荧光定量PCR检测技术.ppt

荧光定量荧光定量PCRPCR检测技术检测技术（FQ-PCR,Fluorescence quantitative PCR）.实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术技术n所谓所谓real-time FQ-PCR技术，是指技术，是指在在PCR反应体系中加入荧光基因，利反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个用荧光信号累积实时监测整个PCR进进程，最后通过标准曲线对未知模板进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。行定量分析的方法。.n是一种完全闭管式的是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂和荧光探针杂交技术相结合的定量交技术相结合的定量PCR方法。方法。n PCR的高效扩增特性的高效扩增特性n 核酸探针的高特异性核酸探针的高特异性n 光谱技术的高灵敏性和可计量性光谱技术的高灵敏性和可计量性.实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRn定义定义利用荧光信号对利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控反应的过程进行实时监控n目的目的对起始模板进行定量对起始模板进行定量l优点优点 灵敏，重复性，动态范围宽，高通量灵敏，重复性，动态范围宽，高通量l原理原理 Ct 值与起始模板浓度的对数成比例值与起始模板浓度的对数成比例.实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理nPCR反应过程中产生的反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。平台期。n在传统的在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此反应的最终扩增产物，因此用此终点法对用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。产物定量存在不可靠之处。.利用电泳定量利用电泳定量11,500 counts/5200 counts=2.2 fold difference.实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理n在在real-time Q-PCR中，对整个中，对整个PCR反反应扩增过程进行了实时的监测和连续地应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。以绘制成一条曲线。.实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理n在在PCR反应早期，产生荧光的水平不能反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，与背景明显地区别，而后荧光的产生进而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期入指数期、线性期和最终的平台期，因因此可以在此可以在PCR反应处于指数期的某一点反应处于指数期的某一点 上来检测上来检测PCR产物的量，并且由此来推产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。断模板最初的含量。.实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理n为了便于对所检测样本进行比较，在为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值域值（threshold）。）。n以以PCR反应的前反应的前15个循环的荧光信号作为个循环的荧光信号作为荧光本底荧光本底信号信号（baseline），），荧光域值的缺省设置是荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。倍。nthreshold=10´SDcycle 6-15.实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理n如果检测到荧光信号超过域值被认为是如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的真正的信号，它可用于定义样本的域值域值循环数（循环数（Ct）。）。nCt值的含义是：值的含义是：n每个反应管内的荧光信号达到设定的域每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。值时所经历的循环数。.什么是什么是C(t)C(t)值值C(t)Threshold（域值）（域值）.为什么要引入为什么要引入C(t)C(t)值值CtEndpoints96 replicates of B7 gene molecular beacon.实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理n研究表明，研究表明，每个模板的每个模板的Ct值与该模值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，系，起始拷贝数越多，Ct值越小。值越小。.实时荧光定量实时荧光定量Ct 18 and Ct 22,2(4 Ct shift)=16 fold difference.实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理n利用已知起始拷贝数的标准品可作出利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代数的对数，纵坐标代Ct值。值。因此只要因此只要获得未知样品的获得未知样品的Ct值，即可从标准曲值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数线上计算出该样品的起始拷贝数。.如何定量如何定量标标 准准 曲曲 线线 未知样品的未知样品的C(t)值值 定量定量.荧光化学荧光化学n荧光定量荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为所使用的荧光化学可分为两种：两种：荧光探针和荧光染料荧光探针和荧光染料。n荧光探针荧光探针：TaqMan荧光探针荧光探针 n荧光染料荧光染料：SYBR荧光染料荧光染料.一、一、TaqMan检测技术检测技术原理原理nPCR扩增时在扩增时在加入一对引物加入一对引物的同时的同时加入加入一个特异性的荧光探针一个特异性的荧光探针，该探针为一寡，该探针为一寡核苷酸，核苷酸，与扩增片断内部某一段系列相与扩增片断内部某一段系列相同或互补同或互补，两端分别标记一个，两端分别标记一个报告荧光报告荧光基团基团和一个和一个淬灭荧光基团淬灭荧光基团。.n探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收基团吸收；PCR扩增时，扩增时，Taq酶的酶的53外切酶外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号光信号，即每扩增一条，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物产物形成完全同步。形成完全同步。.TaqMan检测技术检测技术原理示意图原理示意图nPCR扩增前扩增前nPCR扩增时扩增时上游引物上游引物完好探针完好探针DNA合成合成荧荧光光物物质质荧荧光光淬淬灭灭物物质质探针水解，释放荧光探针水解，释放荧光模板负链模板负链.TaqMan 探针未结合的探针未结合的探针探针、引物与目的片段结合，探针、引物与目的片段结合，FRET光发射或者以热量形式散失光发射或者以热量形式散失Donor dye(Reporter)Acceptor dye(Quencher)LightEnergy transferTaqTaq 水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离TaqLight EmissionLight.TaqManTaqMan检测技术的设计检测技术的设计n与普通与普通PCR的设计基本相同，区别的设计基本相同，区别在于引物与探针的设计一般需要特在于引物与探针的设计一般需要特定的软件，如美国定的软件，如美国ABI公司开发的公司开发的Primer Express软件。软件。.（一）选择靶基因（一）选择靶基因nTaqMan技术主要用于检测，所以其扩增技术主要用于检测，所以其扩增的基因必须是特异的，如：的基因必须是特异的，如：n某种病原微生物所共有的保守基因某种病原微生物所共有的保守基因 （检测某种病原微生物检测某种病原微生物）；）；n某个血清型所特有的基因序列某个血清型所特有的基因序列 （区分检测某个血清型区分检测某个血清型）；）；n选择决定毒力强弱的基因选择决定毒力强弱的基因 （区分强毒和弱毒区分强毒和弱毒）等。）等。.（二）选择探针（二）选择探针n选择探针需要同时满足以下条件：选择探针需要同时满足以下条件：1、在靶基因的保守区域、在靶基因的保守区域2、G+C含量在含量在40%以上；以上；3、相同碱基连续不超过、相同碱基连续不超过4个；个；4、Tm值在值在712;.（二）选择探针（二）选择探针5、内部自身配对较少；、内部自身配对较少；6、5端不为端不为G；7、G数目比数目比C数目少；数目少；如果如果6和和7难以满足的时候，就要考难以满足的时候，就要考虑用虑用互补序列互补序列作探针。作探针。.（三）选择引物（三）选择引物n探针选好之后，在探针的上下游分别选择探针选好之后，在探针的上下游分别选择合适的引物序列，引物应满足如下的条件合适的引物序列，引物应满足如下的条件:n1、在靶基因保守和无二级结构的区域；、在靶基因保守和无二级结构的区域；n2、与探针所在区域不重叠；、与探针所在区域不重叠；.（三）选择引物（三）选择引物n3、与靶基因其他区域配对较少；、与靶基因其他区域配对较少；n4、G+C含量在含量在40%以上；以上；n5、相同碱基连续不超过、相同碱基连续不超过4个；个；n6、Tm值比探针值比探针Tm值低值低101;.（三）选择引物（三）选择引物n7、探针与两条引物之间的各种组合形成、探针与两条引物之间的各种组合形成的二聚体都较少，特别是引物的二聚体都较少，特别是引物3端与探针端与探针配对很少；配对很少；n8、PCR扩增片断在扩增片断在70250个碱基之间。个碱基之间。n如果找不到合适的引物，可调整探针（向如果找不到合适的引物，可调整探针（向前或向后）的序列，或重新选择一个探针，前或向后）的序列，或重新选择一个探针，再寻找合适的引物。再寻找合适的引物。.普通普通PCR临床检测技术的缺点临床检测技术的缺点普通普通PCR临床检测技术虽然解决了检临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。性率高，不能正确指导临床实践。因此国家卫生部曾在因此国家卫生部曾在1997年行文禁年行文禁止将普通止将普通PCR技术用于临床诊断。技术用于临床诊断。.n1、采采用用闭闭管管检检测测，不不需需PCR后后处处理理，并并采采用用dUTP-UNG酶酶的的防防污污染染系系统统，扩扩增增和和检检测测一一次次同同时时完完成成。不不需需开开盖盖，不不产生污染，避免了假阳性。产生污染，避免了假阳性。FQ-PCR与普通与普通PCR的区别的区别.n2、探探针针与与被被检检DNA序序列列特特异异杂杂交交，增强了特异性。增强了特异性。nA、上下游引物和探针三道关卡控制其、上下游引物和探针三道关卡控制其特异性；特异性；nB、引物和探针都比较长，退火温度较、引物和探针都比较长，退火温度较高，非特异性扩增几率减少。高，非特异性扩增几率减少。FQ-PCR与普通与普通PCR的区别的区别.3、可可定定量量结结果果，准准确确灵灵敏敏地地反反应应了了病原体的感染和治疗恢复情况。病原体的感染和治疗恢复情况。FQ-PCR与普通与普通PCR的区别的区别.FQ-PCR与普通与普通PCR的区别的区别n4、光谱分析仪直读结果，自动分析，、光谱分析仪直读结果，自动分析，增强了增强了灵敏性和客观性。灵敏性和客观性。能够实时检测能够实时检测，即一边，即一边PCR，一边检测，一边检测PCR的结果，而不需要在的结果，而不需要在PCR结束结束之后进行核酸电泳来显示之后进行核酸电泳来显示PCR反应的结果，反应的结果，（因此实时荧光因此实时荧光PCR检测技术操作更简单；也检测技术操作更简单；也避免了核酸电泳非常难以回避的化学污染和核避免了核酸电泳非常难以回避的化学污染和核酸污染等严重问题酸污染等严重问题）；）；.FQ-PCR与普通与普通PCR的区别的区别n5、可以多重检测。、可以多重检测。n如果检测两种以上的基因片断，可以对各个如果检测两种以上的基因片断，可以对各个基因分别设计探针和引物，在不同的反应管基因分别设计探针和引物，在不同的反应管中进行中进行TaqMan检测，或者将各自的探针分检测，或者将各自的探针分别标记不同的荧光信号，在同一个反应体系别标记不同的荧光信号，在同一个反应体系中检测多个基因片断。中检测多个基因片断。.二、二、SYBRSYBR荧光染料原理荧光染料原理n在在PCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBR荧荧光染料，光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的链中的SYBR染料分子不会发射任何荧染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。产物的增加完全同步。.ssDNA=free dye(weak fluorophore)dsDNA=Binds minor groove(intense fluorophore)SYBR Green I(双链双链DNA结合染料结合染料).人医现所开展的检测项目人医现所开展的检测项目n乙肝病毒乙肝病毒（HBV）荧光定量）荧光定量PCR检测检测 n丙肝病毒丙肝病毒（HCV）荧光定量）荧光定量PCR检测检测n淋球菌淋球菌（NG）荧光定量）荧光定量PCR检测检测n沙眼衣原体（沙眼衣原体（CT）荧光定量荧光定量PCR检测检测n解脲支原体（解脲支原体（UU）荧光定量荧光定量PCR检测检测n结核分支杆菌（结核分支杆菌（TB）荧光定量荧光定量PCR检测检测.兽医现所开展的检测项目兽医现所开展的检测项目n禽流感病毒禽流感病毒（ALV）荧光定量）荧光定量PCR检测检测 n新城疫病毒新城疫病毒（NDV）荧光定量）荧光定量PCR检测检测n蓝耳病病毒（蓝耳病病毒（PRRSV）荧光定）荧光定量量PCR检测检测.