几丁质对海洋生防酵母抑菌活性的影响及相关机理的研究本科学位论文.doc

哈尔滨工业大学学士学位论文工学学士毕业论文几丁质对海洋生防酵母(Rhodosporidium paludigenum)抑菌活性的影响及相关机理的研究A Thesis for the Degree of B. Eng Impact and Mechanism of Chitin on the Marine Yeasts Antibacterial ActivityCandidate：Laifeng LuSupervisor：Guangfeng KanAcademic Degree Applied for：Bachelor of EngineeringSpecialty：Food Science and EngineeringDate of Oral Examination：June, 2010University：Harbin Institute of Technology哈尔滨工业大学学士学位论文 摘要毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。作 者 签 名： 日 期： 指导教师签名： 日期： 使用授权说明本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。作者签名： 日 期： 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名： 日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。涉密论文按学校规定处理。作者签名：日期： 年 月 日导师签名： 日期： 年 月 日摘 要生物防治是采用微生物菌株或抗菌素类物质，通过喷洒或浸渍果实处理，以降低或防治果实采后病害的保鲜方法。本实验通过利用酵母细胞壁组分之一几丁质诱导培养本实验室分离得到的拮抗菌株海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman（经英国国际微生物所菌种保存和鉴定中心CABI Bioscience Identification Services鉴定为Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman）以提高其采后果实病害生物防治效果。结果如下：（1）体内试验结果表明，几丁质诱导后，R. paludigenum的果实采后青霉病害生物防治效果得到显著提高。（2）几丁质诱导提高R. paludigenum生防效力的最佳诱导浓度为1.0%（w/v），最佳诱导培养时间为3648 h。此外，试验结果表明，几丁质诱导培养与NaCl诱导培养之间并不存在协同增效作用。（3）机理实验结果表明，几丁质诱导培养后，R. paludigenum在苹果、梨果实伤口处的生长速度显著提高，菌体数量显著增加。（4）几丁质诱导培养后，R. paludigenum的发酵上清液对苹果果实伤口处扩展青霉的侵染有一定抑制作用。而未经诱导R. paludigenum 的发酵上清液对苹果果实伤口处扩展青霉的侵染没有抑制作用，反而有促进效果。（5）果实诱导抗性试验结果表明，R. paludigenum能激发苹果果实对青霉病害的抗性，而经NYCB诱导培养的酵母能进一步增强这种对果实抗性的诱导作用。其机理可能与激发苹果果实伤口处组织的POD酶活性有关。综上所述，几丁质诱导可以提高R. paludigenum的产后果实生物防治效果，其机理可能与诱导培养后，能促进R. paludigenum在果实伤口处的生长、刺激酵母分泌抑菌物质和增强酵母对果实抗性的诱导有关。关键词： Rhodosporidium paludigenum；几丁质；诱导；生物防治III 哈尔滨工业大学学士学位论文 外文摘要ABSTRACTBiological control is a method that using microbial strains or antibiotic substances, by spraying or dipping, to decrease postharvest decay of fruits. We planned to use chitin (one of the yeast cell wall components) to co-culture with Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman isolated by our laboratory Colleague in marine yeast (Identified by CABI Bioscience Identification Services as Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman) to enhance the effectiveness of its biological control of postharvest decays of fruits. (1) In vivo test results showed that R. paludigenum induced by chitin can increase its biological control of postharvest diseases (BCPD) effect significantly. (2) The optimal concentration for induction was 1.0% (w/v), the optimal time for induction was 3648 hours. There was no collaborative effect between chitin and NaCl on the BCPD of R. paludigenum.(3) Data showed population and growth speed of R. paludigenum in wounds of apple and pear increased significantly.(4) Data showed that R. paludigenum cultured in medium with chitin had inhibitory effect to the decay of pears caused by Penicillium expansum， R. paludigenum cultured in NYDB has no inhibitory, but a promoting effect. (5) Through the induction of fruit resistance and associated biological control results showing that R. paludigenum could stimulate the resistance of fruits against the external infection. Meanwhile, chitin could improve their ability to inhibit the decay incidence and fruit resistance. The ability to stimulate fruits POD activity may be related.In conclusion, R. paludigenum induced by chitin could increase its BCPD effect. The promoting of R. paludigenums growth in fruit wounds, secreting of antimicrobial substances and induced resistance of fruit after being induced may be the mechanism.Key words: R. paludigenum; Chitin; Induction; BCPD哈尔滨工业大学学士学位论文 目录目 录摘 要ABSTRACT第一章 文献综述11.1 我国水果产业发展概述11.2 果蔬采后病害的侵染研究1 1.2.1 采后病原真菌的侵染方式1 1.2.2 采后病原真菌的致病机理21.3 果蔬采后病害的控制方法2 1.3.1 化学杀菌剂的使用3 1.3.2果实采后病害防治物理方法3 1.3.3果实采后病害生物防治41.4 采后拮抗酵母作用机制4 1.4.1营养和空间的竞争4 1.4.2重寄生作用5 1.4.3胞外活性物质的产生5 1.4.4诱导抗性6 1.4.5抗生作用61.5 拮抗菌生理调控及机理的研究7 1.5.1逆境培养7 1.5.2拮抗物质的分泌和积累8 1.5.3 基因工程技术的应用81.6 本课题研究目的81.7 应用前景和学术价值9第二章 海洋酵母R. paludigenum对果实采后真菌病害抑制效果研究102.1 前言102.2 实验材料和方法10 2.2.1 主要仪器10 2.2.2拮抗菌及其培养11 2.2.3 病原菌培养和孢子悬浮液的制备11 2.2.4 试剂11 2.2.5 果实选择与预处理12 2.2.6 几丁质对R. paludigenum生防效果的影响12 2.2.7 数据处理分析与作图132.3 结果13 2.3.1 不同浓度几丁质对R. paludigenum生防效力的影响13 2.3.2几丁质诱导后不同浓度R. paludigenum酵母的生防效果15 2.3.3 不同培养时间对几丁质诱导下R. paludigenum生防效力的影响17 2.3.4 几丁质与NaCl结合诱导对R. paludigenum生防效力的影响182.4 讨论20第三章 海洋酵母R. paludigenum对果实采后真菌病害抑制机理研究223.1 前言223.2 实验材料和方法22 3.2.1 主要仪器22 3.2.2拮抗菌及其培养23 3.2.3 病原菌培养和孢子悬浮液的制备23 3.2.4 果实选择与预处理23 3.2.5 几丁质对R. paludigenum生防机理的影响23 3.2.6 数据处理分析与作图243.3 结果24 3.3.1几丁质对R. paludigenum在果实伤口处生长动态的影响24 3.3.2几丁质处理后R. paludigenum对果实诱导抗性的影响26 3.3.3几丁质处理后R. paludigenum发酵上清液的抑菌效果27 3.3.4 几丁质培养后R. paludigenum对果实POD酶活性的影响273.4 讨论28第四章 结果与展望304.1 本论文的主要研究结果304.2 本实验的后续研究及展望30致谢32参考文献33附 录372哈尔滨工业大学学士学位论文 第一章 文献综述第一章 文献综述1.1 我国水果产业发展概述水果是维生素、矿物质和膳食纤维的重要来源，是人们维持身体健康，增进营养必不可少的主要食品，是世界上仅次于粮食的农产品。中国是世界水果生产大国，总收获面积和产量以及多种水果的产量均居世界首位。蔬菜、水果产业是我国国内仅次于粮食产业的第二、第三大产业。2007年3月国家统计局发布的中华人民共和国2006年国民经济和社会发展统计公报显示，2006年我国水果总产量为17050万吨。据2010年初步统计，2009全国水果面积约1.6亿亩，与上年基本持平，产量1.2亿吨，同比增9。根据联合国粮食组织对50多个国家的调查，发展中国家水果收获后的平均损失率在30%以上。我国水果因采后处理技术落后，作为产量第一大国，水果腐烂损失也高居全球榜首。根据一般保守的估计，我国水果采后损失为20%30左右。据此估算，我国每年水果采后的经济损失将达到数百亿元人民币的水平。 导致果实采后损失的因素很多，主要包括：(1)由于采前栽培管理、采收和采后处理技术不当而造成的损失；(2)由于果实采后水分和营养消耗造成的失重和枯萎等品质劣变而引起的损失；(3)由于采后逆境造成的果实生理代谢失调而引起的损失；(4)由于采后成熟衰老造成果实组织结构崩溃而引起的损失；（5）由于病原物侵染造成的腐烂损失等。 由各种病原物引起的植物病害每年都给各国经济造成重大的损失，其中又以真菌性病害最为严重。据估计，仅美国每年由真菌性病害造成的经济损失就达330亿美元（Maor和Shirasu, 2005；Strange和Scott, 2005）。真菌也是引起采后果实病害的主要病原物（Sholberg和Conway，2004）。病原真菌不仅会造成果实数量上的巨大损失，而且许多病原真菌分泌产生的大量次生代谢产物还可能会引起严重的食品安全问题，如曲霉菌（主要是Aspergillums flavus和Aspergillums parasiticus等）产生的黄曲霉毒素、扩展青霉（Penicillium expansum）产生的棒曲霉素（patulin）等（Martins et al., 2002；Sholberg和Conway, 2004；Dombrink-Kurtzman和Blackburn, 2005；Brodhagen和Keller，2006；Morales et al., 2007）。1.2 果蔬采后病害的侵染研究由真菌病害引起的果实采后的腐烂变质是导致水果大量损失的主要原因之一。病原真菌不仅会造成果实数量上的巨大损失，而且许多病原真菌分泌产生的大量次生代谢产物还可能引起严重的食品安全问题。1.2.1 采后病原真菌的侵染方式采后病原真菌主要通过3种途径或方式入侵果实：(1)通过机械伤或虫害等造成的伤口；(2)通过自然开放的皮孔、气孔、果实和花梗结合部位；(3)通过分泌寄主细胞壁水解酶等直接突破果实表皮的防御机制（Prusky和Lichter, 2007）。病原菌孢子一旦接触伤口组织，侵染就开始了（Janisiewicz和Korsten, 2002；Prusky和Lichter, 2007）。而在没有伤口等便利的入侵途径的情况下，许多采后病原真菌的孢子可能会长时间潜伏在果实表面，直到果实成熟和衰老后才发起对果实的攻击（Prusky和Lichter, 2007）。1.2.2 采后病原真菌的致病机理采后病原真菌具有众多而且复杂的致病机理，但其最终目的都是成功的侵染寄主。病原真菌分泌产生的寄主细胞壁分解酶是研究较多、机理较为明确的重要致病因子，其主要包括多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase）、果胶裂解酶（pectatelyase）、木聚糖酶（xylanases）、木糖苷酶（xylosidase）、蛋白酶（protease）、葡聚糖酶（glucanases）、漆酶（laccase）等(Snchez-Torres和Gonzlez-Candelas，2003；Akimitsu et al., 2004)。这些酶可能涉及病原真菌多方面的侵染机制和过程，如渗透、组织泡软、营养获得、改变寄主生理等（Snchez-Torres和Gonzlez-Candelas, 1996；Akimitsu et al., 2004）。1.2.2.1致病菌酸化果实组织P. expansum、P. digitatm 和P. italicum 等酸性病原真菌能产生柠檬酸和葡萄糖酸等有机酸，使寄主果实组织发生酸化，进而促进病原菌致病因子，如PG基因（pepgl）的表达（Prusky et al., 2004）。1.2.2.2致病因子CAT活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）在植物和微生物相互作用过程中具有重要作用（Torres et al., 2006)。最近，中科院植物所Qin等（2007）利用蛋白组学技术发现，硼酸盐抑制扩展青霉的机理与硼酸盐抑制该真菌体内参与清除ROS的过氧化氢酶（Catalase，CAT）及谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferase）等有关，暗示扩展青霉产生的CAT等可能也是该病原菌的一个致病因子。1.2.2.3病原菌破坏植物自身防御机制植物在遭到病原菌侵染时，通过体内木质素和羟脯氨酸糖的沉积，植物抗菌素的积累，蛋白质酶抑制剂和溶菌酶的合成来增强细胞壁的保卫反应。另一方面，病原真菌在侵染过程中能诱导激发果实组织的形态和生理、分子水平发生显著变化（Kim et al., 2001; Snchez-Torres and Gonzlez-Candelas, 2003）。目前的一些研究显示，病原菌能够刺激果实SOD、PAL、POD等与抗病性密切相关的酶活性，分解果实自身抗菌物质，诱导果实几丁质酶和b-1,3-葡聚糖酶活性，以及刺激相关基因的表达（Yakoby et al., 2001）。1.3 果蔬采后病害的控制方法果蔬贮藏保鲜是果蔬生产减损、保值和增值的关键因素。特别是当果蔬受到机械损伤后，病原菌更容易进入伤口，导致病害的发生，所以有必要利用一些防治手段保护这些损伤位点，防止果蔬在储运过程中进一步的腐烂变质。根据国内外的研究报道，控制采后病害非杀菌剂的方法主要可分为生物学方法、物理方法和化学方法 3 大类。1.3.1 化学杀菌剂的使用目前，化学杀菌剂是防治果蔬采后真菌病害的主要手段之一。化学杀菌剂在全世界范围广泛使用，在欧洲和亚洲占农药市场的26%，但在美国只占6%。随着国家经济发展和消费水平的提高，人们对食品安全和环境保护意识的增强，化学杀菌剂的使用范围越来越受到限制。有许多研究报道，化学杀菌剂具有一定的毒副作用。美国国家科学院（NAS）的报道（1987）指出，杀菌剂的应用造成了人类健康的危害性，全美9种致瘤化合物的销售量占所有杀菌剂的90%左右，在用于食品的全部农药中，杀菌剂构成60%的致癌危险。这一报道导致了几种杀菌剂如克菌丹（Captan）和苯菌灵（Benomyl）等被美国环保机构所禁用，并部分或全部的自动退出采后应用市场。此外由于长期使用杀菌剂，病原菌进化并产生了大量抗药性菌种。因此，找到一种新的安全的可以替代化学杀菌剂，控制果蔬采后病害的新方法具有非常重要的意义。1.3.2果实采后病害物理防治果蔬采后病害防治物理方法主要有：热处理；低温冷藏；微波处理；气调；辐射处理；低压处理。低温冷藏技术已经在部分地区得到实际运用，热杀菌和辐照杀菌也是目前报道比较多的方法。低温冷藏是一种常用的保鲜技术。近几年来，低温冷藏技术又有新的发展，采用临界点低温高湿存储，即控制在物料冷害点温度以上0.51和相对湿度为9098的环境中存储保鲜果蔬。果蔬果实在不发生冷害的前提下，采用尽可能低的温度可以有效地控制果蔬果实在货架期内的呼吸强度，使某些容易腐烂的果实处于休眠状态；其次采取相对高湿的环境可有效降低果蔬水分蒸发而减少失重（刘忆冬等，2005）。冷藏技术最大的局限性在于低温只能抑制病原菌，不能根除，而且一些热带、亚热带果蔬果实在低温下冷害情况严重（任红等，2007）。由于低温贮藏、辐照处理和热处理等物理方法都需要特定的设备，这些方法在执行起来受到成本、产地、运输条件等限制。目前，在经济发达地区，低温贮藏链结合化学杀菌剂是比较成熟的商业采后处理技术。1.3.3果实采后病害生物防治从可持续发展的角度出发，开发新型、高效且安全的有机、绿色的保鲜剂具有重大的社会意义和广阔的应用前景。例如在美国，有机产品的产值已从1997年的35.7亿美元增长到了2005年145亿美元（Prange et al., 2006）。利用安全且有拮抗病原菌活性的微生物进行生物防治的方法近10年来已经取得了突破性的进展，被认为是最有希望替代化学杀菌剂的方法之一（Janisiewicz和Korsten,2002）。目前已经有4个基于拮抗微生物的生物防腐剂产品：Aspire（基于拮抗酵母Candida oleophila，美国），Yield Plus（基于拮抗酵母Cryptococcus albidus，南非），Bio-Save 10LP（基于拮抗细菌Pseudomonas syringae strain，美国）和Avogreen（基于拮抗细菌Bacillus subtilis，南非）（Janisiewicz和Korsten，2002；Fravel，2005）。利用拮抗酵母进行水果采后病害的生物防治具有许多其他方法无法比拟的优点：如遗传稳定，抑菌谱广，效价高；一般不产生对人和寄主有害的代谢产物，安全性高；对营养要求低，生长快；对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，能与多种化学和物理方法相容等（Janisiewicz和Korsten, 2002；Spadaro和Gullino, 2004）。它对于保护生态环境、减少食品农药残留、保障公众健康具有重要意义，因此成为当前国内外的研究热点。1.4 采后拮抗酵母作用机制根据已有的研究结果显示，微生物对病原菌有直接作用和间接作用两种方式，直接作用包括抗生作用和重寄生作用，间接作用包括营养和空间的竞争，胞外活性物质的产生和诱导抗性等。生防通常是一个以上的机制共同作用的结果。1.4.1营养和空间的竞争为了抑制病原菌的侵染, 拮抗菌必须在病原菌到达以前或到达以后的很短时间内在果实表面侵染部位占据优势。拮抗菌与病原菌争夺的营养物质主要是碳水化合物、氮源等。Filonow（1998）用14C标记的果糖、葡萄糖、蔗糖检验在苹果伤口处的拮抗菌罗伦隐球酵母（C. laurentii）、掷抱酵母（S. roseus）与病原菌灰葡萄孢孢子在营养利用上的差别，发现拮抗菌摄取和利用14C果糖的量越大，对分生孢子萌发的抑制作用越强，说明营养竞争是重要的生防机制。在对E. herbicola B66和B90抑制苹果青霉病和灰霉病的研究中发现，在稀释的苹果汁中，B66和B90能抑制灰葡萄孢和扩展青霉分生孢子的萌发并溶解其萌发管（Sobiczewski et al, 1996），但在未稀释的苹果汁里这些反应并不明显，说明营养竞争在这里起到了非常重要的作用。在国内，范青等的研究也发现将季也蒙毕赤酵母（P. guilliermondii）接种到桃果实的伤口上，在有病菌存在时该拮抗酵母菌的数量一天内可以猛增200多倍，这种高速的繁殖活动反映出拮抗菌与病原菌之间的营养竞争。Janisiewicz等（1992）报道在苹果等果实伤口处，糖类营养物质非常丰富，而作为氮源的氨基酸等则相对贫乏，成为竞争的焦点，通过向苹果伤口加入拮抗菌容易利用而病原菌难以利用的L-天冬氨酸和L-脯氨酸能显著提高拮抗效果。此外，酵母分泌的胞外多糖也能促进果实表面的粘结作用从而在空间竞争上占据优势(Andrews et al., 1994)。已有的研究结果显示，生防菌在果实伤口处接种越早，其对果蔬采后病原菌的抑制效果越好（Chand-Goyal and Spotts, 1997; Fan and Tian, 2001）。这也反映了营养与空间的竞争可能是海洋酵母抑制致病原菌的重要机理之一。营养和空间的竞争还被认为对病原真菌的次级代谢有作用（Bjornberg and Schnurer, 1993; Chand-Goyal and Spotts, 1996）。环境营养对病原菌的次级代谢，包括真菌毒素的产生具有重要影响（Luchese and Harrigan, 1996）。这可能是一些酵母拮抗菌能在体外试验中抑制霉菌菌丝生长的原因之一。比如Petersson和Schnurer（1995）发现P. anomala能在体外试验中减少P. roquefortii和亮白曲霉(Aspergillums candidus)的数量。1.4.2重寄生作用许多酵母拮抗菌可以分泌胞外水解酶（几丁酶，-1,3-葡聚糖酶等），从而分解病原菌的细胞壁或菌丝体。Gravese等（1998）报道P. anomala K对抑制苹果灰霉病非常有效，因为灰葡萄孢细胞壁能诱导其在苹果伤口上分泌的胞外-1,3-葡聚糖酶的量增加3倍。出芽短梗霉（A. pullulans）能显著抑制苹果等水果采后多种病原菌，Castoria R和Ippolito A等（2001）在出芽短梗霉（A. pullulans）处理过的苹果伤口上检测到了浓度更高的-1,3-葡聚糖酶和几丁酶活性。拮抗菌的快速定植和水果本身酶的诱导作用可能导致了胞外溶解酶的数量增加。但需要进一步研究这些酶的来源及其在生物防治中的作用。某些酵母菌还可以附着在病原菌上，形成对病原菌的直接寄生作用。Arras（1996）用电镜观察到拮抗菌无名假丝酵母(C. famata)可以在病菌菌丝上定植，并促使菌丝裂解。EI-Ghaouth（2000）发现拮抗菌C. saitoana在苹果伤口处可以紧紧吸附在灰葡萄孢的菌丝上。这些吸附现象不能完全说明在拮抗菌与病原菌之间有重寄生作用，但可以肯定这种现象与拮抗菌的生理活动紧密联系，因为经过热杀死的拮抗菌不再有吸附现象发生。1.4.3胞外活性物质的产生一些研究结果显示，拮抗菌与病原菌互作时, 在果实伤口部位生长的酵母细胞外围有大量的新生物质。这些胞外活性物质可能参与了拮抗菌与病原菌之间的相互作用（表1.1）。抗生素名称产生菌株针对病原菌蒿属香豆素、东莨菪亭无名假丝酵母(C. famata)指状青霉毒性蛋白(killer protein)毕赤酵母属(Pichia sp.)抗细菌物质罗伦隐球酵母（C. laurentii）荧光假单胞菌、Staphylococcus aureus挥发性物质乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)扩展青霉表1.1 主要产胞外物质菌株1.4.4诱导抗性近5年来，拮抗菌诱导采后果实抗性成为了生物防治的研究热点。已有的大量研究表明，多种生防菌，包括出芽短梗霉（A. pullulans）、C. saitoana、C. oleophila、膜醭毕赤酵母（P. membranefaciens）和罗伦隐球酵母（C. laurentii）等均能诱导多种果实的抗性及抗性相关反应，提高果实自身抗性，减少采后腐烂（表1.2）（Filonow, 1999, 2001; Ippolito et al., 2000）。生防菌作为激发子，具有生物可降解和性价比高等优良特点，因此具有良好的应用前景。1.4.5抗生作用通过拮抗菌产生抗生素抑制病原菌作用是人们最早发现的一种拮抗机理，也是大多数拮抗细菌最主要的机制之一（表1.3）（Janisiewicz and Roitman, 1988; Janisiewicz et al., 1991）。但是，在体外试验中能产生抗生素的菌株中很大一部分不能在体内试验中产生抑菌效果，这是由两方面的原因造成的：有些细菌只能在“in vitro”环境中产生抗生素，而在“in vivo”则不产生抗菌素；一些细菌不适应寄主伤口的环境，不能存活或生命力下降，因此不能产生很好的拮抗效果。而且能在寄主上保持拮抗能力的细菌仍具有两个弊病：首先，抗生素有可能诱导病原菌产生抗性，从而逐步降低拮抗菌对病害的控制效果；其次，拮抗菌产生的抗生素对食用者也可能产生不利影响。因此进入20世纪90年代以后，拮抗菌的研究重点逐步从拮抗细菌转向了拮抗酵母。表1.2 采后拮抗菌对果实抗性的诱导及对抗性相关反应的刺激果实拮抗菌备注苹果出芽短梗霉C. saitoana刺激果实几丁质酶、葡聚糖酶和POD诱导抗性，并刺激果实几丁质酶、b-1,3-葡聚糖酶分泌b-1,3-葡聚糖酶柚子柑橘C. oleophila诱导抗性，并刺激果实乙烯、PAL, 几丁质酶、b-1,3-葡聚糖酶、积累植保素等刺激果实硫还原蛋白基因表达刺激几丁质酶cDNA的表达刺激b-1,3-内葡聚糖酶基因表达草莓出芽短梗霉诱导抗性樱桃番茄膜醭毕赤酵母刺激果实POD，降低CAT和SOD，提高总蛋白，增强33和47kDa 蛋白刺激果实几丁质酶、b-1,3-葡聚糖酶桃、梨、枣、苹果罗伦隐球酵母诱导果实抗性；刺激果实几丁质酶、b-1,3-葡聚糖酶、POD和PAL活性刺激果实b-1，3-葡聚糖酶基因表达表1.3 主要产抗生素菌株抗生素名称产生菌株作用对象病原菌伊枯草菌素枯草芽孢杆菌B-3核果类水果M. fructicola吡咯菌素洋葱假单胞菌(P. cepacia) LT-4-12W梨果、柑橘核果类水果扩展青霉、灰葡萄孢丁香霉素E丁香假单胞杆菌ESC-10和ESC-11（BioSave）柠檬吡喃酮木霉草莓、苹果灰葡萄孢1.5拮抗菌生理调控及机理的研究近年来，随着拮抗菌和病原菌之间的细胞学、生物化学和分子生物学研究的不断深入发展，研究者发现通过调节采后拮抗酵母的生理代谢机制可能是增强其拮抗能力的有效途径之一（Janisiewicz和Korsten, 2002）。根据有限的已发表资料，关于采后拮抗菌生理调控及机理的研究可概括为以下三个方面：1.5.1逆境培养Teixid等（1998）研究表明通过低水分活度培养Candida sake后其在采前使用时生长数量明显增加并增强了酵母的拮抗效力，其机理与积累糖醇和海藻糖有关；Bonaterra 等（2005）报道在培养基中添加NaCl后能提高P. agglomerans EPS125在不同湿度贮藏条件下的生防效力，作用机制也与拮抗菌体内海藻糖等物质的积累有关。西班牙XaRTA-postharvest实验室的研究者发现经盐胁迫诱导培养的P. agglomerans CPA-2在冷冻干燥或喷雾干燥后，细胞的存活率比未经诱导培养的菌株有显著的提高，且冻干粉单独使用或结合佐剂Fungicover使用，对果实病害的抑制效果均显著高于未经胁迫的新鲜酵母。1.5.2拮抗物质的分泌和积累阿根廷学者发现粘红酵母（Rhodotorula glutini)产生的一种酸（rhodotorulic acid）能抑制许多病原真菌，而且发现整合使用rhodotorulic acid和该粘红酵母能增强其对果实病害的控制（Calvente et al., 2001；Sansone et al., 2005）。Li等（2006，2007）报道通过海藻糖培养罗伦隐球酵母（C. laurentii）后能在该酵母细胞内积累较高水平的海藻糖，并发现经过这种处理后罗伦隐球酵母控制苹果青霉病的效力显著增强，同时发现这种处理还能提高该酵母在冻干后的存活率。1.5.3基因工程技术的应用利用分子生物学和基因工程的手段研究拮抗菌的遗传背景并开展相应分子水平的改造是生物防治领域的一个研究热点，通过基因工程技术转化具有抑制病原真菌活性的蛋白和代谢产物也是提高拮抗酵母效力的重要途径（Janisiewicz和Korsten，2002），但其前提是拮抗微生物遗传背景的明确、转化方法的建立和转化目标的确定等。近年来国际上已有研究采后拮抗酵母的分子特征和利用基因工程改造采后生物防治酵母的研究报道，但总体上成功的报道还很有限。1.6 本课题研究目的近年来，采后生物保鲜剂的发展遇到了瓶颈。现在全球只有几种基于拮抗酵母的生物保鲜剂。而原有的两种基于酵母的生防制剂Aspire TM（Ecogen，US）和YieldPlus（South Africa）已经退出了生物保鲜剂的市场。拮抗酵母生防制剂商品化发展缓慢主要有两个原因。一是拮抗酵母单独作用时，效果还无法与化学杀菌剂相比，二是采后贮藏是一个长期的过程，酵母制剂的生防效果和货架寿命受到了采收、处理、包装和销售等多个环节诸多因素的影响（Janisiewicz et al., 2002；Spadaro et al., 2004）。本试验目的是解决瓶颈问题之一，探讨通过在培养基中添加几丁质等培养酵母R. paludigenum提高其拮抗效力的可行性，以提高酵母的生防效果。研究几丁质诱导后R. paludigenum对苹果、梨采后主要真菌病害扩展青霉（P. expansum）体内的抑制效果，筛选出最佳诱导剂量及诱导时间，并结合其他诱导因子为苹果、梨采后病害提供一种安全、经济有效的防治方法，并对可能存在的相关机理，包括促进酵母菌生长、分泌抗菌物质和诱导抗性等进行系统研究。1.7应用前景和学术价值利用拮抗酵母对水果采后病害进行生物防治是目前国内外研究的热点，其对于保护生态环境、减少食品农药残留、保障公众健康具有重要意义。但是要实现拮抗酵母的商业化推广应用，迫切需要解决的问题是提高其生物学效力。利用病原真菌细胞壁制品是研究采后拮抗酵母机理的重