实时荧光定量PCR实验结果分析.ppt

实时荧光定量PCR实验结果分析邓椋爻 技术支持广州市昊洋贸易有限公司u定量分析绝对定量相对定量定量定量PCR应用应用u定性分析SNP分析，基因扫描阴阳性判定熔解曲线分析绝对定量：How Many优点：给出目标基因初始模板的绝对数量，数据容易处理缺点：必须有标准品，做标准曲线应用：病毒拷贝数；转基因的拷贝数；转基因成分百分含量检测绝对定量与相对定量相对定量:How Much 优点：需要/不需要标准品；使用广泛缺点：数据理解困难应用：差异表达分析；芯片评估14500 copies108106102104绝对定量108106102104T绝对定量绝对定量108106102104T绝对定量105 copies/well绝对定量1/3Blank1/31/31/31.11 ng/2ul0.37 ng/2ul0.12 ng/2ul10.0 ng/2ul3.33 ng/2ul相对定量TControl CT=21.3Sample A CT=22.8Sample B CT=19.3 相对定量Control CT=21.3 =1.5ng/tube 1Sample A CT=22.8 =0.5ng/tube 0.33Sample B CT=19.3 =6.0ng/tube 4Fold相对定量相对定量数据处理管家基因校准(Normalization Gene)得出每个细胞中的目的基因目标基因vs.管家基因对照样品校准(Calibrator Sample)得出相对于某个样品的基因表达量,1X sample.处理的vs.未处理的，6hr vs.0 hr,病理vs.正常.目标基因管家基因处理后处理前ERBB2GAPDHSampleCalibrator按比例稀释标准品，根据标准曲线确定样本初始模板浓度至少需要两个标准曲线GOIreference gene标准曲线确定反应扩增效率相相相相对对定量定量定量定量标标准曲准曲准曲准曲线线相对定量相对定量：CT法依据：平均相对含量%=2 平均CT数据处理：C（t）GOI-C（t）ref=C（t）C（t）sample-C（t）calibrator=C（t）好处：不做标准曲线应用范围：扩增效率较高，目标基因和内标基因扩增效率一致并且相互独立扩增；不做标准曲线，高通量检测（芯片评估）；不要求很高的精度应用实例应用实例-基因表达分析基因表达分析 利用TaqMan技术研究ERBB2 在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异实验设计流程实验设计流程RNA提取RT-qPCR实验结果分析RNA定量反转录(RT)设计qPCR实验方法Aurum Total RNA kitiScript cDNA Synthesis Kit材料和方法材料和方法已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因 FAM标记的ERBB2探针 VIC标记的GAPDH探针标准品（质粒）构造标准曲线多重PCR反应阴性对照 无RNA对照（空白）无逆转录酶对照（监控基因组污染）RNA定性及定量分析定性及定量分析Experion RNA StdSens Chip5-500 ng/ml100-6,000 ntExperion RNA HighSens Chip0.1-5 ng/ml100-6,000 nt乳癌组织 RNA正常乳腺组织 RNA5 hr.at 90CIntactIntact7 hr.at 90CIntact7 hr.degradationGAPDH geneIntact5 hr.degradation一步法两步法一步法两步法在不同的反应管中运行RT&PCR1.反转录反应 加热灭活反转酶2.PCR 反应2.PCR 反应1.反转录反应1.25C 5 min2.42C 30 min3.85C 5 min 4.冷却至4C iScript cDNA Synthesis Kit设计设计qPCR实验方法实验方法1.定性条件摸索2.荧光化学物质SYBR GREEN染料Taqman探针3.定量PCR条件优化4.单双通道相互验证qFam标记目标基因探针qVIC标记看家基因探针动态温度梯度动态温度梯度5-6oC Below10oC AbovePCR优化优化-温度确定温度确定预设退火温度预设退火温度PCR优化优化-熔解曲线熔解曲线Real annealing range PCR优化优化-扩增曲线扩增曲线RT-qPCR实验实验95C,15min94C,15sec60C,1minplate readgo to step 3,39 more times10C,foreverEnd目标基因：未知样品生成标准曲线：标准品梯度监控系统故障：阳性对照监控污染：阴性对照/基因组对照校准生物学误差：看家基因降低其余误差：重复实验结果分析结果分析-绝对曲线绝对曲线Color 2-VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2结果分析结果分析-单双通道相互验证单双通道相互验证ERBB2单双通道相互验证的实验结果A.Multiplex ReactionsHealthy RNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65 0.1526.80 0.32B.Singleplex reactionsHealthy RNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70 0.0326.82 0.24结果分析结果分析-扩增曲线扩增曲线样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAM detection-ERBB2PMT2-VIC detection-GAPDH肿瘤肿瘤正常HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copies ng/l Total RNAERBB2 copies/GAPDH copies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.0197Healthy RNATumor RNA0.0110.0180.018/0.0111.63HealthyTissueCarc.TissueRelative Expression00.20.40.60.811.21.41.61.82结果计算结果计算-双标准曲线双标准曲线结果计算结果计算-2-c(t)法法C(t)=4.41-5.18=-0.770.182-c(t)=1.511.93结果与双标准曲线法相近结果与双标准曲线法相近Healthy RNABBER2GAPDHC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43 0.0423.34 0.105.180.18Carcinoma RNABBER2GAPDHC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2627.24 0.1722.83 0.034.41 0.21