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肿瘤病理研究新热点及新技术 20世纪世纪20-50年代，是化学致癌研究最迅猛的时代年代，是化学致癌研究最迅猛的时代;60-70年代的掀起寻找癌症病毒狂潮年代的掀起寻找癌症病毒狂潮;70-80年代是癌基因疯狂时代年代是癌基因疯狂时代;80年代末进入迷恋抑癌基因时代年代末进入迷恋抑癌基因时代;90年代细胞周期、信号转导和细胞凋亡理论在癌症研年代细胞周期、信号转导和细胞凋亡理论在癌症研究中的广泛运用。究中的广泛运用。然而，浪潮很快过去了，因为这些都被证明然而，浪潮很快过去了，因为这些都被证明与癌症有关，但不是癌症的与癌症有关，但不是癌症的本质本质！人类在肿瘤研究方面经历了一个又一个浪潮人类在肿瘤研究方面经历了一个又一个浪潮肿瘤研究的新热点肿瘤研究的新热点l肿瘤干细胞肿瘤干细胞lmicroRNAlEMT肿瘤干细胞肿瘤干细胞TumorStemCell干细胞干细胞(StemCell)l是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，是一类具有自我复制能力是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞分类方法干细胞分类方法l一是根据干细胞所处的发育阶段分为：一是根据干细胞所处的发育阶段分为：胚胎干细胞胚胎干细胞(embryonicstemcell)和成体和成体干细胞干细胞(somaticstemcell)。l二是根据干细胞的发育潜能分为：二是根据干细胞的发育潜能分为：全能干细胞全能干细胞(totipotentstemcell,TSC)多能干细胞（多能干细胞（pluripotentstemcell）单能干细胞（单能干细胞（unipotentstemcell）诱导性多能干细胞（诱导性多能干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPScells）。l胚胚胎胎干干细细胞胞的的发发育育等等级级较较高高，是是全全能能干干细细胞胞，具具有有分分化化为为几几乎乎全全部部组组织织和和器器官官的的能能力力。而而成成体体干干细细胞胞的的发发育育等等级级较较低低，是是多多能能或或单单能能干干细细胞胞。成成年年组组织织或或器器官官内内的的干干细细胞胞一一般般认认为为具具有有组组织织特特异异性性，只只能能分分化化成成特特定定的的细细胞胞或或组组织织。最最新新的的研研究究表表明明，组组织织特特异异性性干干细细胞胞同同样样具具有有分分 化化 成成 其其 他他 细细 胞胞 或或 组组 织织 的的 潜潜 能能。肿瘤干细胞肿瘤干细胞l2006年年AmericanAssociationforCancerResearch的定义是：的定义是：肿瘤中具有自我肿瘤中具有自我更新能力、并能产生异质性肿瘤细胞的更新能力、并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。细胞。1.概念的提出概念的提出l传统观念认为，肿瘤是由体细胞突变而成传统观念认为，肿瘤是由体细胞突变而成,每个肿瘤细胞都可以无限制地生长。但这每个肿瘤细胞都可以无限制地生长。但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象。现象。l肿瘤细胞生长、转移和复发的特点与干细肿瘤细胞生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似，因此，有学者提胞的基本特性十分相似，因此，有学者提出肿瘤干细胞出肿瘤干细胞(tumorstemcell，TSC)的理的理论。论。这一理论为我们重新认识这一理论为我们重新认识肿瘤的起源和本质，以及肿瘤的起源和本质，以及临床肿瘤治疗提供了新的临床肿瘤治疗提供了新的方向和新的视觉角度。方向和新的视觉角度。2.2.实验依据实验依据从从20世纪世纪50年代年代SouthamC等进行的肿瘤等进行的肿瘤细胞自体细胞自体/异体移植实验、到后来众多实验都异体移植实验、到后来众多实验都证实并非每个肿瘤细胞都具有再生肿瘤的能证实并非每个肿瘤细胞都具有再生肿瘤的能力，只有一小部分肿瘤细胞在体外克隆形成力，只有一小部分肿瘤细胞在体外克隆形成实验中可以形成克隆，在异种移植模型中，实验中可以形成克隆，在异种移植模型中，只有移植人大量的肿瘤细胞才能形成移植瘤，只有移植人大量的肿瘤细胞才能形成移植瘤，究竟何种细胞行使肿瘤起源细胞究竟何种细胞行使肿瘤起源细胞(tumor-initiatingcell，TIC)的功能的功能l随机化理论随机化理论认为肿瘤细胞具有同质性，即认为肿瘤细胞具有同质性，即每一个肿瘤细胞都具有新生肿瘤的潜力，但每一个肿瘤细胞都具有新生肿瘤的潜力，但是能进入细胞分化周期的肿瘤细胞很少，是是能进入细胞分化周期的肿瘤细胞很少，是一个小概率随机事件。一个小概率随机事件。l分层理论分层理论认为肿瘤细胞具有功能异质性，认为肿瘤细胞具有功能异质性，只有有限数目的肿瘤细胞具有产生肿瘤的能只有有限数目的肿瘤细胞具有产生肿瘤的能力，但这些肿瘤细胞再生肿瘤是高频事件。力，但这些肿瘤细胞再生肿瘤是高频事件。3.两种理论解释两种理论解释目前的实验结果目前的实验结果l倾向于第二种解释倾向于第二种解释，即肿瘤组织中存在，即肿瘤组织中存在数量稀少的癌细胞，在肿瘤形成过程中数量稀少的癌细胞，在肿瘤形成过程中充当干细胞的角色，充当干细胞的角色，具有自我更新、增具有自我更新、增殖和分化的潜能殖和分化的潜能，虽然数量少，却在肿，虽然数量少，却在肿瘤的发生、发展、复发和转移中起着重瘤的发生、发展、复发和转移中起着重要作用。要作用。由于其众多性质与干细胞相似，所以由于其众多性质与干细胞相似，所以这些细胞被称为这些细胞被称为肿瘤干细胞肿瘤干细胞，肿瘤干，肿瘤干细胞能不对称产生两种异质的细胞，细胞能不对称产生两种异质的细胞，一种是与之性质相同的肿瘤干细胞，一种是与之性质相同的肿瘤干细胞，另一种是组成肿瘤大部分的另一种是组成肿瘤大部分的非致瘤癌非致瘤癌细胞细胞。TSC与成体干细胞关系与成体干细胞关系l肿瘤细胞突变最早发生于干细胞肿瘤细胞突变最早发生于干细胞干细胞与干细胞与TSC具有无限增殖相似的生物学特具有无限增殖相似的生物学特性性,只需突变获得过度增殖能力只需突变获得过度增殖能力,就可以转化成就可以转化成为肿瘤；干细胞比分化细胞周期性更新快为肿瘤；干细胞比分化细胞周期性更新快,寿命寿命长，突变更容易累积。干细胞是突变的靶点。长，突变更容易累积。干细胞是突变的靶点。l表面标记表明表面标记表明TSC来源于成体干细胞来源于成体干细胞由于造血干细胞研究进展，白血病干细胞的由于造血干细胞研究进展，白血病干细胞的分离和表面标记测定较早开始。目前研究发现，分离和表面标记测定较早开始。目前研究发现，几乎所有白血病干细胞与造血干细胞一致，均为几乎所有白血病干细胞与造血干细胞一致，均为CD34+，如所有的急性单核细胞性白血病（除急，如所有的急性单核细胞性白血病（除急性早幼粒细胞性白血病）干细胞都为性早幼粒细胞性白血病）干细胞都为CD34+,CD38-。目前研究较多的目前研究较多的TSC标记物标记物lCD34，CD133，CD44，前列腺干细胞，前列腺干细胞抗原（抗原（PSCA），干细胞抗原），干细胞抗原2（StemCellAntigen2），），CD90，OV-6，Oct-4 等。ICC中中CD133表达表达ICC中中CD44表达表达ICC中中PSCA表达表达Bmi1基因参与正常造血过程，其功能障碍基因参与正常造血过程，其功能障碍与与AML有关。有关。Bmi1基因敲除的小鼠干细胞移基因敲除的小鼠干细胞移植入免疫力摧毁的小鼠，干细胞可以短期产植入免疫力摧毁的小鼠，干细胞可以短期产生血细胞生血细胞，8周后，移植细胞基本消失。说明周后，移植细胞基本消失。说明Bmi1基因对正常血液干细胞的自我更新是必基因对正常血液干细胞的自我更新是必要的。要的。lBmi1基因对白血病细胞的产生也是必基因对白血病细胞的产生也是必要的。将要的。将Meis1a和和Hoxa9癌基因导入小鼠骨癌基因导入小鼠骨髓细胞可以产生髓细胞可以产生AML模型。把模型。把Meis1a和和Hoxa9癌基因导入正常小鼠与癌基因导入正常小鼠与BMi1基因失基因失活小鼠，都可以产生白血病细胞。但是活小鼠，都可以产生白血病细胞。但是Bmi1基因失活小鼠的白血病细胞移植入免基因失活小鼠的白血病细胞移植入免疫缺陷小鼠后不能再产生白血病细胞。所疫缺陷小鼠后不能再产生白血病细胞。所以，以，Bmi1基因对白血病干细胞的自我更新基因对白血病干细胞的自我更新和维持都是必要的。和维持都是必要的。Wnt、SHH(sonichedgehog)、Notch途径调控干细胞与途径调控干细胞与TSC的生长分化，的生长分化，提示机体一生中细胞的生长分化由相提示机体一生中细胞的生长分化由相似的生长调控机制调节似的生长调控机制调节,其异常可引起其异常可引起细胞过度增殖，导致肿瘤。细胞过度增殖，导致肿瘤。干细胞与干细胞与TSC有相似的生长调控机制有相似的生长调控机制TSC与干细胞有相同的起源与干细胞有相同的起源l侧脑室室管膜下层与海马齿状回是神经干侧脑室室管膜下层与海马齿状回是神经干细胞的起源地。通过神经祖细胞与其他祖细胞的起源地。通过神经祖细胞与其他祖细胞的癌基因与细胞的癌基因与p53抑癌基因突变，可以制抑癌基因突变，可以制造小鼠脑肿瘤模型。这些模型小鼠产生不造小鼠脑肿瘤模型。这些模型小鼠产生不同的脑肿瘤。影象学研究表明，这些脑肿同的脑肿瘤。影象学研究表明，这些脑肿瘤虽然可以在广泛的脑内区域产生，但这瘤虽然可以在广泛的脑内区域产生，但这些肿瘤都起源于侧脑室与海马。些肿瘤都起源于侧脑室与海马。l肿瘤早期诊断肿瘤早期诊断因为肿瘤干细胞是肿瘤发生过程中的最原始因为肿瘤干细胞是肿瘤发生过程中的最原始细胞，如果可以及早地识别并分离出肿瘤干细细胞，如果可以及早地识别并分离出肿瘤干细胞，就有可能依据其胞，就有可能依据其分子标志分子标志来对患者进行早来对患者进行早期诊断。期诊断。肿瘤干细胞具有能自我更新、增殖的特征，肿瘤干细胞具有能自我更新、增殖的特征，因此对其因此对其增殖功能的检测增殖功能的检测可能成为肿瘤最早期可能成为肿瘤最早期诊断的标准。诊断的标准。肿瘤干细胞研究价值巨大肿瘤干细胞研究价值巨大l阐明肿瘤干细胞增殖过程中的阐明肿瘤干细胞增殖过程中的基因调控基因调控机理机理，将为抗肿瘤药物的研发提供新的理，将为抗肿瘤药物的研发提供新的理论基础，针对肿瘤干细胞的新一代抗肿瘤论基础，针对肿瘤干细胞的新一代抗肿瘤药物，有望极大地提高肿瘤的治疗效果。药物，有望极大地提高肿瘤的治疗效果。为研发新一代高效的抗肿瘤为研发新一代高效的抗肿瘤药物提供新的靶点药物提供新的靶点l由于肿瘤干细胞与肿瘤细胞具有异质性，由于肿瘤干细胞与肿瘤细胞具有异质性，其生物学特性和对治疗手段的敏感程度也其生物学特性和对治疗手段的敏感程度也并不完全一致。并不完全一致。传统的治疗传统的治疗手段针对的是手段针对的是大多数的肿瘤细胞，往往忽视了占少数的大多数的肿瘤细胞，往往忽视了占少数的肿瘤干细胞，因而对肿瘤干细胞无法达到肿瘤干细胞，因而对肿瘤干细胞无法达到最有效的杀灭效果。最有效的杀灭效果。l肿瘤干细胞的发现有可能彻底改肿瘤干细胞的发现有可能彻底改变现有化疗药物的选择配伍、有变现有化疗药物的选择配伍、有效剂量和疗程，以彻底消灭肿瘤效剂量和疗程，以彻底消灭肿瘤干细胞为指标的新化疗方案有望干细胞为指标的新化疗方案有望极大地降低癌症的复发率和提高极大地降低癌症的复发率和提高其治愈率。其治愈率。1.肿瘤干细胞是如何产生的？肿瘤干细胞是如何产生的？虽然一些肿瘤干细胞的存在已经得到了实验性证实，如白血病、乳腺癌，肝癌，但是否所有的肿瘤都起源于肿瘤干细胞还不清楚。2.如何识别和分离肿瘤干细胞？如何识别和分离肿瘤干细胞？这是利用肿瘤干细胞来进行癌症治疗的一个关键环节。根据细胞表面标记的特征，科研人员已经识别和分离出几种肿瘤干细胞，如何对其他肿瘤的干细胞进行分子或者形态上的鉴定，仍然是一项非常艰巨的任务。“三大难关三大难关”需要攻克需要攻克3.如何避免杀伤正常干细胞？如何避免杀伤正常干细胞？由于肿瘤干细胞与干细胞的相似性，如何避由于肿瘤干细胞与干细胞的相似性，如何避免对肿瘤干细胞具有杀伤作用的治疗手段影响免对肿瘤干细胞具有杀伤作用的治疗手段影响到正常的干细胞就显得十分重要。到正常的干细胞就显得十分重要。如果采用的治疗手段不适，就有可能引发严如果采用的治疗手段不适，就有可能引发严重的副作用，使人类正常的干细胞受到损害。重的副作用，使人类正常的干细胞受到损害。诱导性多能干细胞诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPScells)定义定义l通过特定的基因组合与转染可以将已通过特定的基因组合与转染可以将已分化的体细胞诱导重编程为的多潜能分化的体细胞诱导重编程为的多潜能干细胞。干细胞。l2006年年,日本日本Yamanaka研究小组通过将逆转研究小组通过将逆转录病毒介导的录病毒介导的Oct-4,Sox2,Klf4及及c-Myc四四个基因转入鼠成纤维母细胞个基因转入鼠成纤维母细胞,将成体细胞重将成体细胞重编程为具有多分化潜能的干细胞编程为具有多分化潜能的干细胞,并将该类并将该类干细胞命名为干细胞命名为iPS细胞。细胞。l2007年年,美国美国Thomson实验室报道了实验室报道了Oct-4,Sox2，Nanog及及Lin28四个基因的转染可将四个基因的转染可将人成纤维母细胞重编程为人成纤维母细胞重编程为iPS细胞。细胞。l这一研究明确地证实了分化的细胞可以这一研究明确地证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源导入而被重编通过少数几个因子的外源导入而被重编程到具有多能性的状态程到具有多能性的状态,因而受到了整个因而受到了整个生命科学领域的广泛关注。生命科学领域的广泛关注。iPS细胞体内外的诱导分化细胞体内外的诱导分化 l与人和鼠的与人和鼠的ES细胞一样，细胞一样，iPS细胞植于免疫缺细胞植于免疫缺陷鼠皮下可在注射部位形成由内、中和外胚层陷鼠皮下可在注射部位形成由内、中和外胚层来源细胞杂乱排列构成的畸胎瘤。来源细胞杂乱排列构成的畸胎瘤。l将小鼠将小鼠iPS细胞注射入小鼠囊胚，其可与受体细细胞注射入小鼠囊胚，其可与受体细胞一起发育形成包括生殖系在内的各种组织而胞一起发育形成包括生殖系在内的各种组织而形成嵌合体。形成嵌合体。l通过嵌合体技术或四倍体胚胎补偿法通过嵌合体技术或四倍体胚胎补偿法(tetraploidcomplementation)亦可获得完全由小鼠亦可获得完全由小鼠iPS细胞细胞发育而来的个体。发育而来的个体。liPS细胞在一定培养条件下在体外可分化成细胞在一定培养条件下在体外可分化成含三个胚层来源细胞的多细胞结构，在其内含三个胚层来源细胞的多细胞结构，在其内可检测到：可检测到：l外胚层细胞如外胚层细胞如-tubulin阳性神经元、阳性神经元、Tuj1阳性的神经元、阳性的神经元、Nestin阳性细胞和星形阳性细胞和星形胶质细胞胶质细胞l中胚层细胞如中胚层细胞如CD34阳性细胞、心肌细胞、阳性细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞骨骼肌细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞l内胚层细胞如内胚层细胞如AFP(alpha-fetoprotein)阳性阳性细胞以及细胞以及TROMA-阳性的细胞等。阳性的细胞等。l研究者已成功地将研究者已成功地将iPS细胞在体外定向诱导细胞在体外定向诱导分化为神经前体细胞、功能性的成熟神经分化为神经前体细胞、功能性的成熟神经细胞，如运动神经元和多巴胺能神经元、细胞，如运动神经元和多巴胺能神经元、星形胶质细胞、造血前体细胞、造血细胞、星形胶质细胞、造血前体细胞、造血细胞、胰腺细胞和肝细胞、分泌胰岛素的胰腺细胞和肝细胞、分泌胰岛素的细胞、细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、胰腺细胞等。胰腺细胞等。应用及意义应用及意义liPS细胞在形态学、表观遗传学、全基因表细胞在形态学、表观遗传学、全基因表达谱以及细胞类型特异的分化潜能方面与达谱以及细胞类型特异的分化潜能方面与ES细胞极其相似，并且个体特异来源的细胞极其相似，并且个体特异来源的iPS细胞尚不涉及免疫排斥问题，所以细胞尚不涉及免疫排斥问题，所以iPS具备具备成为细胞治疗以及组织器官再生最有前景成为细胞治疗以及组织器官再生最有前景的种子细胞。的种子细胞。l为建立为建立“个体特异的个体特异的”、“病人特异的病人特异的”或或“疾病特异的疾病特异的”人人iPS细胞和实现细胞和实现“个体化的个体化的”药物药效与药物药效与ADME/Tox评价等奠定了良评价等奠定了良好基础。好基础。l“病人特异的病人特异的”或或“疾病特异的疾病特异的”人人iPS细胞细胞也可以用来研究特定疾病也可以用来研究特定疾病(如人如人ALS)的发的发病机制。病机制。l近年来，国际分子生物学顶尖级杂志近年来，国际分子生物学顶尖级杂志CNS(Cell/Nature/Scicence)，连续把连续把RNA的研究进展列为的研究进展列为“十大科技突破之一十大科技突破之一”，其，其中最引人注目的当是中最引人注目的当是microRNA。(一一)miRNA的概念的概念miRNA是一类长度约为是一类长度约为22nt的小分子非编的小分子非编码单链码单链RNA，由具有发夹结构的约，由具有发夹结构的约70-90个碱个碱基大小的单链基大小的单链RNA前体（前体（pre-miRNA）加工）加工而来，能够和互补或部分互补的靶而来，能够和互补或部分互补的靶mRNA的的3末端非翻译区末端非翻译区(3untranslationalregion,3UTR)结合，使结合，使mRNA降解或介导其翻译抑降解或介导其翻译抑制。制。（二）（二）miRNA与与siRNA的区别的区别-特性特性miRNAsiRNA-来源来源内源转录本内源转录本转基因、病毒转基因、病毒RNA大小大小约约22nt约约22nt前体前体茎环状的茎环状的pre-miRNA双链结构的双链结构的dsRNA催化酶催化酶Drosha、Dicer或类似或类似DicerDicer的酶复合体的酶复合体RISC复合体复合体含含Argonaute蛋白家族蛋白家族含含Argonaute蛋白家族蛋白家族匹配方式匹配方式不完全互补（动物）或不完全互补（动物）或完全互补完全互补完全互补（大多数植物）完全互补（大多数植物）作用专一性作用专一性相对较低相对较低高高作用点作用点蛋白质合成水平蛋白质合成水平转录后水平转录后水平靶基因的命运靶基因的命运抑制转录或者被降解抑制转录或者被降解被降解被降解功能功能发育过程中调节发育过程中调节抑制转录活性、病毒抑制转录活性、病毒内源基因的表达内源基因的表达感染、表型遗传感染、表型遗传-（三）（三）miRNA的功能及意义的功能及意义高高等等真真核核细细胞胞中中，miRNA基基因因占占已已知知基基因因的的1%，目目前前估估计计哺哺乳乳动动物物细细胞胞中中有有600多多个个miRNA，30%的基因要受到的基因要受到miRNA的调节。的调节。miRNA的的多多样样性性与与进进化化保保守守性性决决定定了了其其在在生生理理生化功能上的重要性与普遍性。生化功能上的重要性与普遍性。然然 而而 只只 有有 少少 数数 miRNA的的 已已 经经 明明 确确，许许 多多miRNA的功能还尚待深入研究。的功能还尚待深入研究。已知功能的已知功能的miRNA-miRNA名称名称物种物种生物学功能生物学功能靶基因靶基因-lin-4线虫线虫发育时序调节发育时序调节lin-14,lin-28let-7线虫线虫发育时序调节发育时序调节lin-41,hbl-1lsy-6线虫线虫神经细胞化学感受神经细胞化学感受器器cog-1不对称性调节不对称性调节miR-273线虫线虫神经细胞化学感受器神经细胞化学感受器die-1不对称性调节不对称性调节miR-165/166拟南芥拟南芥叶子近轴与离轴细叶子近轴与离轴细胞的分化胞的分化PHV/PHBmiR-172拟南芥拟南芥花朵发育花朵发育APETALA2(AP2)Bantam果蝇果蝇调节细胞增殖和凋调节细胞增殖和凋亡亡hidmiR-14果蝇果蝇调节细胞凋亡和脂类调节细胞凋亡和脂类代谢代谢caspaseIcemiR-15a/哺乳动物哺乳动物B细胞慢性淋巴细胞细胞慢性淋巴细胞白血病白血病Bcl-2miR-16-1（B-CLLs）miR-196哺乳动物哺乳动物脊椎动物发育脊椎动物发育Hox-B8miR-143哺乳动物哺乳动物脂肪细胞分化脂肪细胞分化erk5miR-375哺乳动物哺乳动物胰岛素分泌调节胰岛素分泌调节mtpnmiR-1哺乳动物哺乳动物心脏细胞的生长和心脏细胞的生长和分化分化Hand2-1.miRNA与生物体的发育、与与生物体的发育、与细胞分化、与细胞增殖和调亡、细胞分化、与细胞增殖和调亡、与激素分泌与激素分泌等功能有关。等功能有关。2.miRNA与肿瘤发生及治疗与肿瘤发生及治疗近几年，近几年，miRNAs与人类肿瘤的关系逐渐引起了与人类肿瘤的关系逐渐引起了人们的广泛注意，并不断有肿瘤发生与人们的广泛注意，并不断有肿瘤发生与miRNAs的的表达有关的例子的报道。表达有关的例子的报道。研究表明，研究表明，miRNA的表达水平在许多肿瘤中发的表达水平在许多肿瘤中发生改变，它们可能起到生改变，它们可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。原癌基因和抑癌基因的作用。（1）Calin等发现等发现miR-15a和和miR-16-1定位于染色体定位于染色体13q14,而这一区域在一半以上的而这一区域在一半以上的B-CLLs病人中缺失。而且病人中缺失。而且这一缺失在约这一缺失在约50%的外套细胞淋巴瘤的外套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma,MCL),16%40%的多发性骨髓瘤和的多发性骨髓瘤和60%的前列腺癌中出现。的前列腺癌中出现。推测他们可能起着肿瘤抑制基因的角色。推测他们可能起着肿瘤抑制基因的角色。（2）Iorio和和Michael等发现，等发现，miR-143，miR-145在结直肠在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌和淋巴瘤中的表达下调，这癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌和淋巴瘤中的表达下调，这两个基因位于两个基因位于5q32-33。（3）He等研究发现，等研究发现，miR-221,-222,-146在乳头状甲状腺癌在乳头状甲状腺癌中显著上调。中显著上调。（4）CiafreSA和和Chan等发现，等发现，miR-21可作为一种抗凋可作为一种抗凋亡因子，在恶性胶质瘤和乳腺癌中的表达是上调的。亡因子，在恶性胶质瘤和乳腺癌中的表达是上调的。（5）Metzler等在儿童的等在儿童的Burkitt淋巴瘤中发现淋巴瘤中发现miR-155/BIC的前体高表达。的前体高表达。（6）JohnsonSM等发现肺癌等发现肺癌let-7的表达常是降低的，的表达常是降低的，let-7的靶点是的靶点是Ras癌基因，癌基因，RAS信号通路在哺乳动物中调控信号通路在哺乳动物中调控细胞的正常生长和恶性增殖细胞的正常生长和恶性增殖,RAS蛋白过表达会引起细胞的蛋白过表达会引起细胞的恶性增殖，恶性增殖，let-7表达的降低可致其靶点癌基因表达的降低可致其靶点癌基因Ras表达的增加表达的增加和促进肿瘤生长。和促进肿瘤生长。microRNA可能是肿瘤治疗的神奇子弹可能是肿瘤治疗的神奇子弹l在慢性淋巴细胞白血病在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中研究发现，中研究发现，miR-15a和和miR-16-1存在缺失或下调，存在缺失或下调，miR-15a和和miR-16-1的表达与的表达与CLL中中Bcl2的表达相反，这两个的表达相反，这两个microRNA在转录后的水平上对在转录后的水平上对Bcl-2起负调节作用。起负调节作用。在白血病细胞系中已经观察到，含有在白血病细胞系中已经观察到，含有9bpBcl-2互补序列的互补序列的miR-15a和和miR-16-1，通过抑制，通过抑制Bcl-2蛋蛋白表达，诱导肿瘤细胞凋亡白表达，诱导肿瘤细胞凋亡。miR-15a和和miR-16-1是是Bcl-2天天然的反义作用因子，可以用于治疗然的反义作用因子，可以用于治疗Bcl-2过表达的肿瘤。过表达的肿瘤。3.miRNA功能研究功能研究寻寻找找下下游游靶靶基基因因是是发发现现miRNA功功能能的的一一个个直直接接手手段段。由由于于miRNA与与靶靶基基因因的的不不完完全全配配对对，在在动动物物基基因因组组中中直直接接寻寻找找就就显显得得有有些些困困难难，但但也也有有研研究究尝尝试试依依据据其其他他特特征征用用生生物物信信息息学学查查找找，但但总总的的来来说说仍仍需需要要实实验验检检验验。从从仅仅有有的的例例子子来来看看，一一个个miRNA可可调调控控细细胞胞中中与与某某一一种种物物质质代代谢谢或或信信号号转转导导途途径径相相关关的几种的几种mRNA，这样更能有效地发挥作用。，这样更能有效地发挥作用。寻寻找找miRNA的的靶靶基基因因是是目目前前功功能能研研究究的的热热点点之之一一，因因为为这这为为揭揭示示每每一一个个miRNA的的功功能能提提供供了了必必不不可可少少的的线线索索，从从而而为为全全面面了了解解miRNA在细胞中的功能打下基础。在细胞中的功能打下基础。（四）小结（四）小结1.miRNA作作为为新新的的研研究究切切入入点点，为为功功能能基基因因组组学学，基因治疗，转录调控机制提供了一条有效途径。基因治疗，转录调控机制提供了一条有效途径。2.近近年年来来对对miRNA的的研研究究已已经经取取得得了了突突破破性性进进展展,并并且且有有大大量量的的miRNA被被鉴鉴定定,但但是是总总体体来来说说对对miRNA的的研研究究还还处处在在理理论论水水平平上上,关关于于miRNA的的应应用用的的例例子子还还较较少少。miRNA作作为为体体内内正正常常表表达达的的基基因因,与与人人类类疾疾病病（特特别别是是肿肿瘤瘤）和和植植物物培培育育的的关关系系还还有有待进一步研究。待进一步研究。3.尽尽管管目目前前miRNA应应用用于于基基因因治治疗疗的的尝尝试试才才刚刚刚刚开开始始,但但已已经经在在药药物物设设计计及及疾疾病病治治疗疗等等实实际际应应用用中中显显现现了了巨巨大大的的应应用用潜潜力力,相相信信随随着着对对这这种种特特殊殊分分子子研研究究的的不不断断深深入入,以以miRNA为为靶靶点点或或者者以以miRNA为为治治疗疗手手段段的的设设想想,以以后后可可能能会会成成为为焦焦点点，并并且且将将为为肿肿瘤瘤和和其其它它疾疾病病的的治治疗疗带带来来新新的的希希望望。这这些些研研究究成成果果必必将将促促进进整个生物界研究领域的进步与发展。整个生物界研究领域的进步与发展。上皮间质转化（上皮间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition）EMTl上皮间质转化（上皮间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)，是上皮细胞失去上，是上皮细胞失去上皮特性获得间质细胞表型皮特性获得间质细胞表型的一种生物现象，发生的一种生物现象，发生EMT后细胞后细胞E-钙黏蛋白、钙黏蛋白、角蛋白等上皮标记基因表角蛋白等上皮标记基因表达降低，波形蛋白、纤维达降低，波形蛋白、纤维连接素、连接素、N-钙黏蛋白等间钙黏蛋白等间质标记基因表达升高。质标记基因表达升高。l已证实已证实EMT参与肿瘤侵袭转移，在肿瘤转参与肿瘤侵袭转移，在肿瘤转移过程中，癌细胞通过移过程中，癌细胞通过EMT而获得间质细而获得间质细胞表型和侵袭性，实现对周围组织的浸润；胞表型和侵袭性，实现对周围组织的浸润；在种植部位，在种植部位，癌细胞通过间质细胞癌细胞通过间质细胞-上皮细上皮细胞转化（胞转化（Mesenchymal-epithelialtransition，MET）最终形成与原发灶形态）最终形成与原发灶形态结构相似的转移灶。结构相似的转移灶。EMT发生机制发生机制肿瘤微环境与肿瘤微环境与EMTl基质金属蛋白酶作为一组锌依赖性的高基质金属蛋白酶作为一组锌依赖性的高度保守的蛋白水解酶，可直接诱导癌上度保守的蛋白水解酶，可直接诱导癌上皮细胞发生皮细胞发生EMT，发生，发生EMT后肿瘤细后肿瘤细胞产生更多基质金属蛋白酶，促进癌细胞产生更多基质金属蛋白酶，促进癌细胞的侵袭与转移。胞的侵袭与转移。l基质金属蛋白酶可能通过上调基质金属蛋白酶可能通过上调Wnt引起癌细引起癌细胞发生胞发生EMT，增强癌细胞的移动、侵袭能力。，增强癌细胞的移动、侵袭能力。l基质金属蛋白酶还通过释放转化样生长因子、基质金属蛋白酶还通过释放转化样生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子等可溶性表皮生长因子、胰岛素样生长因子等可溶性细胞因子，激活多种下游信号转导，促进肿细胞因子，激活多种下游信号转导，促进肿瘤细胞的侵袭与转移。瘤细胞的侵袭与转移。l肿瘤细胞产生的集落刺激因子可刺激巨噬肿瘤细胞产生的集落刺激因子可刺激巨噬细胞合成表皮生长因子，诱导并促进肿瘤细胞合成表皮生长因子，诱导并促进肿瘤迁徙与侵袭相关基因的表达上调，同时使迁徙与侵袭相关基因的表达上调，同时使胞内胞内E-钙黏蛋白的表达降低，促进钙黏蛋白的表达降低，促进EMT的的快速转化快速转化。l血管内皮生长因子（血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）除参与血管生成外，）除参与血管生成外，也可以通过自分泌促进肿瘤细胞也可以通过自分泌促进肿瘤细胞EMT的发的发生。生。激酶类与激酶类与EMTl蛋白激酶在信号转导中位于生长因子蛋白激酶在信号转导中位于生长因子下游，下游，Src激酶、激酶、Rho激酶是研究较早激酶是研究较早的激酶；的激酶；Src激酶可能通过三种途径参激酶可能通过三种途径参与与EMT的过程。的过程。lSrc使细胞骨架以及黏附结构的成分发使细胞骨架以及黏附结构的成分发生磷酸化生磷酸化,从而改变细胞结构引起细胞移从而改变细胞结构引起细胞移动；动；l可以诱导可以诱导c-myc,影响细胞进入影响细胞进入S期；期；lSrc还可以与其他信号途径相互作用，还可以与其他信号途径相互作用，如活化如活化Ras-MAPK等信号通路途径。等信号通路途径。lRho家族激酶可诱导张力纤维形成、调控细家族激酶可诱导张力纤维形成、调控细胞骨架蛋白、细胞黏附和细胞能动性，可胞骨架蛋白、细胞黏附和细胞能动性，可以为膜内以为膜内CD44、CD43、ICAM与骨架成分与骨架成分之间的连接提供支持，通过参与骨架之间的连接提供支持，通过参与骨架胞胞膜的锚定及细胞黏附作用的修饰调控细胞膜的锚定及细胞黏附作用的修饰调控细胞表型。表型。lG-蛋白偶联受体酪氨酸激酶激活后可通蛋白偶联受体酪氨酸激酶激活后可通过过MAPK信号通路将胞外信号转人核内，信号通路将胞外信号转人核内，影响相关基因表达，介导影响相关基因表达，介导EMT发生。发生。l细胞外信号调节激酶（细胞外信号调节激酶（ERK）作为丝）作为丝/苏苏氨酸蛋白激酶的一种，也参与调控氨酸蛋白激酶的一种，也参与调控EMT的过程。的过程。转录因子与转录因子与EMTl转录因子在信号转导中位于蛋白激酶下转录因子在信号转导中位于蛋白激酶下游，目前发现游，目前发现Snail、Slug、Twist、ZEB1、Smad、NF-B等转录因子与等转录因子与EMT密切相关。密切相关。lSnail与与Slug同属于一个转录因子家族，两同属于一个转录因子家族，两者不仅可以与者不仅可以与Smad的相互作用蛋白的相互作用蛋白（sip1）竞争性结合）竞争性结合E-钙黏蛋白启动子区钙黏蛋白启动子区的的E-box连接基序，抑制连接基序，抑制E-钙黏蛋白的表达钙黏蛋白的表达及波形蛋白的表达水平的上升，也可以经及波形蛋白的表达水平的上升，也可以经由形成由形成-连环连环-T细胞因子细胞因子-4（TCF-4）转录）转录复合体，来促进复合体，来促进EMT的发生的发生。lTwist蛋白作为一个碱性螺旋蛋白作为一个碱性螺旋-环环-螺旋螺旋结构的转录因子，也通过与结构的转录因子，也通过与E-box序序列结合来抑制列结合来抑制E-钙黏蛋白的表达，诱钙黏蛋白的表达，诱导导EMT的发生的发生lZeb1与与SIP1结构相似，同属结构相似，同属ZEB家族，家族，ZEB1与与SIP1均能结合均能结合TGF-信号通路中信号通路中的的R-smads，并在，并在TGF-信号刺激下，与信号刺激下，与R-smad-smad4复合体直接结合，调节复合体直接结合，调节SMA、p21、p15等多个与等多个与EMT相关的基因转录相关的基因转录。lNF-B可以通过可以通过AKT上调上调snail的表达，的表达，也可以通过抑制也可以通过抑制E-钙黏蛋白的表达并且上钙黏蛋白的表达并且上调调ZEB1，ZEB2因子而增强因子而增强EMT的发生。的发生。其它调控因子与其它调控因子与EMTlmir-200与与mir-205可以调节可以调节ZEB1与与ZEB2因子，抑制因子，抑制E-钙黏蛋白的表达，而引起钙黏蛋白的表达，而引起EMT发生。发生。l花生四烯酸可以提高波形蛋白及花生四烯酸可以提高波形蛋白及N-钙黏蛋钙黏蛋白表达，降低白表达，降低E-钙黏蛋白表达，并且激活钙黏蛋白表达，并且激活FAK，Src与与NF-kB等途径而诱导乳腺癌等途径而诱导乳腺癌细胞细胞MCF10A发生发生EMT。lHIF-过表达可以通过调控过表达可以通过调控E-钙黏蛋白以及钙黏蛋白以及波形蛋白表达而诱导前列腺癌发生波形蛋白表达而诱导前列腺癌发生EMT。lBMP-2可以通过可以通过PI3K/AKT途径诱导胃癌途径诱导胃癌细胞发生细胞发生EMT，引起肿瘤的侵袭转移。，引起肿瘤的侵袭转移。lCox-2可以抑制可以抑制smad信号信号,同时通过一个同时通过一个PGE2依赖机制而经由依赖机制而经由TGF-途径增强途径增强EMT的发生。的发生。EMTgeneratescancerstem-likecellsfromepithelialcancercellsOuyang G.Cell.Mol.Life Sci.2010问题问题lEMT不仅在胚胎形成发育中起重要作用，不仅在胚胎形成发育中起重要作用，而且在肿瘤侵袭转移中同样也发挥重要作用。而且在肿瘤侵袭转移中同样也发挥重要作用。因此，对因此，对EMT分子调控机制的研究为预防分子调控机制的研究为预防肿瘤转移提供一个有利的平台。肿瘤转移提供一个有利的平台。lEMT涉及到众多的调控机制，许多有关涉及到众多的调控机制，许多有关EMT的调控机制已被报道，但详细调控机的调控机制已被报道，但详细调控机制仍不清楚，如生长因子在诱导制仍不清楚，如生长因子在诱导EMT过程过程中怎样联系；作为转录因子的中怎样联系；作为转录因子的Twist诱导诱导EMT的详细调控机制是什么。的详细调控机制是什么。lmiRNAs作为一类新型的调控转录后基因表达水作为一类新型的调控转录后基因表达水平的小分子平的小分子RNAs，在肿瘤中既可高表达，又可低，在肿瘤中既可高表达，又可低表达，并与肿瘤表达，并与肿瘤EMT的发生有着密切的联系，而的发生有着密切的联系，而它们的调控机制还需进一步研究。它们的调控机制还需进一步研究。lEMT调控因子可使肿瘤细胞发生调控因子可使肿瘤细胞发生EMT，促进肿瘤，促进肿瘤侵袭转移。目前越来越多的学者开始致力于通过侵袭转移。目前越来越多的学者开始致力于通过各种方法抑制各种方法抑制EMT而降低肿瘤的侵袭与转移，已而降低肿瘤的侵袭与转移，已有试验针对有试验针对TGF-1抑制抑制EMT，从而逆转肿瘤侵，从而逆转肿瘤侵袭，如使用袭，如使用TGF-阻滞剂降低肿瘤的侵袭性。阻滞剂降低肿瘤的侵袭性。l骨形成蛋白骨形成蛋白(bonemorpho-geneticprotein,BMP)也可逆转也可逆转TGF-1引起引起E-钙黏蛋白表钙黏蛋白表达下调。达下调。lEMT的发生所涉及到众多调控机制中大多的发生所涉及到众多调控机制中大多数都是建立在体外实验基础上研究的，但数都是建立在体外实验基础上研究的，但由于体内外环境差