生物关键技术交底书模板.doc

技术交底书模板-生物类

1. 发明发明名称：
应简单明确地描述发明实质内容，可按其技术特点、用途或技术和用途双重命名，发明发明名称不得超出25个字，避免使用宣传性、广告性词汇。

一个快速判定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌方法
2．背景技术及现有技术缺点和不足：
背景技术：是对最靠近现有技术说明，可分为大背景技术和小背景技术两个方面进行介绍，大背景技术关键指该技术领域总体情况，小背景技术指和本发明改善具体技术亲密相关技术情况；背景技术具体程度，以不需要再去看文件即可了解该技术亲密相关技术情况，假如现有技术出自专利文件、期刊、书籍，则提供出处。
现有技术缺点和不足：
1.客观评价现有技术缺点，会带来哪些问题，这些缺点是针对本发明优点来说，本发明正是要处理这些问题和缺点；本发明无法处理技术问题无须描述，本发明不能处理缺点也无须写；
2.假如找不出对比技术方案及其缺点，可用反推法，依据本发明优点来找出由对应缺点，还能够从结构角度推导出现有优异产品缺点；
3.缺点能够是代谢产物性能差、产量低、菌种稳定性不高等类似问题；
针对前面现有技术全部缺点，逐一正面描述本发明所要处理技术问题。

多年来，非结核分枝杆菌感染显著增加，结核和非结核分枝杆菌在临床上引发疾病难以区分，最具代表性结核分枝杆菌引发结核病酷似非结核分枝杆菌肺病，但二者对抗结核药品敏感性不一样，故正确判定分枝杆菌在疾病诊疗及诊疗中至关关键。传统生物学判定方法关键依据细菌生长速度、色素产生、对药品耐受性、生化反应等，方法复杂、费时，在得到分离培养物后仍需2～4周方能取得结果，所以有必需建立一个快速诊疗结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌方法，对结核病确证及临床用药含相关键指导意义。现在判别结核分枝杆菌分子生物方法有PCR，ELISA、免疫胶体金等方法，以上多种方法即使可能在临床上提供很好价值，但因需要昂贵仪器设备、繁琐操作过程、灵敏度低等不一样原因未能在临床上大规模推广使用。环介导等温基因扩增技术（LoopMediated Isothermal Amplification，以下简称LAMP法）是日本荣研化学株式会社于前后开发出基因扩增技术，其含有快速简便、操作正确、轻易普及、安全可靠优点，现在还未有将LAMP法应用于快速判定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。
3．具体技术方案描述：
本部分所提供内容包含专利申请文件中最关键部分，越具体越好。
对于发明专利要求保护专题是一个技术方案，所以在这部分应该叙述本发明要处理技术问题（即发明目标）是经过什么样技术方案来实现，不能只有原理和功效介绍，应该具体描述本发明各个发明改善点及对应技术方案。
技术方案应该经过清楚、完整地描述本发明技术特征（如菌种名称、微生物生物学特征、应用效果试验方法及证实数据等），使本专业技术领域中一般技术人员不需经过发明性劳动能够实施本发明为准。
对于不一样类型发明，需要采取不一样描述方法来说明其技术方案。比如：
（Ⅰ） 包含“微生物”发明要求
应该包含①微生物名称描述：对于新菌株情况，微生物分类学名称对应为种名+菌株名，种名采取国际标准命名法命名，菌株名由申请人自己命名，比如：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y-1；②生物保藏情况表现：对于新微生物，应该注明“菌株名+保藏单位简称+保藏号”，比如：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y-1，已于1993年9月8日保藏在中国经典培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为No.M93049；③微生物生物学特征记载：包含形态学特征、培养特征、生理特征和代谢特征等；④制造微生物方法：描述应该以本事域一般技术人员能够制造为准，通常包含筛选、诱变、DNA重组技术等；⑤记载一个微生物应用效果：必需在说明书中提供试验证据来证实微生物用途和实用效果。
（Ⅱ）包含重组DNA技术发明要求
包含DNA分子本身发明
①DNA分子具体结构（能够是碱基序列表示）、分子类型及起源等；②制备过程，包含工艺及条件、搜集纯化步骤、判定方法等；③功效和用途，证实这种功效和用途生物学试验。
包含载体发明
制备过程，包含起始载体、制备重组方法步骤、所用酶、处理条件等；最好描绘构建重组载体过程示意图。
包含多肽本身发明
对多肽或蛋白质名称、结构、制备方法和蛋白质功效进行描述。
包含转化体及其制备方法发明
描述导入基因或重组载体、宿主、导入方法、搜集转化体方法及判定方法等。

本发明目标在于提供一组用于快速判定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌特异性引物，及一个用环介导等温基因扩增技术（LAMP技术）快速判定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌方法。本判定方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。
为达成上述目标，本发明所采取技术方案以下：
本发明依据结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌16S RNA特异性设计4条特异性引物，利用环介导等温扩增技术，在60～65℃，等温扩增60~90分钟，依据显色剂显示颜色来区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。
 用于快速判定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌特异性引物，包含：
 内引物1：5’ TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT 3’（SEQ ID No.1）；
内引物2：5’ TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG 3’（SEQ ID No.2）；
  外引物1：5’ TCATCGCCGATCATCAGG 3’（SEQ ID No.3）；
  外引物2：5’CGAGTTTGGTCATCAGCCG3’（SEQ ID No.4）。
   一个快速判定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌方法，具体包含以下步骤：
（1）模板DNA提取：提取待检样品DNA，所述待检样品是已判定为含有分枝杆菌样品或分离分枝杆菌；
（2）环介导等温基因扩增反应：在200µl PCR管配制反应体系：引物混合液1µl，反应液 12.5µl，DNA聚合酶0.5~1µl，模板DNA 2~5µl，用灭菌去离子水补齐到25µl，然后加入20µl密封液，将上述反应管于63~65℃反应60~90min；
所述引物混合液含有上述4条特异性引物（SEQ ID No.1~4），其中，内引物1浓度为4~8 pmol/µl、内引物2浓度为4~8 pmol/µl、外引物1浓度为1 pmol/µl、外引物2浓度为1 pmol/µl；
 所述反应液含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4、 5mM Betaine，四者体积比为7~9：5：2~4：9~11；
（3）结果判定：在上述反应管中加入1~2µl显色剂SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液颜色，若展现绿色则为结核分枝杆菌，橙色则为非结核分枝杆菌。
所述反应液中，10mM dNTP：10×ThermoPol反应缓冲液：150mM MgSO4：5mM Betaine（体积比）=8：5：3：10。
 所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/µl。
4．本发明发明优点：
针对上述“现有技术缺点和不足”并结合技术方案中各个发明改善点作出具体说明，即以推理方法具体分析各个改善点怎样带来这些优点，使得对优点说明做到有理有据；经过对发明分析和理论说明相结合，或试验数听说明，它能够是产率或疗效提升、能耗、原材料、工序节省，操作、控制、使用简便，降低毒副作用，降低环境污染、代谢产物有药用价值、产量高、菌种存活使用时间长等。
本发明方法方便快捷，能在较短时间内判别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，且不需要昂贵仪器设备；灵敏度高，最低可检测出100个菌/ml；特异性好，本发明依据16S RNA基因序列设计4对引物，和目标基因6个区域结合，含有较高特异性。本发明对于结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌感染诊疗和临床用药含有较高参考价值，适于推广应用。
5．具体实施方法及附图：
具体实施方法：
（1）微生物：应给出微生物获取方法、筛选过程、生物学试验方法、用途和效果证实方法等；
（2）DNA重组：源基因获取方法、重组制备方法、工艺条件、纯化步骤、判定方法等。
具体实施方法应和技术方案相一致，而且应该对权利要求书技术特征给具体说明，以支持权利要求书（有多个实施方法时，提供多个实施例）；还应给出相关性能、效果表征数据等。
附图：基因工程图谱（包含HPLC图谱、试验曲线、基因重组、电泳图谱等），并针对附图进行说明。
实施例
 环介导等温基因扩增反应体系准备：
（1）反应液：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4、 5mM Betaine，四者体积比为8：5：3：10；
（2）引物液：包含4pmol/µl内引物1、4pmol/µl内引物2、1 pmol/µl外引物1、1 pmol/µl外引物2，四条引物分别为：
内引物1：5’ TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT 3’（SEQ ID No.1）；
内引物2：5’ TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG 3’（SEQ ID No.2）；
外引物1：5’ TCATCGCCGATCATCAGG 3’（SEQ ID No.3）；
外引物2：5’CGAGTTTGGTCATCAGCCG3’（SEQ ID No.4）；
（3）DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/µl；
（4）显色剂：荧光染料 1×SYBR Green I。
 用上述反应体系按以下方法对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行判定。本实施例待检样品为已判定为分枝杆菌患者痰液，当然，也能够为已判定为分枝杆菌患者支气管灌洗液及其它样品，或分离分枝杆菌。
1、模板DNA提取：
1）将3ml痰标本置于室温；
 2）在痰样标本中加入2倍痰样体积4%NaOH；
 3）每隔2min涡旋振荡15s，处理15min，然后吸收1ml加入带旋盖离心管中；
 4）1r/min离心15min，去上清液；
 5）加入0.9%NaCl 1ml，洗涤，1r/min离心15min，去上清液；
 6）加入100µl纯化水；
 7）100℃煮20min，然后冰浴10min；
 8）离心取上清液转移至另一支离心管中作为模板DNA。
2、环介导等温基因扩增反应：在200µl PCR管配制反应体系：引物混合物1µl，反应液 12.5µl，DNA聚合酶1µl，模板DNA 2µl，用灭菌去离子水补齐到25µl，然后加入20µl密封液，将上述反应管放入63℃水浴锅内，反应60min后取出反应管。
3、结果判定：在上述反应管中加入1µl 1×SYBR Green I，混匀后观察反应液颜色，若展现绿色则为结核分枝杆菌，橙色则为非结核分枝杆菌。
本实施例中，PCR管显绿色，表明待检样品所感染分枝杆菌为结核分枝杆菌。