为A、B、C、D亚类，除B-I和C-II分支外，PG52与木霉中几丁质酶序列在其余各分支中的数目基本相同。sgA中PGChn12和PGChn14属于A-IIPGChn4和PGChn5属于A-IV，PG Ch n 1-PG Ch n 3属于A-V；其中含有信号肽属于在A-I，不含信号肽的位于A-IV和A-V分支，分别含有结构域Glyco_hydro_18、Glyco_18和GH18_chitinase。PGChn16和PGChn19处于B-II分支，分子量在3045kDa，含有GH18_CTS3_chitinase结构域；PGChn18和PGChn20处于B-V分支，含有GH18hevamine_XipI_class_II结构域，此外PGChn18还有1个C端CBM_1结构域，PGChn20在C端含有1段富含丝氨酸或苏氨酸的长序列，均符合sgB的结构特征。sgC的几丁质酶分子量通常在140 170 kDa，PG Ch n 6-PG Ch n 11和 PGChn13、PGChn15处于同一分支，属于C亚类，其中PGChn6PG Ch n 11均含有Glyco_18结构域，属26第44卷西南林业大学学报于C-I类，PGChn13和PGChn15含有GH18zymocin_alpha结构域，并且含有N端信号肽属于C-II类。只有PGChn17含有GH18_chitinaseD-like结构域，属于sgD，两株木霉中也分别有1个sgD序列。xP013938133.1TatrovirideXP013959919.1T.virensColored rangesXP-013938925.1T.aXP013953355.1T.virensDB-IxP013943685.1 T.atrovideXP 013955725.1TB-VPGChn4XP-013960884.1T.vrensB-IIPGChn3-PGChn5XP013957935.1 T.vrensatroviride-一C-IIXP013942383.1T.atroviridevirens-C-IPGChn2-A-VPGChngA-IVPGChn-XP013957352.1T.virensXP013940437.1T.atroviridexP013945501.1T.atrovirideA-IIPGChn10XP013954420.1T.virensXP013955954.1T.virensXP013940502.1T.atrovirideXP013957399.1T.virensPGChn17-XP013941793.1T.atrovirideXP013946025.1TatrovirideXP013944966.1T.atrovirideXP013942648.1TatrovirideXP013956215.1T.virensXP013947532.1T.atrovirideXP013958236.17.virensPGChn7XP013945500.1T.atrovirideXP013944997.1T.atrovirdtePGChn.11XP013955444.1T.virensPGChn8PGChn15XP013944580.1.T.atroviridePGChn13XP013951890.1T.virensxP013949290.1T.atrovirideXPP013955834.1T.virensXP0139540B4.1,T.virensdP013953228.1T.vrensXP013947509.1T.atrovinidleXP023955043.17.vifenXP013957394.1T.virensXP013951909.1T.virensxP 013961717.1T.virensXP013946040.1T.aP013953451.1T.vitensP013941339.1T.aXP-013949278:1T.arovicdxP013945551.1T.atrovideXP013951565.1T.virensPGChn20XP013958614.1T.virensXP013961002.1T.viren.virensT.atrovide图3P.kenayaPG52、T.a t r o v i r i d e 和T.virens中GH18家族成员系统发育树Fig.3Phylogenetic tree of GH18 family of P.kenyana PG52,T.atroviride and T.virens2.4几丁质酶基因顺式作用元件分析PGChns上游含有大量顺式作用元件，由图4可见，这些基因除了含有CAAT-box和TATA-box等基本顺式作用元件之外，W-box、G-b o x、as-1、M YC、G-b o x、A BR E、M BS、M YB、TGACG-motif、C G T C A-m o t if 等应答病原菌和参与防御反应的顺式作用元件出现明显富集；此外还含有大量环境信号因子响应元件，因此环境胁迫和病原菌侵染都可能影响几丁质酶基因的表达。图5中，所有PGChns上游均含有MYB相关启动子，因此推测MYB转录因子基因可能在几丁质酶基因表达过程中起到重要调控作用。34423611。6 6。111PGChn!2411212。1121122PGChn22316312441。114144。212。11PGChn331432201212223。210PGChn418463121。4122。1。111PGChnS233388326413313。122PGChng15271。61。111115523。121PGChn1629430110523322131PGChn81652915421904。3。2111PCChng22124934222212232111PGChno131131312222331211PCChnli12223851111352143101PGChn122 31。611111。1111PGChn132948711227 7。301PGChn141810311。24412144。1。111PCChni328647591004119 92001021PGChni211。9101011010141PGChniz28678431141331。10PGChn18313331。342。11322。21。131PGChn19251174133121211341124PGChn20324281221422。1212221PGChnGH19RCiteotifEREoreO+ifmotifotifotifYAT-boxATA-boMYBE-boxG-boxA-motifas-1T-boxC-motiC1-boxmotifGmotifA-mot-coreWboxCT-mCGT1-moGnrepeatsUN-motiOREGc-motiAGATA-WUIGCNCTGA-elemeTC-rich r图4主要顺式作用元件统计图Fig.4Statistical map of major cis-acting elements of PGChns27第1期隋文静等：肯尼亚拟盘多毛孢几丁质酶基因鉴定及表达分析PGChnlMYBPGChn3G-boxPGChn4TGACG-motifPGChn5CGTCA-motifPGChn6MBSPGChn7ABREPGChn8as-1PGChn9MYCPGChn10G-BoxPGChnllWboxPGChn12PGChn13PGChn14PGChn15PGChn16PGChn17PGChn18PGChn19PGChn2PGChn20PGChnGH1950200400600800100012001400160018002000图5PGChns响应真菌相关顺式作用元件预测Fig.5Prediction of cis-acting elements associated with responsive fungi of PGChns2.5几丁质酶基因表达分析PG52菌株中的2 1个几丁质酶基因共有18 个在转录组中检测到表达，其中PGChn2、PG Ch n 17和PGChnGH19未检测到表达；PGChn1的表达量最高在诱导7 2 h后FPKM值高达10 8 8.7；其次是PGChn14，在诱导2 4h后FPKM达到峰值35.0。由图6 可见，经锈孢子壁诱导后，18 个几丁质酶基因在诱导0 7 2 h之间出现了表达差异，其中PGChn3、PG Ch n 5、PG Ch n 7、PG Ch n 13、PGChn14、PG C h n 15和PGChn18共7 个基因在024h内上调表达，之后又下调表达至比未经诱导时更低，这些基因可能在侵染锈菌的前期发挥作用；PGChn4、PG Ch n 6、PG Ch n 12、PG Ch n 16、PGChn19和PGChn20共6 个基因在0 7 2 h内下调表达，可能在锈菌诱导下受碳源变化影响诱导其低表达，PGChn1、PG Ch n 8、PG Ch n 9 和PGChn11在4872h内上调表达，说明其在前期可能受到抑制，在侵染后期才发挥作用。筛选出6 个表达量高或表达差异倍数较大的基因进行RT-qPCR验证，6 个PGChns的表达趋势与转录组结果存在一定差异。由图7 可见所有几丁质酶基因在添加锈孢子后的48 h表达显著上调，在7 2 h时表达量最高，呈现出诱导表达趋势。6 个PGChns在诱导后的7 2 h均出现显著上调表达，其中PGChn5和PGChn10分别上调到7.46倍和6.41倍。T1.50.67-0.53-1.141.00PGChnll-1.07-0.00-0.261.34PGChn8F1.0-0.65-0.880.201.33PGChnl0.5-0.18-1.02-0.171.37PGChn90-1.040.740.97-0.67PGChn100.50.381.11-0.23-1.26PGChn51.00.361.03-0.04-1.35PGChn141.50.041.39-0.61-0.83PGChn30.361.24-0.63-0.97PGChn150.651.05-0.78-0.92PGChn130.591.04-0.48-1.15PGChn70.641.04-0.61-1.07PGChn180.960.76-0.75-0.97PGChn61.230.35-0.52-1.05PGChn121.140.52-0.66-1.00PGChn41.210.43-0.70-0.93PGChn161.220.29-1.14-0.37PGChn191.4.1-0.01-0.58-0.82PGChn200h24h48h72h图6锈孢子诱导下PG52中GH18家族基因表达Fig.6 Expression results of GH18 family genes ofP.kenyana PG