DPPH自由基清除实验教学(详细版).doc

DPPH实验步骤
一、原理：
DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基，DPPH可以捕获("清除")其他的自由基。因此通过加入DPPH后观察某一化学反应的速率是否减慢，来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。由于DPPH自由基在以520nm为中心处具有强烈的吸收，因此在溶液中呈现深紫色，并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。
DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，且需低温避光储藏，具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，在波长为517nm下具有最大吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性越强。
二、实验步骤：
1.配制0.1mM的DPPH溶液：配两次，每次取0.002gDPPH溶于50mL乙醇，避光保存。
2.配制0.5mg/mL的Vc溶液，至少2mL（设为阳性对照，选择性做）
3.配制一定浓度的样品溶液 ，至少2mL母液（也可以配制不同溶度梯度样品，计算IC50）

4.上板（避光操作，上完板后，室温避光30分钟，测吸光度）
96孔板，三组，每组设3个复孔，每孔加入量及96孔板分布如下：
sample（样品组）：样品溶液100uL+ DPPH醇溶液100uL (每个浓度3个孔)
blank（空白组）：样品溶液100uL+无水乙醇100uL （每个浓度3个孔）
control（对照组）：DPPH醇溶液100uL+水100uL （一块板可共用一个对照组,3个孔）

sample
样品 VC
浓度 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
blank
control

5.检测并计算清除率
测517nm处的吸光度，取平均値，计算每个浓度的DPPH清除率，做出折线图。
清除率=（1 -（Asample - Ablank）/ Acontrol）X 100%