异相体系中低分子量壳聚糖的制备毕业论文.doc

青岛科技大学本科毕业设计（论文）1. 绪论1.1引言甲壳素又名甲壳质、几丁质，是地球上除蛋白质外数量最大的含氮天然有机化合物1，是存在于自然界中唯一一种带阳离子且能生物降解的高分子材料2-3。据估计，甲壳素的贮藏量是纤维素的三分之一，是一种极具潜在实用价值，可再生利用的自然资源。人体内虽然不含有甲壳素和壳聚糖，但是却含有甲壳素酶和壳聚糖酶，所以人体能降解甲壳素和壳聚糖1,4。甲壳素广泛存在于海洋节肢动物，如虾、蟹的甲壳之中，也存在于菌类、昆虫类、藻类细胞膜和高等植物的细胞壁中，其分布极其广泛。虽然甲壳素在自然界的存在量巨大，然而直到1811年，才被法国研究自然科学史的Braconnot发现。1823年，另一位法国科学家Odier从昆虫的甲壳中分离出同样的物质，命名为chitin(甲壳素)。1859年，法国人C.Rouget将甲壳素浸泡在浓KOH溶液中煮沸，取出洗净后发现其可溶于有机酸中；1894年，F.Hoppe-Seiler将这种脱掉了部分乙酰基的甲壳素命名为Chitosan，即为“壳聚糖”。从1811年发现甲壳素到1859年发现壳聚糖，直到1910年的100年间，全世界仅有不到20篇有关甲壳素和壳聚糖的论文发表，开创性的工作大多由法国人完成。中国是1952年开展甲壳素研究的，1954年第一篇研究报告发表。1958年国内首先将可溶性甲壳质作为印染助剂应用于印染工业。后来研究工作一度停止，直到20世纪80年代中期，国内逐渐开始加大对甲壳素、壳聚糖研究工作的宣传力度，影响较大的有1983年谢雅明5和1984年严俊的文章，较为详细的综述了壳聚糖的有关性质与应用，对中国的甲壳素研究热潮起到了推动作用。“十一五”期间，科学技术部发布了“高靶向缓释纳米医药制剂研发”、“纳米生物材料研发”、“纳米生物器件研发”和“新型海洋生物制品研究开发”重点项目申请指南，甲壳素和壳聚糖在这些方面的应用受到了高度关注。我国对甲壳素和壳聚糖的研究多年以来取得了蓬勃的发展，已成为世界上甲壳素和壳聚糖生产量最大的国家，但是长久以来仅用于出口国外，在深加工和研制开发新产品上，和国外相比仍有很大的差距。1.2壳聚糖的理化性质1.2.1壳聚糖的结构甲壳素是一种天然高分子化合物，属于碳水化合物中的多糖。其化学名称为-（1,4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，是N-乙酰氨基葡萄糖通过-（1,4）糖苷键缩合而成的，其结构式如图1-1。图1-1: 甲壳素的结构Fig.1-1: The structure of chitosan壳聚糖是甲壳素的N-脱乙酰基产物，是甲壳素最重要的衍生物，化学名称是-（1,4）-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，其结构式如图1-2。 图1-2:壳聚糖的结构Fig.1-2: The structure of chitosan天然甲壳素分子中约有12.5%的氨基没有N-乙酰化，在用酸、碱分离，提取时，又有一些N-乙酰基被脱除，因此我们通常制备的甲壳素，实际上已被脱除了15% - 20%的N-乙酰基。一般而言，甲壳素的N-乙酰基脱去55%以上的就可称之为壳聚糖。作为工业品的壳聚糖，N-脱乙酰度在70%以上。根据脱乙酰度的不同，壳聚糖又被划分为低脱乙酰度壳聚糖（N-脱乙酰度为55%-70%）、中脱乙酰度壳聚糖（70%-85%）、高脱乙酰度壳聚糖（85%-95%）、超高脱乙酰度壳聚糖（95%-100%）6。1.2.2壳聚糖的物理性质甲壳素是白色或灰白色无定型、半透明固体，溶解性极差，不溶于水、稀酸、稀碱及绝大部分溶剂，仅溶于纯甲酸、甲磺酸、二氯乙酸、六氟异丙醇、六氟丙酮这些溶剂以及5%氯化锂/二甲基乙酰胺（或N-甲基-2-吡咯烷酮）、1,2-二氯乙烷/三氯乙酸（重量比6.5:3.6）等混合溶剂体系7。壳聚糖外观为白色或灰白色，略有珍珠光泽，呈半透明的片状固体，不溶于水和碱溶液，可溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸。在酸性溶液中，壳聚糖分子链上氨基的氮原子上具有一对未共用的电子，致使氨基呈现弱碱性，能从溶液中结合一个氢离子，从而使壳聚糖成为带正电荷的聚电解质（实际上可看作是一种高分子盐），其分子间和分子内的氢键被破坏而溶于水中。因此，实际上不是壳聚糖溶于酸中，而是带正电荷的壳聚糖聚电解质溶于水中。在稀酸中，壳聚糖的主链也会缓慢水解，致使其黏度和分子量的降低，因此壳聚糖溶液要求现用现配。影响壳聚糖溶解性的因素主要有：壳聚糖的脱乙酰度、相对分子质量和酸性介质的种类。脱乙酰度越高，分子链上的游离氨基越多，离子化强度越高，也就越易溶于水；反之，脱乙酰度越低，溶解度越小。 壳聚糖因原料不同和制备方法不同，相对分子质量从数十万到数百万不等，壳聚糖分子在分子内和分子间形成许多强弱不同的氢键，使分子链彼此缠绕在一起且比较僵硬。相对分子质量越大，缠绕越厉害，溶解度越小。另外，相对分子质量不但影响其溶解性，也影响一些特殊性质如液晶性、流变性和成膜性等。壳聚糖溶于一些有机酸和低浓度的无机酸，但不溶于稀硫酸、稀磷酸，如果把壳聚糖与稀酸的作用看成是形成了一种高分子盐，那么，有的盐能溶于水，有的盐就不能溶于水。另外，壳聚糖具有缩醛结构，在酸性环境中可发生降解，导致溶液黏度降低，如果加入甲醇、乙醇、丙酮等，可延缓其黏度降低，尤以乙醇的作用明显。加热和搅拌能促进壳聚糖的溶解和降解，如果温度高，时间长，酸浓度大，搅拌太激烈，则壳聚糖分子链降解更厉害。总的来说，溶解性差、难于找到合适的溶剂，是限制甲壳素和壳聚糖应用的主要原因。 1.2.3壳聚糖的化学性质1.2.3.1 酰化 甲壳素和壳聚糖可与多种有机酸的衍生物如酸酐、酰卤(主要是酰氯) 等反应，导入不同相对分子量的脂肪族或芳香族酰基。壳聚糖分子链的糖残基上既有羟基，又有氨基，因此，酰化反应既可在羟基上发生，生成酯，也可在氨基上发生，生成酰胺。酰化反应究竟先在哪个官能团上发生，与反应溶剂、酰化试剂的结构、催化剂、反应温度等因素有关。甲壳素分子内和分子间强大的氢键使结构特别紧密，酰化反应很难进行，一般要用酸酐作酰化试剂，相应的酸作反应介质，在催化剂催化并且在冷却下进行。壳聚糖分子结构中有很多氨基，破坏了一部分氢键，酰化反应比甲壳素要容易得多，一般不用催化剂，反应介质常用甲醇或乙醇。1.2.3.2 氧化 甲壳素和壳聚糖的每个糖残基上有两个羟基，壳聚糖的糖残基上还有一个氨基，都易被氧化剂氧化，氧化反应过程很复杂，氧化剂的种类不同，反应的pH值不同，氧化机理和氧化产物也不同，既可使C6-OH氧化成醛基或羧基，也可使C3-OH氧化成羰基（成酮反应），还可能发生部分脱氨基或脱乙酰氨基，甚至破坏吡喃环及糖苷键。1.2.3.3 醚化 甲壳素和壳聚糖的羟基可与烃基化试剂发生反应生成醚，如甲基醚、乙基醚、苄基醚、羟乙基醚、羟丙基醚、氰乙基醚、羧甲基醚等。壳聚糖在碱性介质中与硫酸二甲酯反应生成甲基醚，产物主要是羟基取代，生成醚，也有少量氨基取代，生成N-甲基壳聚糖。如果用卤代烷与壳聚糖反应，则N-烷基化反应较多，O-烷基化次之，因此，若壳聚糖的氨基不加以保护，在醚化反应中首先发生的是N-烷基化。 1.2.3.4含氧无机酸酯化 甲壳素和壳聚糖的羟基，尤其是C6-OH，可与一些含氧无机酸（或其酸酐）发生酯化反应，这类反应类似于纤维素的反应，如：生成硫酸酯、磷酸酯和硝酸酯都属于酯化反应。酯化反应的位置控制，在理论上是很有意义的。甲壳素是一种结构复杂的高分子化合物，结晶度高，分子量大，C6-OH和C3-OH的活性虽有不同，但差别不是很大，尤其是都不能在均相中反应，因此，酯化反应的位置较难控制。1.2.3.5 氨基取代衍生物 壳聚糖的氨基是一级氨基，具有一孤对电子，具有很强的亲核性，既能发生N-烷基化反应也能发生N-酰化反应。甲壳素的乙酰氨基的N上只有一个H，很稳定，但在一些强烈的条件下，也能发生取代反应。 N-烷基化：壳聚糖与卤代烷的O-烷基化反应时，首先发生的是N-烷基化，如壳聚糖与环氧衍生物的加成反应，得到的是N-烷基化衍生物，这个反应的特点是同时引进了两个亲水性的羟基。壳聚糖与环氧丙醇反应，生成的产物引进了两个亲水性羟基，易溶于水。图1-3 壳聚糖的N-羟烷基化Fig.1-3 N-hydroxyalkylation of chitosan 希夫碱：壳聚糖在中性介质中很容易与芳香醛（或酮）、脂肪醛反应生成希夫碱。该反应可用于保护氨基，在羟基上进行各种反应，待反应结束后再脱掉保护基；另外，有一些特殊的醛形成的希夫碱，经氰硼化钠还原，可合成一些很有用的壳聚糖氨基取代衍生物。季铵盐化：壳聚糖分子链上有氨基，与季胺化试剂（如CH3I）反应可以一系列季胺盐。高分子季铵盐作为阳离子表面活性剂，金属离子的捕集剂，离子交换剂，絮凝剂，抗菌素等，发挥了许多作用，近二十多年来，它又成为相转移催化反应的催化剂，引起更多的注意。1.2.3.6 螯合 甲壳素和壳聚糖的糖残基在C2上有一个乙酰氨基或氨基，在C3上有一个羟基，从构象上来看，平伏键这种特殊结构，使得它们对具有一定离子半径的一些金属离子在一定的pH值条件下具有螯合作用，尤其是壳聚糖，与金属离子的螯合更广泛一些，更具特色，甲壳素和壳聚糖是一类新的天然高分子螯合剂，而且无毒、无副作用。 甲壳素中氨基上乙酰基的存在，影响了对金属离子的螯合作用，所以甲壳素对金属离子的螯合作用都不如壳聚糖的螯合作用好。 1.2.3.7对酸的吸附壳聚糖的碱性由氨基葡萄糖残基上的氨基决定。氨基氮原子上的未共用电子能结合溶液中的H+形成铵盐。许多无机酸、有机酸和酸性化合物，甚至两性化合物，都能被壳聚糖吸附结合。壳聚糖的吸附性可应用于食品、药品、生物制品的脱酸，避免用碱中和而增加盐分；或从溶液、发酵液中提取酸性化合物，如氨基酸、核苷酸、青霉素等。 在pH=4.5时，甲壳素是不吸附乙酸的，可用甲壳素处理食醋的杂质提高其质量而不会降低醋的酸度。除此之外，甲壳素也能在碱性缓冲溶液中通过形成氢键而吸收阴离子化合物。1.2.3.8 接枝共聚 甲壳素和壳聚糖分子链上的活性基团很多，可以进行接枝共聚反应，从而改进它们的性能，满足特殊的需要。甲壳素、壳聚糖的接枝共聚物，是以天然聚合物（多糖链）为主链和以合成聚合物为侧链的半合成聚合物，兼具天然聚合物和合成聚合物的某些性质。接枝共聚反应一般有化学法、辐射法和机械三种，从反应机理来说，又可分为自由基引发接枝和离子引发接枝。 1.3分子量对壳聚糖性质的影响壳聚糖是一种大分子多糖，分子量通常在几十万左右，而低聚壳聚糖的分子链短、分子量下降。研究结果表明，壳聚糖的分子量对其物理、化学、生物性质均有很大影响，只有当分子量降到一定程度时，壳聚糖许多特殊功能才表现出来。1.3.1分子量对其物理性质的影响(1) 溶解性 壳聚糖分子链结构中含有大量氨基和羟基。相对分子质量越大，分子链缠绕越厉害，溶解度越小。低分子量壳聚糖分子内的氢键作用减弱，链长度和分子构象的变化使壳聚糖在水溶液中的无序性增加，从而增大其溶解性。 (2) 液晶性 汪剑伟等人8研究发现：相对分子量越大，重复单元越多，分子构象持续长度越大，则临界浓度越低；三种壳聚糖在适当浓度的二氯乙酸溶液中都能呈现胆甾液晶相，随着相对分子量增大，平均螺距减小。 (3)流变性 王伟与徐德时9研究了壳聚糖分子量对其溶液流变性质的影响，结果表明在壳聚糖稀溶液中，其相对分子量变小，分子链变短，键之间的缠结减少，表现出更好的流动性。 (4)成膜性 壳聚糖具有良好的成膜性，广泛应用于生物医学工程中。韩宝芹等人10研究表明：壳聚糖膜的各种特性与其相对分子量有很大关系，高分子量的壳聚糖膜表面较为光滑，透光性较好，但透气性、渗透性和生物降解性较差低相对分子量的壳聚糖膜表面较为粗糙，透气性、渗透性和生物降解性较好，但透光性较差。1.3.2分子量对其生理活性的影响（1）吸湿、保湿性壳聚糖分子中存在游离-OH和-NH2，具有良好的氢键成键性，可与介质中的H2O形成氢键，起到吸湿、保湿的作用。低聚壳聚糖的该性能较高分子量壳聚糖更优。夏文水和吴焱楠11研究了不同分子量低聚糖的保湿性、吸湿性。结果表明:平均分子量为1500和3000的壳聚糖具有优良的吸湿保湿性，其吸湿保湿性优于透明质酸、乳酸钠和甘油。（2）抗菌抑菌性 低分子量的壳聚糖对细菌、真菌感染的免疫力比高分子量的强，能更有效地抑制细菌生长，在抗菌抑菌方面具有很好前景。杨冬芝等人12研究壳聚糖分子量(5103-1.08106)对大肠杆菌的影响时发现，随着分子量增加，壳聚糖抗菌活性先增加而后略有减弱，转折点在9.16104左右。 （3）降血脂性壳聚糖具有降血脂和降胆固醇作用，口服后能与胆酸盐及其它脂类物质结合，从而抑制它们在肠道的吸收并使其排出体外。额外的胆固醇在体内通过代谢转化成胆酸，以补偿被排掉的部分，从而减少体内胆固醇，降低血脂。由于壳聚糖不溶于水，高分子量的壳聚糖对胆酸盐的结合效率低，需要较大的口服剂量才能显示出降血脂效果。吴雁等人13将壳聚糖进行降解，得到了低分子量的水溶性壳聚糖，并进一步衍生化，其产物降血脂性能随之提高。（4）抗癌活性壳聚糖具有强烈的吸附作用，能很好地被吸附在血管壁细胞的表面，使癌细胞失去载体，并加强人体免疫系统中的T细胞、B细胞、巨噬细胞、NKC(自然杀伤细胞)、CAKC(染色体畸变杀伤细胞)的功能，提高机体免疫力，从而杀灭癌细胞，抑制癌的复发。研究表明低聚壳聚糖能更有效抑制癌细胞的繁殖，抗癌抑癌作用更加显。1.4低分子量壳聚糖制备方法研究进展 壳聚糖分子量的大小对壳聚糖的很多物理化学性质尤其是壳聚糖的生理活性有着很大的影响，因此，如何高效、便捷地制备低聚壳聚糖，甚至根据需要制备所需分子量范围的壳聚糖成为人们研究的热点。目前，制备低聚壳聚糖的方法主要有化学降解法、物理降解法、生物降解法，联合降解法和真菌提取法是近几年新发展起来的降解方法。1.4.1化学方法1.4.1.1酸法降解酸法降解壳聚糖是一种最基本和最简便的方法。降解反应的机理为:酸水解后生成H+，H+与壳聚糖分子中的游离-NH2相结合，致使壳聚糖分子内与分子间的氢键发生断裂，而且壳聚糖主链上的b-(1,4)糖苷键发生断裂，形成很多不同分子量的壳聚糖分子的片段，严重水解则大部分变成单糖。目前，酸降解法主要有盐酸水解法、磷酸水解法、乙酸水解法、氢氟酸水解法、亚硝酸水解法、浓硫酸水解法14和过醋酸水解法，另外还有三氯乙酸、过氧乙酸、甲酸法等。采用酸降解法价格便宜，操作简单，易于实现产业化。但是降解过程较难控制，得到的壳聚糖分子量不等，分离纯化困难。虽然这种方法早已用于工业化生产，各种分子量范围的壳聚糖产品都能得到，但要得到特定分子量范围且具有较高收率的壳聚糖产品还是比较困难的，并且反应中所采用的大量浓酸会腐蚀反应设备，还会造成严重的环境污染。1.4.1.2氧化降解氧化降解法是近年来国内外研究最多的壳聚糖降解方法。目前报道的氧化降解法主要有过氧化氢降解法15、过硫酸钾降解法、亚硝酸盐降解法、过硼酸钠降解法、次氯酸钠降解法、臭氧降解法、二氧化氯和氯气降解法等。其中，过氧化氢氧化降解具有反应速度快、产率高、反应物无毒、易处理、成本低、对环境友好，易于实现工业化生产等优点，是目前研究和生产应用最多的一种降解方法。过氧化氢氧化降解壳聚糖的机理为：H2O2 HO2- + H+H2O2 + HO2- HO+O2-+H2OHO和O2- 作用于壳聚糖主链上的b-(1,4)糖苷键，对壳聚糖具有强的氧化降解作用，并且此反应在酸性、中性及碱性条件下均可进行。在酸性溶液中，壳聚糖分子溶解，分子间与分子内的氢键断裂，分子伸展，整个分子上的基团对过氧化氢来说都是可及的，降解为均相反应，因而起始反应速度较非均相快。但并非酸度越强越好，这是因为在强酸体系中，壳聚糖上的大部分氨基与H+结合生成R-NH3+，形成缺电子的体系，而过氧化氢的氧化降解多发生在氨基未结H+的糖单元的b-(1,4)糖苷键上，降解到一定程度后，分子变小，自由氨基的数量大大减小，导致后来降解困难。因而选取一定浓度的弱酸，使壳聚糖既可以溶解又不大量形成R-NH3+，就可以实现降解迅速、降解产物相对分子质量低的目标。反应温度是影响壳聚糖降解一个重要因素。整体来说，壳聚糖的过氧化氢氧化降解是一个吸热反应，升高温度有利于降解反应，但是随着温度的升高，产物的颜色也逐渐加深。在温度高于75后，长时间反应产物会出现褐色沉淀。这可能是氧化过度，糖环断裂所致。在过氧化氢氧化降解的方法中，壳聚糖的脱乙酰度越高，完全降解为水溶性产物的时间就越短，这是因为过氧化氢作用点只是近靠连有自由氨基糖环的-(1, 4)糖苷键。另外，反应时间、过氧化氢用量、反应介质及弱酸的浓度等都可对降解产物的分子量、色泽以及产率等产生影响。研究得出各降解条件对产物脱乙酰度的影响大小依次为：反应介质反应温度介质浓度过氧化氢用量比R反应时间；对产物特性黏度即分子量的影响大小依次为：反应介质反应时间反应温度介质浓度过氧化氢用量比R。通过对正交实验数据的分析得出制备较好的水溶性壳聚糖的反应条件：反应介质为2%的乙酸溶液，过氧化氢用量比R为1.0，反应温度为80，反应时间为2h。但是此条件组合并非是固定的，不同的工作者应用不同的壳聚糖原料进行不同的正交试验会得出不尽相同的工艺优化组合。过氧化氢单独使用时电离产生活性自由基的过程较慢，氧化效果不好。为了克服这一缺点，又发展了一些新的过氧化氢降解技术。采用NaC1O/H2O2为混合氧化剂，以协同氧化方式对壳聚糖进行氧化降解，可得到不同相对分子质量大小的低聚糖。协同氧化降解反应较好控制，使反应的转化率及降解产物的氨基含量得到保证。在紫外光照射下，过氧化氢氧化降解壳聚糖可制得相对分子质量为2.8万左右的水溶性壳聚糖。在超声波条件下，过氧化氢降解壳聚糖的反应能在较低的温度下进行，降解反应速度提高近3倍，且产物白度令人满意。黄金凤等人16在异相体系的条件下，采用磷钨酸作为催化剂协同双氧水进行降解反应，得出反应的最佳条件为:H2O2浓度为2.7mol/L，反应温度为90，反应时间为20min，催化剂与壳聚糖质量比为0.01。在这一最佳反应条件下制得黏均分子量为1.2104左右的水溶性壳聚糖。用低浓度的过氧化氢降解部分脱乙酰化的甲壳素和壳聚糖，发现平均相对分子质量的降低符合一级反应动力学，过氧化氢降解反应较微波降解和酶水解快。壳聚糖中痕量的过渡金属离子和氨基对-(1, 4)糖苷键的断裂非常重要。壳聚糖经过氧化氢降解后，结构没有明显变化，且随壳聚糖相对分子质量的降低，其稳定性增强。过硼酸钠降解法是一种氧化降解壳聚糖的简单方法。此法是将壳聚糖与NaBO3水溶液进行非均相的降解反应，氧化断键发生在-(1,4)糖苷键上。反应的最终产物色泽纯白或者微黄，水溶性良好。该法的最大优势在于降解反应前后壳聚糖的自由氨基含量不发生任何的变化，壳聚糖环结构保持完整。此外，将壳聚糖溶于稀酸溶液中，然后通入一定量的Cl2进行降解反应，反应结束后，加入NaBH4和NaOH处理，或者是将0.05%的ClO2溶液加到壳聚糖的乙酸溶液中，于60下进行降解反应,均可得到无色的低聚糖产品。氧化降解存在的主要问题是在降解过程中引入了各种反应试剂，会产生有色副产物，从而增加了控制降解副反应及降解产物分离纯化的难度。1.4.1.3 其他方法降解壳聚糖的重复单元上有氨基和羟基，这些基团与金属离子具有较好的配位能力。因此，采用壳聚糖先与金属离子配位后再降解的方法，可制备相对分子质量分布较窄的低聚壳聚糖。该反应条件温和，降解产物相对分子质量易于控制。另外，人们已采用化学合成法合成特殊结构的低聚壳聚糖。1999年，Antje Rottmann等利用几丁质酶制备了壳聚糖和低聚壳聚糖的杂环衍生物；2002年，Fridman Micha等运用一锅煮的方法制备了低聚壳聚糖，其中三糖和四糖的产率在51%-80%之间，化学合成法的优点是可以根据自己的需要来设计寡糖。1.4.2物理方法物理方法降解壳聚糖包括热降解、辐射降解、光降解、超声波降解和微波降解法等。物理降解法速度快、无副产物、无环境污染，是较理想的高聚物降解方法。主要方法有以下几种：1.4.2.1 热降解Tang等人17将壳聚糖置于280环境下进行热降解，研究发现降解后的壳聚糖在1590cm-1处对应的氨基吸收减弱，1650cm-1处对应的乙酰基吸收增强，这些变化可能是吡喃环受热后被破坏所引起，还可能由于大量壳聚糖链发生热交联所引起；并且热降解后，893cm-1、1153cm-1对应的糖的特征吸收减弱，并且峰行变宽，这些信息表明壳聚糖热降解后-(1,4)糖苷键断裂。壳聚糖受热后主链可能发生了无规降解，在C1-O-C4链上某点先发生断裂，主链与乙酰氨基侧链可能存在交互作用，从而促进了主链的无规降解。1.4.2.2 射线辐射降解在一定辐射剂量照射下，射线能有效降解壳聚糖，得到低分子量的壳寡糖。以2-200kGy的辐射量辐射溶解在2%乙酸溶液中的壳聚糖，随辐射量的增加，其溶液黏度下降，在辐射量增至10kGy前，溶液黏度下降迅速，之后溶液黏度变化幅度减缓。随着辐射量的增加，产物的颜色逐渐加深。另外，脱乙酰度高的壳聚糖相对分子质量要下降得快一些。用射线照射壳聚糖进行辐射降解的反应遵循无规降解动力学规律，降解过程中壳聚糖的脱乙酰度略有升高，降解反应主要由壳聚糖分子链上的C1-O-C4键断裂引起，在降解过程中生成了-内酯结构的端基。样品的UV和FT-IR分析表明，辐照后除在壳聚糖分子链端生成羰基外，壳聚糖主链结构未见变化，脱乙酰度也没有显著改变，显示出辐射降解是一种有效控制壳聚糖相对分子质量的方法。1.4.2.3 光降解紫外线、可见光和红外线对壳聚糖进行照射也可以引起壳聚糖的降解反应，此为光降解。当辐照光的波长小于360nm时降解反应尤为明显。IR分析表明，光降解过程中壳聚糖分子链上的乙酰氨基葡萄糖单元发生了脱乙酰化反应，导致自由氨基数量增加，同时-(1, 4)糖苷键断裂，降解过程中会生成羰基。对比超声波、紫外光和射线辐射作用的壳聚糖水溶液，发现紫外光降解壳聚糖是最有效的。紫外光降解反应可能是自由基降解机理。1.4.2.4 微波降解采用微波降解壳聚糖可使甲壳素脱乙酰化反应与壳聚糖降解反应同时进行，这样既可降低甲壳素脱乙酰化过程中碱的用量，减少生产成本，缩短生产周期；又可通过改进工艺技术实现对环境无污染绿色生产。在微波照射下，添加一些无机盐，可有效地提高壳聚糖的降解速度，其降解物的分子质量比用传统加热方法制备的要低。此方法能够降低能耗、减小污染、节省时间、具有好的产业化前景。1.4.2.5 超声波降解超声波对壳聚糖的降解加速作用归功于超声波的“声空化”作用。这种声空化作用主要表现为:(1)声机械效应:超声波在媒质中传播时引起媒质质元振动，使位移速度加快，分子碰撞速度加快，同时对质点施加较大的冲击力，导致分子链断裂；(2)声热效应:超声波在媒质中被吸收，使部分声能转化为热能，有利于降解反应；(3)超声化学效应:超声波通过媒质时，由于产生强烈的分子碰撞，导致分子电离及其他化学反应。对壳聚糖的降解反应，主要是超声波的机械效应和热效应在起作用。另外，超声波能够加强体系内的传质效应，使体系高度均一化，不仅能够大大缩短降解时间，而且超声波降解产物的相对分子质量应该具有较窄的分布。用超声波对壳聚糖进行降解，反应温和，可在低温下进行，作用十分明显。升高温度和延长照射时间有利于降低产物的相对分子质量。另有研究表明，延长超声波的作用时间，可以使降解产物的相对分子质量分布明显变窄，从而得到较为均一的低相对分子质量壳聚糖；同时，降解过程中壳聚糖的氨基含量不随降解时间而变化。1.4.3 生物方法生物降解是指利用生物技术使壳聚糖发生降解生成低聚寡糖，主要有酶降解法和糖基转移法。1.4.3.1 酶降解法酶法降解壳聚糖，就是用特定的酶对壳聚糖进行降解，特定的酶可以选择性地切断壳聚糖分子中的-(1,4)糖苷键，从而制得特定分子量的低聚壳聚糖，克服了化学降解产物分子量分布宽、均一性差的缺点。与其他降解方法相比，酶降解法不发生副反应，不需要加入大量的反应试剂，反应条件温和，工艺较易控制，对环境污染较小，是一种较为理想的降解方法。目前，已发现有几十种酶能用于壳聚糖的降解。酶降解法可分为专一性酶降解法和非专一性酶降解法。(1)专一性酶降解法专一性酶主要是指甲壳素酶和壳聚糖酶。甲壳素酶广泛分布于细菌、真菌、放线菌等多种微生物及植物组织和动物的消化系统中18。该酶系一般被诱导为多酶复合体：即甲壳素外切酶、内切酶和-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。甲壳素酶降解甲壳素的途径为：先由降解酶系统水解甲壳素的糖苷键，如外切酶从甲壳素分子链的非还原端开始，以甲壳二糖为单位，依次酶解；内切酶则随机水解糖苷键；由外切酶水解成的甲壳二糖，被-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水解成单糖，有些-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶也有较弱的外切酶活性，也是从甲壳素的非还原端开始直接水解成单糖。壳聚糖酶主要存在于真菌细胞中，根据作用模型可分为外切型和内切型两种，内切型壳聚糖酶以释放二聚体、三聚体或低聚糖为主，外切型则从壳聚糖的非还原末端产生单糖残基即氨基葡萄糖。(2)非专一性酶降解法近年来，研究发现许多种酶如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、葡萄糖酶和胰酶等对壳聚糖具有非专一性水解作用，也可用来催化水解壳聚糖得到低相对分子质量产品。在目前没有办法获得大量而廉价的壳聚糖专一性酶的情况下，采用非专一性的酶降解壳聚糖无疑具有很高的现实意义。寻求经济、高效的壳聚糖非专一性水解酶成为近年来的研究热点。从各类酶的作用效果及酶的来源分析，如此广泛的酶似乎不存在共同的催化基团，其具体的降解机理尚未能得到合理的解释。但它们的降解反应存在几个共同特点：水解最适pH值为3.0-5.0；水解初期以内切酶作用为主，溶液粘度迅速下降；N-乙酰化度对其酶活性有影响，随着脱乙酰化程度的提高，酶的水解活性增强，以水溶性低聚壳聚糖为反应物时，酶的活性为最高；反应不遵循米氏方程19，提高酶的质量分数或是底物的质量分数均可以提高反应速度；反应速度快，是生产寡糖的一条较好途径。 Toms等20用壳聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、阮酶、溶菌酶和脂肪酶分别水解壳聚糖,根据壳聚糖溶液粘度的减小和还原端的形成,发现纤维素酶、胃蛋白酶和脂肪酶尤其适合水解壳聚糖,其降解活性与壳聚糖酶相当。降解产物用高效液相色谱分离,发现用胃蛋白酶水解壳聚糖得到接近产率为52%的低聚壳聚糖,而用其他酶水解不超过46%。单一水解酶对壳聚糖降解程度有限，增加酶量也难以提高水解程度。若将非专一性水解酶按比例配合，利用酶之间水解作用的协同或互补效应可进一步提高对壳聚糖的水解程度。将木瓜蛋白酶、果胶酶、纤维素酶以1.0：0.9：1.1(质量比)配合成复合酶，在pH值为5.0，温度为40下水解2h时，溶液粘度下降90.1%-95.8%。1.4.3.2 糖基转移法糖基转移法又称酶法合成，是建立在酶反应基础上，利用低聚合度寡糖在酶参与作用下，延长糖链成为高聚合度甲壳低聚糖。有关化学合成法研究在过去二十年取得较大进展，但合成过程涉及基团保护和基团脱去等过程，步骤较为复杂。而酶法合成则可在温和条件下进行，且不需要进行羟基保护过程。糖基转移反应受温度、pH、底物浓度和反应时间等因素影响，利用糖基转移反应合成低聚糖，不仅可调节聚合度，而且还可通过精心设计基质以合成特殊结构甲壳低聚糖衍生物。另外，将酶和超滤膜相结合制成膜过滤酶反应器，也可实现壳聚糖的连续生产。1.4.4 其他方法1.4.4.1联合降解法所谓联合降解就是以上各种降解方法的组合使用，它的出现使低聚壳聚糖的制备进入了一个新的阶段。Wang等在壳聚糖溶液中加入双氧水，然后用低压水银灯发出的254nm紫外光照射溶液30min，发现紫外光对双氧水降解壳聚糖具有协同作用。Wu等21发现超声波对臭氧降解壳聚糖具有协同作用。可见，随着低聚壳聚糖制备研究的深入，将会出现更多的、更实用的联合降解工艺。1.4.4.2真菌降解法除了用上述各种方法降解壳聚糖制备低聚壳聚糖外，也可以从真菌体中直接提取低聚壳聚糖。从真菌提取具有易操作、易控制、易制备高质量壳聚糖的优点，而且在不同的环境和营养条件下用不同的菌株可以制备不同分子量的低聚壳聚糖，在提取过程中减少了由于使用酸碱所带来的环境污染，是直接制备低聚壳聚糖的一种新的绿色工艺。1.5壳聚糖降解产物分析与表征方法1.5.1聚合度的测定高效毛细管电泳具有高分辨率、高灵敏度及快速分离的特点，广泛用于寡糖的结构测定。将低分子量水溶性壳聚糖50mg加150 L 0.2M 8-氨基萘-1,3,6-三磺酸盐 (ANTS，溶于HAc-H2O中)衍生物，并于200 L 1M NaBH3CN络合(40水浴反应15h)，使糖链带负电荷，且具有发色团和荧光特性。由于大小不一的寡糖形成络合物时，每个络合物只带一个电荷，这样各种寡糖可根据分子大小在电泳中得到分离，并很快通过激光诱导荧光检测，然后从出峰时间判断寡糖的聚合度。通过峰面积计算各种聚合度的寡糖占总水解产物的百分比。1.5.2脱乙酰度的测定测定壳聚糖的脱乙酰度有很多方法，如化学分析方法（酸碱滴定法、电位滴定法、胶体滴定法、热分解法、盐酸盐法等）或者仪器分析方法（红外光谱法、近红外光谱法、1H核磁共振法、1C核磁共振法、紫外光谱法、紫外光谱的一阶导数法、元素分析法、凝胶色谱法、高效液相色谱法、质谱法等），各种方法在样品制备、分析时间、测定成本及精度上各有不同。化学方法操作繁琐、耗时较多，而仪器方法一般较昂贵。其中，酸碱滴定法（又称碱量法）是经典的容量分析，具有操作简单、适用范围广、仪器易得、处理周期短、数据易于处理等特点，被广泛采用，很适合于生产过程的控制。该反应的等当点约在pH=4.2左右。1.5.3相对分子质量的测定可以采用凝胶渗透色谱法(GPC)、蒸汽压渗透计法、渗透压法、端基法、黏度法、光散射法(LS)和光散射凝胶渗透色谱法(GPC-IS)等方法进行低聚壳聚糖分子量的测定。不同的测定方法得到的平均相对分子质量的意义不同：凝胶渗透色谱法测得的是重均相对分子质量和数均相对分子质量，光散射法测的是重均相对分子质量（Mw），渗透压法、蒸汽压渗透计法和端基法测得的是数均相对分子质量(Ma),黏度法只适合测定黏均相对分子质量(Mv)，而且测定的相对分子质量的适用范围为10000以上。高压液相色谱法可测得绝对相对分子质量，同时还能得到相对分子质量分布图，成为一种普遍采用的相对分子质量和相对分子质量分布测定方法。高效毛细管电泳具有高分辨率、高灵敏度及快速分离的特点，广泛用于寡糖的结构测定。光散射法也是常用方法，但不能准确测量分子量小于5000的低聚糖的分散度和相对分子质量。端基法因其不需要特殊的仪器设备，并且操作方便，应用较为广泛，但误差较大。1.5.4薄层色谱分析采用乙酸乙脂:甲醇:水:氨水=5:9:1:1.5混合液作为硅胶薄板展开剂时，可将不同聚合度的壳聚糖寡糖很好地分开，且层析重现性高，糖残基数目和Rf值具有很好的线性关系。实验表明:含有16糖单位的壳聚糖寡糖在实验所选定的展层系统中分离效果很好:无拖尾，标准品中的6个糖都分离得很清楚，壳聚糖寡糖点呈棕黄色，分离点都呈圆形。可以得到很好的糖单位数目和Rf值的线性对应关系。与高效液相色谱法(HPLC)结合是一种可靠的壳聚糖寡糖分析方法。1.5.5红外吸收光谱分析将高分子壳聚糖和低分子壳聚糖KBr压片，4004000cm-1区间扫描，分子量不同的壳聚糖红外光谱结构表征基本一致。几个特征峰如3450cm-1的O-H伸缩吸收峰，2567cm-1的C-H伸缩吸收峰，1665cm-1，1550cm-1的酰胺峰都存在。低分子量壳聚糖由于羟基的增多，3450cm-1处出现较强的O-H吸收峰22。在壳聚糖降解前后3400cm-1左右的N-H伸缩振动、1600cm-1左右的N-H弯曲振动等主要峰的位置都无变化，只是随壳聚糖相对分子质量的降低各峰峰强有所变化，进一步证实了该协同反应是以开裂壳聚糖的-(1,4)糖苷键来进行23。说明降解前后壳聚糖糖环结构没有改变。2. 异相体系中制备低分子量壳聚糖2.1黏度法测原料壳聚糖分子量2.1.1实验原理黏度反映了高聚物的相对分子质量大小，通过一定的方法测定出壳聚糖的黏度，就可以推测计算出其相对分子质量。黏度法分旋转式黏度计测定黏度和乌氏黏度计测定特性黏度。工业上常采用旋转黏度计快速测定指定浓度的黏度(单位:Pas)，用于估算或比较相对分子质量的大小，但不能准确知道壳聚糖的相对分子质量；用乌氏黏度计可以快速测定特性黏度，继而得到黏均相对分子质量，而且，乌氏黏度计价廉易得。乌氏黏度计如图2-1所示：图2-1:乌氏黏度计Fig.2-1: Ubbelohde viscometer用乌氏黏度计测定高聚物相对分子质量的原理如下：黏性液体在流动过程中所受阻力的大小可用黏度系数（简称黏度）来表示，高聚物溶液的黏度是高聚物分子间的内摩擦力、高聚物分子和溶剂分子间的内摩擦力以及溶剂分子间内摩擦力三者之和。定义增比黏度sp：sp=( -0 )/ 0 =r-1式中， 高聚物溶液的黏度0 纯溶剂的黏度 r 相对黏度，为溶液黏度与纯溶剂黏度的比值定义高聚物的比浓黏度为sp /c、比浓对数黏度为ln r/c ，特性黏度为。在足够稀的高聚物溶液中，sp /c 和c、ln r/c和c之间分别符合下述经验关系式：sp /c=+2cln r/c=-2c 式中，和是两个常数。这是两个直线方程，通过sp /c 对c、ln r/c 对c作图，外推至c0时所得的截距即为。对于同一高聚物，由上面两个线性方程作图外推所得截距应交于同一点，如图2-2所示： 图2-2 sp /c - c、ln r/c c Fig.2-2 sp /c - c、ln r/c c在一定的原料、温度和溶剂等条件下，高聚物的特性黏度与相对分子质量之间的关系遵循下面的经验公式，即Mark-Houwink经验式：=KM式中，特性粘度（与分子量、温度、浓度、溶剂等因素有关）,g/ml M相对分子质量 K常数（与体系性质关系不大单依赖于温度） 常数（与相对分子质量有关，通常10.5）K、由实验来确定，先将高聚物尽可能按相对分子质量分级，然后测定各级的和平均相对分子质量M(用其他测定绝对相对分子质量的方法测得)，如果在实验的相对分子质量范围内是常数，则lg对lgM作图得到一条直线，直线的斜率即为，截距即为lgK；如果不是常数，则lg对lgM作图得不到一条直线，只能求得在各段相对分子质量范围内适用的K和。王伟等24以0.1 mol/LCH3COONa+0.2 mol/LCH3COOH为溶剂，在30下用光散射法定出不同脱乙酰度壳聚糖的K和值