链霉菌SS9-1发酵条件优化及其对番茄灰霉病的防治效果研究.pdf

40(1)126-136 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2024 年 2 月 收稿日期：2023-06-14 基金项目：甘肃省科学院青年基金项目（2021QN-01）；甘肃省重点人才项目（G2023-3）作者简介：付麟雲，硕士研究生，助理研究员，E-mail：；*通信作者，研究员，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2024.02.004 链霉菌SS9-1发酵条件优化及其对番茄灰霉病的防治效果研究 付麟雲，李 晶，李 娜，刘锦霞*，丁 品，聂垚琰，武建荣，杨 成（甘肃省科学院生物研究所，兰州 730000）摘要：本实验室前期从铁棒锤根际土壤样品中分离到一株高加索链霉菌 Streptomyces ciscaucasicus SS9-1，抗菌活性试验发现其对番茄灰霉病原菌灰葡萄孢 Botrytis cinerea 具有较好的抑制作用。为进一步提高其对番茄灰霉病的抑菌效果，采用单因素试验、正交试验对 SS9-1 进行发酵培养基配方和发酵条件优化，并对其发酵滤液进行了番茄灰霉病的抑菌作用试验及盆栽防治效果试验。结果表明，菌株 SS9-1 最佳发酵配方为：可溶性淀粉 4%、KNO3 1%、酵母浸粉 0.25%、NaCl 0.2%、MnCl24H2O 0.002%；最佳发酵条件为：装液量 150 mL、接种量 3%、初始 pH 8.0、发酵温度 28、发酵时间 7 d。平板对峙试验发现，番茄灰霉病菌丝受发酵滤液影响后，出现膨大畸变现象；菌株 SS9-1 对番茄灰霉菌孢子的萌发也具有很强的抑制作用，处理 12、24 h 后萌发抑制率分别为 97.83%和 96.07%。盆栽试验中，菌株 SS9-1 发酵滤液原液防治效果达到了 98.43%，明显高于药剂对照 40%嘧霉胺 SC 500 倍稀释液；发酵滤液稀释 50 倍后防治效果依然达 71.11%。综上，菌株 SS9-1 对番茄灰霉病具有很好的生物防治效果，具有作为生防制剂的应用价值和潜力。关 键 词：链霉菌；番茄灰霉病；发酵条件优化；生物防治 中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2024)01-0126-11 Optimization of Fermentation Conditions of Streptomyces sp.SS9-1 and Its Control Effect on Tomato Gray Mold FU Linyun,LI Jing,LI Na,LIU Jinxia*,DING Ping,NIE Yaoyan,WU Jianrong,YANG Cheng(Institute of Biology,Gansu Academy of Science,Lanzhou 730000,China)Abstract:A strain of Streptomyces ciscaucasicus SS9-1 was isolated from rhizosphere soil samples of Aconitum pendulum Busch in our laboratory before.The antifungal activity test showed that the strain SS9-1 had a good inhibitory effect on Botrytis cinerea,the pathogen of tomato gray mold.In order to further improve its antifungal effect on tomato gray mold,the fermentation medium formula and fermentation conditions of SS9-1 were optimized by single factor test and orthogonal test.Then the fermentation filtrate was tested for its antifungal effect and pot control efficiency on tomato gray mold.The results showed that the optimal fermentation medium of strain SS9-1 was as follows:starch soluble 4%,KNO3 1%,yeast extract powder 0.25%,NaCl 0.2%,MnCl24H2O 0.002%.The optimum fermentation conditions were as follows:liquid volume 150 mL,inoculation rate 3%,initial pH 8.0,fermentation temperature 28,fermentation time 7 d.Plate confrontation test showed that the mycelium of B.cinerea was swelled and deformed after being affected by the fermentation filtrate.It also had a strong inhibitory effect on the germination of B.cinerea spores,and the germination inhibition rates of were 97.83%and 96.07%after 12 h and 24 h of treatment,respectively.In the pot experiment,the control efficiency of the fermentation filtrate of strain SS9-1 reached 98.43%,which was obviously higher than that of the pesticide control,40%pyrimethanil SC 第 1 期 付麟雲等：链霉菌 SS9-1 发酵条件优化及其对番茄灰霉病的防治效果研究 127 500 times dilution.After the fermentation filtrate was diluted 50 times,the control efficiency was still 71.11%.In conclusion,the strain SS9-1 has a good biological control effect on tomato gray mold,and has the application value and potential as a biocontrol agent.Key words:Streptomyces;tomato gray mold;fermentation conditions optimization;biological control 番茄灰霉病是由灰葡萄孢 Botrytis cinerea 引起的危害番茄生产的主要病害之一，是一种世界性病害，一经侵染就会很快危害番茄的果实、叶片、茎、花等部位1-3，进而导致番茄烂苗、烂果，最终造成减产，发病严重时可达 50%60%左右，甚至绝收。同时也会在后续的贮存和运输过程中，造成一系列影响其商品价值的危害，如贮存期变短、品质变差等4-6。对于灰霉病，田间通常采用化学药剂防治，但存在对环境不友好和农药残留风险等问题7。而生物防治具有安全、有效、无残留等优点，且不易产生抗性，是保障农业可持续发展和粮食生产的有效措施，已成为国内外灰霉病防治的研究热点8,9。目前用于番茄灰霉病的生防菌主要集中在真菌、细菌和放线菌10。而链霉菌 Streptomyces 是一类具有丝状分枝菌丝的革兰氏阳性细菌，广泛分布在土壤、海洋等不同自然环境中，属于原核生物界放线菌目链霉菌科链霉菌属，它也是放线菌目中最大的一个属，包含 1000 多种菌，由于其可以产生不同种类的次生代谢产物，在农业生产及病害防治方面应用广泛11,12。已有研究表明链霉菌在番茄灰霉病防治中具有一定的潜力，陈丽红等13从陕北地区的土壤样品中分离到一株链霉菌 NW136，其发酵液对番茄灰霉病具有明显的抑制效果，EC50为 12.93 mL/L。李毅等14从 3 种蔬菜地土壤中筛选出 2 株具有拮抗作用的链霉菌属白孢类群 LJ50 和 MJ52，它们对番茄灰霉病的抑制率分别为 73.65%和 66.49%。单丽萍等15发现白黄链霉菌 TD-1 菌株发酵液对番茄灰霉病菌的菌丝生长和孢子萌发抑制率分别为 98.1%和 98.3%，且在番茄植株上对灰霉病的防治效果达 76.98%。Xiao 等16从碱蓬中分离到了一株链霉菌 Streptomyces sp.FX13，对灰霉病表现出很好的生防潜力，该菌的提取物可以很好地抑制灰霉病菌丝生长，其 EC50为 5.4 mg/L。Kim 等17发现 Streptomyces sp.BS062 对西洋参和草莓灰霉病的发病防治率分别达到 73.9%和 58%。Boukaew 等18从辣椒根际中分离到一株链霉菌 Streptomyces philanthi RM-1-138，在盆栽试验中对灰霉病的发病抑制率达到57.4%，而在离体叶片试验中抑制率达到 60.1%。本实验室从铁棒锤根际土壤样品中分离到一株高加索链霉菌 Streptomyces ciscaucasicus SS9-1，前期试验发现该菌株的发酵滤液对番茄灰霉病病原菌灰葡萄孢 B.cinerea 具有较强的抑制作用。因此本研究通过对菌株 SS9-1 的发酵培养基配方和发酵条件进行优化，并以番茄灰霉病菌 B.cinerea 作为抗菌活性试验的指示菌，进而提高其发酵液的抗菌活性；同时通过孢子萌发试验和菌丝形态影响测定了优化后的发酵滤液对灰霉病的抑制效果。另外，通过盆栽试验测定了优化后的发酵滤液对番茄灰霉病的防治效果，为其之后进一步实际应用提供了理论依据。1 材料与方法 1.1 试验材料 供试菌株高加索链霉菌 S.ciscaucasicus SS9-1 是本实验室从采自甘肃省兰州市榆中县马衔山（海拔3600 m）的铁棒锤 Aconitum pendulum Busch 根际土壤样品中分离得到；灰葡萄孢 B.cinerea 也由本实验室之前分离得到，两株菌均由本实验室保藏。1.2 培养基及种子液 PDA 培养基：马铃薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 18 g/L；高氏 1 号合成培养基：可溶性淀粉 20 g/L，KNO3 1 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，MgSO47H2O 0.5 g/L，FeSO47H2O 0.01 g/L，pH 7.2。种子液：从斜面培养基上，将菌株 SS9-1 转接到高氏 1 号固体平板培养基上，26 培养7 d。用接菌环在平板上挑取活化好的菌株 SS9-1，接入高氏 1 号液体培养基中，26、120 r/min 摇床培养 7 d，即得种子液。1.3 培养基配方单因素试验 1.3.1 碳源的筛选 以高氏 1 号培养基作为基础培养基，分别以可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和玉米粉作为碳源，代替基础培养基中的碳源，以不添加任何碳源的培养基作为碳源空白对照，将培养128 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 好的种子液接入不同碳源的发酵培养基中，每个处理设置 3 个重复，26、120 r/min 摇床培养 7 d。发酵滤液：取不同处理的发酵液，6000 r/min 离心 15 min，取上清过滤后备用。采用打孔抑菌圈法并以灰葡萄孢病原菌作为指示菌测定不同处理的抗菌活性大小：将灰葡萄孢病原菌孢子悬浮液均匀涂布在 PDA 平板上，用打孔器在平板中心打取直径 6 mm 的孔，取不同处理的发酵滤液 200 L 注入孔中，28 培养箱中培养 5 d 后，十字交叉法测定抑菌圈大小。1.3.2 氮源的筛选 以高氏 1 号培养基为基础培养基，分别以蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、KNO3、(NH4)2SO4和 NH4Cl 作为氮源，代替基础培养基中的氮源，以不添加任何氮源的培养基作为空白对照，将培养好的种子液接入不同氮源的发酵培养基中，每个处理设置 3 个重复，26、120 r/min 摇床培养 7 d，测定不同处理的抗菌活性，方法同上。1.3.3 大量元素的筛选 以高氏 1 号培养基为基础培养基，分别以 K2HPO4、MgSO47H2O、CaCl26H2O 和NaCl 作为大量元素无机盐，以不添加任何大量元素的培养基作为空白对照，将培养好的种子液接入不同大量元素的发酵培养基中，每个处理设置 3 个重复，26、120 r/min 摇床培养 7 d，测定不同处理的抗菌活性。1.3.4 微量元素的筛选 以高氏 1 号培养基为基础培养基，分别以 ZnSO4、CoCl2、MnCl24H2O 和FeSO47H2O 作为微量元素无机盐，以不添加任何微量元素的培养基作为空白对照，将培养好的种子液接入不同微量元素的发酵培养基中，每个处理设置 3 个重复，26、120 r/min 摇床培养 7 d，最后测定不同处理的抗菌活性。1.4 正交试验 以上述筛选到的最佳配方进行正交试验，按 5 因素 4 水平 L16（45）设计正交试验（表 1），确定最适配比。1.5 发酵条件优化 采用最佳配方的培养基，依次按以下不同发酵条件进行优化。1.5.1 装液量的筛选 在 500 mL 锥形瓶中分别装入 100、150、200、250、300、350 mL 最佳配方培养基，每个处理设置 3 个重复，26、120 r/min 摇床培养 7 d，同样采用打孔抑菌圈法，测定不同处理对番茄灰霉病的抗菌活性。1.5.2 接种量的筛选 在 500 mL 锥形瓶装入 150 mL 最佳配方培养基，再分别以 1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%的接种量接入种子液，每个处理设置 3 个重复，26、120 r/min 摇床培养 7 d，抗菌活性测定方法同上。1.5.3 初始 pH 的筛选 将 150 mL 装液量的最佳培养基的初始 pH 分别调节为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，之后按 3%的接种量接入种子液，每个处理设置 3 个重复，26、120 r/min 摇床培养 7 d，抗菌活性测定方法同上。1.5.4 发酵温度的筛选 以装液量 150 mL、初始 pH 为 8，按 3%进行接种，之后分别在 22、25、28、31、34、37 下进行培养，每个处理设置 3 个重复，培养 7 d，抗菌活性测定方法同上。1.5.5 发酵时间的筛选 装液量 150 mL、初始 pH 为 8、按 3%进行接种并在 28 下进行培养，分别在 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 和 12 d 取样，每个处理设置 3 个重复，抗菌活性测定方法同上。1.6 发酵滤液对番茄灰霉病的抑制作用 1.6.1 对番茄灰霉病孢子萌发的抑制作用测定 采用凹玻片孢子萌发法测定，将配制好的灰霉病孢子悬浮液与发酵滤液按 1:1（v/v）混合，混合均匀后滴加到凹玻片的凹孔中，每个凹孔加 80 L，同时以无菌水作为对照，每个处理 3 个重复。然后将滤纸垫在培养皿中，并在滤纸上铺上牙签，将凹玻片放在上面，之后在底部滤纸上加入无菌水进行保湿，26 下暗培养 4、6、8、12、24 h 后分别观察孢子的萌发情况。在显微镜下观测，每一凹玻片选择 3 个不同的视野，每个视野中选取不少于 100 孢子进行观察，总计不少于 300 个孢子。记录孢子总数和萌发孢子数，然后计算孢子萌发抑制率（%）。发酵滤液对灰霉病菌孢子萌发的抑制率（%）的计算公式如下：孢子萌发抑制率（%）（对照萌发率处理萌发率）/对照萌发率100。1.6.2 对番茄灰霉病菌丝形态的影响 采用平板对峙法观察菌株 SS9-1 对灰霉病菌丝形态的影响。在高氏 第 1 期 付麟雲等：链霉菌 SS9-1 发酵条件优化及其对番茄灰霉病的防治效果研究 129 1 号培养基平板上对 SS9-1 进行活化，26 恒温箱中培养 5 d，活化后将菌株 SS9-1 接种在高氏 1 号液体培养中，26 下培养 7 d。将灰霉病菌接种到 PDA 平板培养基上，28 培养 5 d。在灰霉病培养基平板边缘打取菌饼，将其接种在 PDA 平板培养基中心，在距离平板中心 2.5 cm 处对称两侧打取 6 mm 的孔，吸取200 L发酵滤液注入孔中；对照则吸取同样体积的无菌水注入孔中，之后在28 恒温条件下培养5 d。用接菌针挑取抑菌圈边缘的菌丝，置于载玻片上，在显微镜下观察菌丝形态，比较处理组与对照组番茄灰霉病菌丝的形态差异。1.7 发酵滤液对灰霉病的盆栽防治效果测定 选取 5、6 叶期且长势一致的盆栽番茄幼苗，在叶面分别喷施不同的处理液：发酵液滤液原液、发酵滤液 5、10、50、100 倍稀释液，40%嘧霉胺悬浮剂 500、1000 倍稀释液，喷洒至叶片表面完全浸润，以喷施无菌水为对照。在 26、相对湿度 95%条件下培养 1 d 后，在叶片中央接种 5 mm 的灰霉病菌饼，28、相对湿度 95%条件下培养 3 d 后，十字交叉法测量病斑直径，计算病斑面积及防治效果。每个处理 10 株，重复 3 次。1.8 数据统计及分析 试验数据均使用 Microsoft Excel 2016 及 SPSS 25.0 处理。2 结果与分析 2.1 发酵培养基的单因素试验筛选结果 2.1.1 最适碳源的筛选 不同的碳源培养条件下，菌株 SS9-1 的抑菌活性有显著差异，其中可溶性淀粉作为碳源，对病原菌的抑菌圈直径为24.27 mm，显著高于其他处理组；其次为玉米粉，抑菌圈直径为20.55 mm，蔗糖作为碳源抑菌效果最差，抑菌圈直径为 16.97 mm，显著低于其他处理组（图 1）。因此，可溶性淀粉是该菌培养的最佳碳源。抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)注：图上不同小写字母者表示 0.05 水平差异显著，下同。Note：Data with the different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level.The same below.图 1 不同碳源对发酵滤液抑菌活性的影响 Fig.1 Effect of different carbon sources on inhibition activity of fermentation filtrate 2.1.2 最适氮源的筛选 由图 2 可知，不同的氮源培养条件下，菌株 SS9-1 的抑菌活性不同。整体上，有机氮源的抑菌效果优于无机氮源，其中硝酸钾和酵母浸粉作为氮源的处理，菌株 SS9-1 对病原菌的的抑制效果显著优于其他氮源处理，抑菌圈直径分别达 24.82 和 25.64 mm。由此，选硝酸钾和酵母浸粉作为最佳氮源。2.1.3 最适大量元素无机盐的筛选 试验结果（图 3）表明，在 NaCl 作为无机盐处理时，菌株 SS9-1 的抑菌活性显著增强，抑菌圈直径为 26.23 mm，显著高于其他大量元素无机盐处理。因此，NaCl 可作为大量元素无机盐的最佳选择。130 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 2.1.4 最适微量元素无机盐的筛选 试验结果（图 4）表明，MnCl24H2O 作为微量元素无机盐处理时，菌株 SS9-1 的抑菌活性最高，其抑菌圈直径为 26.07 mm，显著高于其他处理；ZnSO4元素作为微量元素无机盐时，抑菌圈直径最小。因此，选择 MnCl24H2O 作为最佳的微量元素无机盐。抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)图 2 不同氮源对发酵滤液抑菌活性的影响 Fig.2 Effect of different nitrogen sources on inhibition activity of fermentation filtrate 1015202530对照Control磷酸氢二钾K2HPO4硫酸镁MgSO47H2O氯化钙CaCl2氯化钠NaCl不同大量元素 Different major elements抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)bccda 图 3 不同大量元素对发酵滤液抑菌活性的影响 Fig.3 Effect of different major elements on inhibition activity of fermentation filtrate 抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)图 4 不同微量元素对发酵滤液抑菌活性的影响 Fig.4 Effect of different minor elements on inhibition activity of fermentation filtrate 第 1 期 付麟雲等：链霉菌 SS9-1 发酵条件优化及其对番茄灰霉病的防治效果研究 131 2.2 发酵培养基组分正交试验优化 正交试验结果如表 1 所示，处理 15 为最优组合，抑菌圈直径为 30.78 mm；抗菌活性最低的为处理 1，其各项培养基营养成分比例均为最低，抑菌圈为 15.44 mm。由表 1 中 R 值可以得出，5 种培养基成分对抑菌作用影响强弱不同，根据R值大小排序为RCRARERBRD，即酵母浸粉可溶性淀粉MnCl24H2OKNO3NaCl，酵母浸粉作为氮源对抑菌活性的影响最大；从 K 值可以看出，5 因素的最优水平分别为A4、B4、C2、D4、E4，即可溶性淀粉 4%、KNO3 1%、酵母浸粉 0.25%、NaCl 0.2%、MnCl24H2O 0.002%，此为最优发酵培养基配方。表 1 正交试验结果分析表 Table 1 Analysis of the orthogonal test results 试验编号 No.可溶性淀粉 Starch soluble (A)硝酸钾 Potassium nitrate (B)酵母浸粉 Yeast extract powder(C)氯化钠 NaCl(D)氯化锰 MnCl24H2O(E)抑菌圈直径 Diameter of inhibition zone(mm)1 1(1%)1(0.05%)1(0.05%)1(0.05%)1(0.0005%)15.440.70 g 2 1(1%)2(0.25%)2(0.25%)2(0.1%)2(0.001%)19.711.25 f 3 1(1%)3(0.5%)3(0.5%)3(0.15%)3(0.0015%)20.770.34 ef 4 1(1%)4(1%)4(1%)4(0.2%)4(0.002%)25.961.18 cd 5 2(2%)1(0.05%)2(0.25%)3(0.15%)4(0.002%)28.740.81 b 6 2(2%)2(0.25%)1(0.05%)4(0.2%)3(0.0015%)19.650.51 f 7 2(2%)3(0.5%)4(1%)1(0.05%)2(0.001%)16.511.30 g 8 2(2%)4(1%)3(0.5%)2(0.1%)1(0.0005%)20.81.11 ef 9 3(3%)1(0.05%)3(0.5%)4(0.2%)2(0.001%)20.630.15 ef 10 3(3%)2(0.25%)4(1%)3(0.15%)1(0.0005%)19.870.79 f 11 3(3%)3(0.5%)1(0.05%)2(0.1%)4(0.002%)21.570.64 e 12 3(3%)4(1%)2(0.25%)1(0.05%)3(0.0015%)27.840.57 b 13 4(4%)1(0.05%)4(1%)2(0.1%)3(0.0015%)21.670.28 e 14 4(4%)2(0.25%)3(0.5%)1(0.05%)4(0.002%)26.410.64 c 15 4(4%)3(0.5%)2(0.25%)4(0.2%)1(0.0005%)30.780.71 a 16 4(4%)4(1%)1(0.05%)3(0.15%)2(0.001%)24.990.59 d K1 81.88 86.48 81.65 86.20 86.89 K2 85.70 85.64 107.07 83.75 81.84 K3 89.91 89.63 88.61 94.37 89.93 K4 103.85 99.59 84.01 97.02 102.68 k1 20.47 21.62 20.41 21.55 21.72 k2 21.43 21.41 26.77 20.94 20.46 k3 22.48 22.41 22.15 23.59 22.48 k4 25.96 24.90 21.00 24.26 25.67 R 5.49 3.49 6.36 3.32 5.21 注：数据为平均值标准误，不同小字母表示 0.05 水平上差异显著，下同。Note：data were presented as meanSD,data with different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level.2.3 发酵条件的优化 2.3.1 装液量的优化 在 500 mL 三角瓶中，当装液量为 150 mL 时，抑菌圈直径最大，为 32.43 mm，抗菌活性最强，但随着装液量继续增加至 350 mL，抑菌圈直径大小逐步减小。因此，150 mL 为发酵培养的 132 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 最佳装液量。2.3.2 接种量的优化 试验结果表明，接种量为 3%时，抑菌圈直径最大，为 32.99 mm，抗菌活性最强，随着接种量继续增加，抑菌活性逐渐降低。因此，3%为发酵培养的最优接种量。2.3.3 初始 pH 的优化 试验结果表明，初始 pH 在 8.0 时，抑菌圈直径达到最大，为 32.80 mm，显著高于其他初始 pH 条件下的抑菌圈直径；在 pH 5.0 时，抑菌圈仅为 15.01 mm。因此，初始 pH 8.0 为最佳初始 pH。2.3.4 发酵温度的优化 菌株 SS9-1 在 22 37 之间，均能正常生长，且表现出较好的抑菌活性。在28 之前，随着温度的升高，抑菌圈直径逐步增大，之后又随着温度的进一步升高，抑菌圈直径逐步减小；而在 28 时，抗菌活性达到最高，抑菌圈直径为 32.53 mm。因此，最佳的发酵温度为 28。抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)图 5 装液量对发酵滤液抑菌活性的影响 Fig.5 Effect of liquid volume on inhibition activity of fermentation filtrate 10152025303545678910111213初始 pH initial pHfecabcde 图 7 初始 pH 对发酵滤液抑菌活性的影响 Fig.7 Effect of initial pH on inhibition activity of fermentation filtrate 抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)图 6 接种量对发酵滤液抑菌活性的影响 Fig.6 Effect of inoculation rate on inhibition activity of fermentation filtrate 202326293235222528313437发酵温度 Fermentation temperature()抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)cbabcc 图 8 发酵温度对发酵滤液抑菌活性的影响 Fig.8 Effect of fermentation temperature on inhibition activity of fermentation filtrate 2.3.5 发酵天数的优化 试验结果表明，在发酵第 1 d 和 2 d 时，菌株 SS9-1 没有抑菌活性；从第 3 d 开始，随着发酵天数的增加，抑菌活性也逐步增强，在第 7 d 时，抑菌活性达到最大，此时抑菌圈直径为 33.82 mm；之后抑菌活性随着培养天数的增加开始降低，但始终维持在一个相对稳定的水平。因此，7 d 为发酵的最佳天数。通过上述优化试验，确定了最优的发酵培养基成分：可溶性淀粉 4%、KNO3 1%、酵母浸粉 0.25%、NaCl 0.2%、MnCl24H2O 0.002%；最优发酵条件为：150 mL 装液量、3%的接种量、初始 pH 8.0、温度为第 1 期 付麟雲等：链霉菌 SS9-1 发酵条件优化及其对番茄灰霉病的防治效果研究 133 28、发酵天数为 7 d。经过优化后的发酵滤液对番茄灰霉病的抑菌效果和防治效果均有很好的提升。抑菌效果：优化前测定的抑菌圈大小平均为 24.27 mm，而优化后则为 33.82 mm；防治效果：优化后的发酵滤液原液防治效果为 98.43%，比优化前的 91.13%防治效果有一定的提升。而当发酵滤液稀释 5倍后，优化前后的防治效果有了很明显的变化，优化前的防治效果降低到 79.11%，但优化后依然较高，为 96.08%。进一步发酵液稀释 50 倍后，优化前的防治效果低于 60%，为 59.16%，而优化后则为 71.11%。因此，通过优化发酵培养基和发酵条件，无论是在抑菌效果，还是在防治效果方面，菌株 SS9-1 均有较 好的提升。2.4 对番茄灰霉病的抑制作用结果 2.4.1 对番茄灰霉病孢子萌发的影响 试验结果如表 2 所示，链霉菌 SS9-1 发酵滤液处理 48 h，番茄灰霉病孢子萌发率均为 0。处理 12、24 h 后，菌株 SS9-1 发酵滤液对灰霉病孢子萌发抑制率分别为 97.83%和 96.07%。2.4.2 对番茄灰霉病菌丝形态的影响 由图 10观察可知，经发酵滤液处理（图 10A，B）后的番茄灰霉病菌丝出现不规则膨大、变形这类异常生长形态，而对照组（图 10C）的番茄灰霉病菌丝生长形态正常，没有膨大或变形现象存在。因此表明菌株 SS9-1 发酵滤液导致其菌丝发生畸变，影响菌丝的正常生长。0510152025303540012345678910111213发酵时间 Fermentation time(d)抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)edcbabbbbb 图 9 发酵时间对发酵滤液抑菌活性的影响 Fig.9 Effect of fermentation time on inhibition activity of fermentation filtrate 表 2 发酵滤液对孢子萌发的影响 Table 2 Effect of fermentation filtrate on the spore germination 萌发率 Germination rate(%)时间 Time 对照 菌株 SS9-1 萌发抑制率 Germination inhibition rate(%)4 h 5.651.11 0 100.00 6 h 28.642.22 0 100.00 8 h 43.332.52 0 100.00 12 h 84.923.49 1.840.21 97.83 24 h 94.252.1 3.70.59 96.07 A，B：发酵滤液处理 Treatment of fermentation filtrate；C：无菌水对照 Sterile water control 图 10 发酵滤液对菌丝形态的影响（640）Fig.10 Effect of fermentation filtrate on mycelium morphology(640)2.5 盆栽防效试验结果 结果如表 3 所示，菌株 SS9-1 发酵滤液原液、5 倍稀释液的防治效果分别达到了 98.43%和 96.08%，显著高于对照药剂 40%嘧霉胺 SC 500 倍液处理；发酵滤液 10 倍稀释液处理的防治效果为 88.26%，与对照134 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 药剂 40%嘧霉胺 SC 500 倍液处理无显著差异；发酵滤液 50 倍稀释液处理的防治效果为 71.11%，显著高于对照药剂 40%嘧霉胺 SC 1000 倍液处理；发酵滤液 100 倍稀释液处理的，防治效果仅 18.02%，显著低于其他处理。表 3 盆栽试验中发酵滤液对番茄灰霉病的防治效果 Table 3 Control efficiency of fermentation filtrate against B.cinerea in pot experiment 处理 Treatment 病斑面积 Area of disease(mm2)防治效果 Preventive effect(%)发酵滤液原液 1.060.55 g 98.430.81 a 发酵滤液 5 2.650.6 fg 96.080.89 a 发酵滤液 10 7.930.76 ef 88.261.13 b 发酵滤液 50 19.545.31 d 71.117.85 c 发酵滤液 100 55.422.96 b 18.024.37 e 40%嘧霉胺 SC 500 9.932.29 e 85.313.4 b 40%嘧霉胺 SC 1000 26.250.36 c 61.170.52 d CK(无菌水)67.68.25 a 3 讨论 生物防治具有对环境友好、不易产生抗药性、对人畜无害等特点19，而田间作物在防控病害方面，应用最多的生防菌株主要集中在芽胞杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属，研究表明其中链霉菌属的生防菌对多种细菌和真菌类病害具有显著的抑制作用20,21。Bressan 等22研究发现两株链霉菌 DAUFPE 11470 和DAUFPE 14632 对玉米镰刀病菌具有很强的抑制作用，Zarandi 等23研究表明一株分离得到的链霉菌 263对水稻稻瘟病具有很强的抑制作用且对叶部的症状抑制效果明显。同时也有研究表明链霉菌可作为番茄灰霉病的生防菌株，魏艳敏等24对 26 株链霉菌进行了灰霉病抑菌活性测定，发现其中菌株 15、63、GS-93-10、93 对番茄灰霉病的抑菌作用较强，且抑菌活性强于 50%多菌灵 wp；谢晨昭等25发现一株淡紫灰链霉菌，对番茄灰霉病菌的生长抑制率达 86.25%，其发酵上清液在活体植株上对番茄灰霉病具有良好的生防作用，其防治效果为 68.80%；徐大勇等26从土壤中分离筛选到 1 株放线菌 HNU-1，对番茄灰霉病具有很强的抑制作用，其发酵滤液稀释 6.67 倍时能完全抑制灰霉病菌菌丝生长和分生孢子萌发。本研究从采自甘肃省兰州市榆中县马衔山的铁棒锤根际土壤中分离得到一株高加索链霉菌 SS9-1，试验发现它对番茄灰霉病具有一定的抑制作用，因此进一步对其发酵培养基配方及发酵条件进行优化，优化后的发酵滤液对番茄灰霉病的抑菌效果和防治效果均有很大的提升。同时，通过发酵滤液对灰霉病孢子萌发的抑制试验，发现菌株 SS9-1 对灰霉病孢子具有很强的抑制作用，在处理的前 8 h 内完全抑制番茄灰霉病孢子的萌发，在处理 24 h 后仍然具有 96.07%的抑制率；另外，发酵滤液对灰霉病的菌丝形态也具有一定的影响，导致其菌丝膨大变形，发生畸变；结