基于HPLC指纹图谱和化学模式识别的黄芩汤制备过程质量评价研究.pdf

炮制制剂36中药与临床Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(5)基于HPLC指纹图谱和化学模式识别的黄芩汤制备过程质量评价研究袁星，陈卓平，何沁蔓，郑夏杰，郑勇凤*摘要】目的：分析黄苓汤制备过程中化学成分的变化，为其质量评控提供参考。方法：遵古籍张仲景伤寒论中黄苓汤处方，将不同产地批次的饮片混批投料，按一次煎煮（A组）、二次煎煮（B组）、冷冻干燥（C组）制成3组各12 批样品，建立黄苓汤HPLC指纹图谱；计算相似度，标定特征峰；应用SPSS24.0及SIMCA14.1软件作HCA、PCA 及PLS-DA分析，挖掘影响不同批次黄苓汤质量的标志性化合物。结果：指纹图谱标定13个共有峰。不同产地药材批次的黄苓汤图谱相似度存在差异但不显著（各批次样品相似度均大于0.9 0 0 0）。指认黄苓苷、黄苓素、芍药苷、甘草苷、甘草酸5个特征峰。共有峰总面积：B组C组 A组。HCA、PCA 分析将样品分为两类，A组为一类，B组、C组为一类。PLS-DA分析找到4个潜在的质量差异标志物。综合得分评价：C组 B组 A组。说明黄苓汤煎煮2 次较为合理，冷冻干燥能较好地保留其成分，10 号峰、5号峰（甘草苷）、8 号峰（黄苓苷）、9 号峰可能是影响其质量的重要成分。结论：研究建立了黄苓汤指纹图谱，通过指纹图谱和化学模式识别较好地辨识了制备过程中影响黄苓汤质量的标志性化学成分，为其制备过程的质量评价研究奠定了理论基础。关键词】黄苓汤；指纹图谱；化学模式识别；制备过程质量评价中图分类号 R 283.2文献标识码 A文章编号 16 7 4-9 2 6 X(2023)05-008-08Quality evaluation of the preparation process of Huangqin Decoction based on HPLC fingerprint and chemical patternrecognition/YUAN Xing,CHEN Zhuo-ping,HE Qin-man,ZHENG Xia-jie,ZHENG Yong-fengl/(1.Chengdu University ofTraditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,Sichuan;2.Sichuan Polytechnic Technician College,Chengdu 611137.Sichuan)Abstract Objective:To analyze the changes of chemical composition during the preparation of Huangqin Decoction andproviding reference for its quality assessment and control.Method:According to the prescription of Huangqin Decoction inZhang Zhongjings Treatise on Febrile Diseases,12 batches of samples from different origins were mixed and fed into threegroups according to primary decoction(group A),secondary decoction(group B)and freeze-drying(group C).HPLC fingerprintsof Huangqin Decoction were established.The HCA,PCA and PLS-DA analyses were performed with SPSS 24.0 and SIMCA14.1 software,in order to explore the signature compounds affecting the quality of different batches of Huangqin Decoction.Result:Thirteen common peaks were identified by fingerprinting.The similarity of Huangqin Decoction from different originswas different.However,the difference of the similarity of all batches of samples was no significant with the values greater than0.9000.Five characteristic peaks of baicalin,baicalein,paeoniflorin,glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid were identified.Total areaof shared peaks of group B was similar with group C,and lager than that of group A.HCA and PCA analysis divided the samplesinto two categories,group A as one category,while group B and group C as another.PLS-DA analysis found 4 potential qualitymarkers of quality differences.Comprehensive score evaluation:group C group B group A.The results indicateed that forHuangqin decoction,frying for 2 times was more reasonable and freeze-drying can retain its components better.Peak 10,peak 5(glycyrrhizin),peak 8(baicalin)and peak 9 may be important components affecting its quality.Conclusion:The study establisha fingerprint profile of Huangqin Decoction.The fingerprint profile and chemical pattern recognition better identify the signaturechemical components affecting the quality of Huangqin Decoction in the preparation process,which lay a theoretical foundationfor the quality evaluation study of its preparation process.Key words Huangqin Decoction;fingerprint;chemical pattern recognition;quality evaluation of preparation process中药复方制剂是以中医理论为基础，按照“君臣佐使”的组方原则，由两味及以上药组成，根据临床基金资助 成都中医药大学杏林学者学科人才提升计划医院专项(2 0 2 0 yky01)作者单位 1.成都中医药大学，四川成都6 11137；2.四川理工技师学院，四川成都6 11137作者简介 袁星（19 8 9-），男，硕士，从事中药药剂及炮制工作Tel:13880152358E-mail:通讯作者 郑勇风Tel:15390438940E-mail:收稿日期 2 0 2 3-0 2-14用药需求，匹配适宜的制备及成型工艺制作而成的一类制剂。中药复方不仅一定程度体现了中医辨证施治的思想，代表了传统中医药学的精华，还融合了现代生产技术，已成为中药现代化发展中不可或缺的一部分。但因药味繁多、成分复杂、有效成分种类和含量不够清晰，对中药复方的质量控制和评价研究随应用的日益广泛而愈发重要。目前中药复方的质量评价存在标准不科学、溯源性差等技术瓶颈，且制剂过程37Pharmacy and ClinicsChineseMateria Medica2023;14(5)中药与临床是影响复方质量评价的重要环节。如何做到“遵古而不泥古”，即既要以古代医籍文献的记载为基础，同时还需考虑现代制剂的科学性和合理性，实现古法制备与现代工艺之间的转化，是中药复方质量研究的关键。指纹图谱的发展、“一测多评”方法的应用、中药质量标志物的提出，建立以关键质量属性辨识为核心的过程质量控制体系，为中药复方制剂的质量评价带来了新思路。黄芩汤，始载于张仲景伤寒论，由黄芩、芍药、甘草、大枣4味药组成，仲景原文记载以“黄芩三两、甘草(炙)二两、药二两、大枣十二枚，水一斗(今2 0 0 0 毫升)，煮取三升(今6 0 0 毫升)，去滓”制得，具有清热止痫、和中止痛之功效，是治疗热性痢疾的祖方。现临床广泛用于溃疡性结肠炎、胃癌、肝癌、结肠癌等消化系统疾病的治疗，组方精简，效专力宏，具备较好的开发前景。目前，关于黄芩汤的研究多集中于药效学机制研究和临床疗效观察，其制备过程的质量控制研究报道较少。故本文在古籍溯源和遵古宜今的思路下，建立3组各12 批不同制备方法、不同产地批次黄芩汤样品的指纹图谱，结合化学模式识别探讨煎煮次数和冷冻干燥对黄芩汤质量的影响，并挖掘影响其质量的标志性差异物质，为其制备过程质量控制的指标选择和二次开发奠定基础。1材料1.1仪器LC-16岛津高效液相系统（赛默飞世尔科技有限公司）；DL-720D数控超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；SCIENTZ-1ON冷冻干燥机（宁波新芝生物科技有限公司）；UPK-I-10T优普系列超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）；SHB-IIIA循环水式真空泵（北京中兴伟业有限公司）；DD5台式大容量低速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）1.2试药对照品黄芩苷（批号wkq21030302，质量分数98%），黄芩素素（批号wkq21030203，质量分数98%），芍药苷（批号wkq21041203，质量分数98%），甘草苷（批号wkq21021901，质量分数98%），甘草酸（批号wkq21012606，质量分数98%）；乙腈、磷酸为色谱纯，购自西格玛奥德里奇贸易有限公司。试验药材购自康美药业有限股份公司，4种药材经成都中医药大学中药鉴定方向刘晓芬老师鉴定，黄芩为唇形科黄芩属黄芩ScutellariabaicalensisGeor-gi.的干燥根经净制和切制而成，白芍为毛科芍药属芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根经净制和切制而成，甘草为豆科甘草属甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎经净制、切制和蜜炙而成，大枣为鼠李科枣属枣Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果实经净制而成。经4因素3水平的正交试验设计，得到12 批药材混合投料情况如表1所示。黄芩经净制和切制而成黄芩片，白芍经净制和切制而成白芍片，甘草经净制、切制和蜜炙而成甘草片，大枣经净制而成大枣饮片，用于煎煮。表1黄芩汤药材混合投料批次表Table 1 Batch table of Huangqin Decoction pieces产地编号黄苓药甘草大枣1山西终县浙江杭州新疆喀什山东宁阳2陕西商洛安徽亳州宁夏固原河北阜平3山东沂蒙山浙江杭州内蒙古鄂尔多斯新疆和田4山西终县安徽亳州新疆喀什新疆和田5山东沂蒙山浙江杭州内蒙古鄂尔多斯山东宁阳6陕西商洛浙江杭州内蒙古鄂尔多斯新疆和田7山西县四川中江新疆喀什河北阜平8陕西商洛安徽亳州宁夏固原山东宁阳9山东沂蒙山四川中江宁夏固原河北阜平10山西绎县浙江杭州宁夏固原新疆和田11陕西商洛四川中江内蒙古鄂尔多斯河北阜平12山东沂蒙山安徽亳州新疆喀什山东宁阳2方法与结果2.1溶液制备2.1.1供试品溶液的配制参考伤寒论原文记载及近现代度量衡换算（黄芩：芍药：甘草：大枣=3：2：2：2），称取饮片黄芩30 g、芍药2 0 g、甘草20g、大枣2 0 g、加8 倍量水浸泡30 min。查阅文献 7-101，按下述操作制备3组各12 批黄苓汤供试品溶液。A组（一次煎煮组）：沸腾后武火煎煮2 5min，转文火煎煮35min，滤过后取滤液4mL以超纯水稀释到10 mL（生药含量0.2 g/mL），40 0 0 r/m i n 离心20min，按表1饮片产地批号组合制得A1A12，共12批次样品。B组（二次煎煮组）：沸腾后武火煎煮2 5min，转文火煎煮35min，滤过，滤液备用。重复上述煎煮操作，取二煎滤液液4mL与一煎滤液4mL混合，加超纯水稀释定容至10 mL（生药含量0.2 g/mL），38Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(5)中药与临床4000r/min离心2 0 min，按表1饮片产地批号组合制得B1B12，共12 批次样品。C组（冷冻干燥组）：取B组试液5mL于10 mL西林瓶中预冻48 h，于冷冻干燥机中冻干48 h。冻干粉加超纯水溶解并定容至5mL（生药含量0.2 g/mL）。上清液0.2 2 um微孔滤膜滤过，与B1B12对应制得C1C12，共12 批次样品。2.1.2对照品溶液的配制精密称取黄芩苷、黄芩素、芍药苷、甘草苷、甘草酸对照品，于5个容量瓶中，加甲醇配制成质量浓度依次为2.0 13、0.6 0 8、0.448、0.413、0.42 9 m g/m L的对照品储备液。2.1.3混合对照品溶液的配制取2.1.2 项下5种对照品储备液适量，加入10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制得含黄芩苷、黄芩素、芍药苷、甘草苷、甘草酸质量浓度依次为0.40 2 6、0.1520、0.0 8 9 6、0.0 8 2 6、0.0 8 58 m g/m L的混合对照品溶液。2.2色谱条件及系统适应性实验色谱柱为Diamonsil C18柱（2 50 mmx4.6mm,5m）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0 13min，6%17%乙腈；13 15min,17%20%乙腈；15 50 min，2 0%30%乙腈；5060 min，30%38%乙腈；6 0 7 0 min,38%45%乙腈；7 0 8 0 min，45%7 0%乙腈；体积流量为1.0 mL/min；柱温为35C；进样量为20L；检测波长2 7 6 nm。取“2.1.1”项下供试品溶液、“2.1.3”项下混合对照品溶液及溶剂各适量，分别按“2.2”项下色谱条件进样2 0 uL测定，记录色谱图。5个成分的色谱峰分离度均较好，空白溶液无干扰，理论塔板数大于30 0 0，系统适应性良好，结果见图1。241562154C图1a：空白溶剂对照b：混合对照品c：样品1：药苷2：甘草苷3：黄芩苷4：黄芩素5：甘草酸Fig 1 A:Blank solvent control B:Mixed reference C:sample1:paeoniflorin 2:licorice 3:baicalin 4:baicalein 5:glycyrrhizic acid2.3方法学考察2.3.1精密度实验取第1批次药材组合制得的同一供试品溶液按“2.2”项下色谱条件连续进样，测定6次。记录峰面积和保留时间，6 次连续实验测得各峰保留时间及峰面积的RSD均小于1.0 0%，表明仪器精密度良好。2.3.2稳定性实验取第1批次药材组合制得的同一供试品溶液按“2.2”项下色谱条件分别在0、2、4、8、16、2 4h 进样，测得各时间点各峰保留时间及峰面积的RSD均小于2.0 0%，表明供试品在2 4h内稳定。2.3.3重复性实验取第1批次药材组合制得的供试品溶液6 份，按“2.2”项下色谱条件进样，6 份平行制备样品测得各峰保留时间及峰面积的RSD均小于2.00%，表明该方法具有可重复性。2.4指纹图谱的建立及相似度计算按“2.1.1”I项下方法制备3组各12 批次共36 个样品的供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件于高效液相色谱系统中进样检测，生成色谱图分组导人“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2 0 12 版）”软件。A、B、C各组样品指纹图谱信息如图2。采用中位数法，时间窗设置为0.1min，经多点校正和Mark峰匹配生成对照图谱，共标定13个共有峰。通过与混合对照品色谱比对，指认5个特征峰，分别为4号峰（芍药苔）、5号峰（甘草苷）、8 号峰（黄芩苷）、12 号峰（黄芩素）、13号峰（甘草酸）。以出峰稳定分离度较好的黄芩苷峰为参照，计算各共有峰峰面积平均RSD值介于8.7 9 19.7 8（表2）。以生成的对照图谱为比照，计算各图谱相似度介于0.8810.9 9 7（表3），各共有峰平均RSD值，不同产地批次黄芩汤样品之间质量存在差异但不显著。计算各组共有峰总面积，B组与C组面积相近，且均大于A组。B组与A组质量差异较大，而与C组差异较小，说明冷冻干燥过程较好地保留了主要物质群(表4)。10100010A1021118.2616.0810.1139中药与临床Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica2023;14(5)2,0002.702.80025002.4002.302202.1002.001,9001.001700t.0001400.500R(13)1.200A12(13).t00411(13)1,0A10(13)00t004.9(13)A8(13)7004713)46(13100A5(13)44(13)43(13)42113)A1(13)a3,1903,02.0002.0002.7002.8002.302.402.3002.202.1002.001.9001,001.70015001,4001,300R(13)1200B12(13)1.100B11(13)1,000B10(13)800B9(13)800BB(13)700B7(13)600B6(13)B5(13)400B413)B3(13)B2(13)B1(13)HHimintb2.0002.0002.7002.002.6002.4002.30022002.1002.001.5001.08001.70014001.300R(13)1.20012(13)1,10011(13)1.000:10(13)C9(13)C8(13)7007(13)600C8(13)500C5(13)400C4(13)3003/13)209B2(13)100C1(13)RrlimintC图2 a：一次煎煮组b：二次煎煮组c冷冻干燥组Fig 2.A:one-time decocting group B:Two-time decocting group C:Freeze-drying group表2 黄芩汤3组样品共有峰平均峰面积RSD值Table 2 Average peak area RSD values of common peaks of thethree groups of samples in Huangqin Decoction峰面积RSD/%峰号一次煎煮组二次煎煮组冷冻干燥组(A)(B)(C)114.6713.2012.08211.848.9311.22318.3917.7310.6849.488.998.79517.5415.9912.49614.5716.2816.32717.5310.4812.83811.4114.0110.49911.2012.4019.781012.8519.1215.771219.0012.0510.041316.0114.3115.63表3黄芩汤3组样品指纹图谱相似度计算结果Table 3 Fingerprint similarity calculation results of three groupsof samples of Huangqin Decoction相似度编号一次煎煮组二次煎煮组冷冻干燥组(A)(B)(C)S10.9920.9180.924S20.9860.9910.983S30.8810.9930.971S40.9760.8750.896S50.8950.9540.958S60.9690.9440.937S70.9880.9690.961S80.9620.9920.980S90.9270.9880.997S100.9310.9750.993S110.9520.9960.979S120.8990.9550.964表4黄芩汤3组样品共有峰面积总和Table 4 Total peak areas of three groups of samples of HuangqinDecoction平均峰面积峰号t/min一次煎煮组二次煎煮组冷冻干燥组(A)(B)(C)12.6655107852.9386189166.1676014785.41723.83210653790.41712518837.91712233574.08337.4543732491.6044296406.1674394508.042410.4073085919.1253523217.7083597470.354517.3128708489.20810044664.9179491573.292620.7113829953.4584329266.9584417091.688724.0163159467.8913778113.0943886695.083836.58978233136.33386241793.00087331080.000942.5424120371.5424702883.2295093780.2711045.86510165251.20810866689.00011366494.9171149.43021044353.917 21627430.91722628193.3331259.507820801.232787382.440624456.0991369.5972159272.2812353587.9582413326.396峰面积总和154821151.2171259439.5173493029.02.5化学模式识别研究2.5.1系统聚类分析(HCA)将黄芩汤样品共有峰面积量化处理后，生成36 13的阶数据矩阵，导40.中药与临床Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(5)入SPSS24.0软件，采用组间连接方法，以平方欧氏距离为测量区间，Z得分作为标准化转换值，对A、B、C3组36 个样品进行系统聚类分析，结果以谱系图表示（图3）。当平方欧氏距离为2 5时，36 批黄芩汤样品可分为2 类，A1A12为一类，B1B12、C1C12为一类，说明煎煮次数对质量的影响大于药材产地批次的影响。欧氏平方距离重新标度的距离聚类组合010152025B11C11B3C3B6C1C6B2C10B1B9C9B12C12B8C5B4B5C4C7C8B10B7C2A3A6A4A5A8A10A12A11A7A9A2A1图3系统聚类分析谱系图Fig 3 Pedigree of systematic cluster analysis2.5.2主成分分析(PCA)将样品13个共有峰面积阶数据矩阵导人SPSS24.0软件，检验KMO值为0.805，大于0.5，模型可靠，各变量相关性好。基于特征值大于1作降维分析，提取3个主成分，输出碎石图（图4）。第一、二、三主成分斜率较大，提取的主成分可最大程度地代表黄芩汤样品的整体质量；以最大方差法旋转相关矩阵，输出旋转后矩阵图及各变量对因子贡献率图表（表5、6，图5）。3个主成分的累积方差贡献率为8 1.8 31%，可以代表指纹图谱中13个共有峰的大部分信息。主成分1主要反映5、8、9、10 号峰的信息，主成分2 主要反映1、2、3、4、6、13号峰的信息，主成分3主要反映7、11、12 号峰的信息。量化数据导人SIMCA14.1软件，建立PCA模型并绘制主成分PCA得分图（图6），分类结果与主成分分析一致。碎石图86-特征值42-01.00 2.003.004.00 5.00 6.007.008.00 9.0010.00 11.0012.0013.00图4公因子碎石图FIG.4 Common factor lithotripsy diagram表5主成分指纹值及方差贡献率Table 5 Principal component fingerprint value and variance contri-butionrate总方差解释旋转载初始指方差百荷平方方差百成分纹值累积%累积%分比和分比总计总计17.57758.28458.2844.59935.37635.37621.77613.66571.9493.95530.42265.79831.2859.88181.8312.08416.03381.83140.9227.08888.91950.5944.56793.48660.2852.19495.68170.2121.63397.31380.1361.04698.35990.1050.81199.17100.0550.42399.593110.0290.22299.814120.0160.12199.935130.0080.065100.000表6 旋转后因子载荷矩阵Table 6 Factor loading matrix after rotation旋转后的成分矩阵a成分123V80.9490.2460.107V90.9420.2000.156V100.9290.325V50.9240.31541Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(5)中药与临床V70.5640.1830.410V130.1050.895V60.2890.8390.146V10.2960.814V30.2970.7670.270V40.4860.6370.443V20.4820.5720.491V120.853V110.1870.3560.778旋转后的空间中的组件图V13.V6v11.0480.5-11V2V5V10主成分2V7V10.0-0.5-1.0-1.0050.00.510100.50.0-0.5-10主成分1主成分3图5旋转后主成分空间图Fig.5 Principal component space map after rotationA23B2A52B6A9A10C2B11.1C10A11AA6A3-1A1B10A4-2B5B12B12C7-3C4O-4+-86-4-20246t1图6 PCA得分图Fig.6PCAscore2.5.3偏最小二乘法一判别分析(PLS-DA)将样品共有峰面积阶数据矩阵导入SPSS24.0软件，建立PLS-DA模型。累计模型预测能力参数Q2=0.564，大于0.5；累计解释能力参数R2X=0.742、R2Y=0.669，大于0.5，模型稳定可靠。输出PLS-DA得分图级载荷图（图7、8），36 个黄芩汤样品被分为2 类，其中B1B12 和C1C12 为一类，A1A 12为一类，分类结果与HCA及PCA分析一致。变量重要性投影（VIP）值是筛选差异性成分的重要指标，VIP值越高，成分对组间差异的影响越大。VIP值 1的共有峰有4个（图9），其大小相近，依次为10 号峰、5号峰（甘草苷）、8 号峰（黄芩苷）、9 号峰，说明这4种成分可能为引起黄芩汤样品组间差异及质量稳定性差异的主要因素，在制备过程中应重点关注。A3C4BB42B5A4CSA61A3B11A1A11B511-126AA9-2C1086A10-3B2A2-4-8-6-4-20246t1图7 PLS-DA得分图Fig7PLS-DAscorediagram100.3Y0.20.1$M2.DA(C)$M2.DA(B)2,M0-0.17-0.213$M2.DA(A)-0.3-42611123-0.4+-0.5-0.4-0.3-0.2-0.100.10.20.30.4w*c1图8 PLS-DA载荷图Fig.8 PLS-DA loading diagram1.510-0.5-1-1.558042362Var ID(Primary)图9 变量重要性投影图Fig 9.Variable importance projection2.5.4综合得分评价以提取得的3个主成分为新变量，以综合得分表达式综合得分=58.2 8 4/8 1.8 31*FAC1_1+13.665/81.831*FAC2_1+9.881/81.831*FAC3_1,得到36 批样品综合得分排序表（表7）。B组及C组整体得分高于一次煎煮组。提示黄芩汤在制备过程中煎煮2 次较为适宜，且冷冻干燥能较好地保留煎液中的有效成分。表7 样品综合得分排序表Table 7 Sample comprehensive score ranking table编号主成分1主成分2主成分3综合得分排名B11.08048-1.381471.824320.761C11.03707-1.118361.30.712C100.66220.703530.669680.673B100.883950.06612-0.008490.644C120.94954-0.06353-0.339870.625B30.84846-0.526270.784190.616C60.628880.100311.074390.59742中药与临床PharmacyChinese Materia Medica2023;14(5)C41.21084-1.23108-0.601780.588B41.01162-0.62363-0.338310.589B120.8975-0.15914-0.319170.5710B60.42318-0.167842.429980.5711C80.723880.7463-0.634110.5612C90.788920.40054-0.627430.5513C30.71659-0.342510.426790.514C20.377350.956670.174840.4515C70.81093-0.19649-0.822150.4516B90.63280.35026-0.52790.4517B20.145341.159651.096280.4318B50.80529-0.39115-0.856220.419B80.608780.50128-1.062440.3920B110.241381.68865-1.075390.3221C110.264841.60843-1.12770.3222C50.532830.43508-1.129170.3223B70.54240.19189-0.896190.3124A1-0.8363-1.092611.6175-0.5825A10-1.264810.337980.69083-0.7626A3-0.98609-0.795230.17148-0.8127A5-1.362050.90672-0.1336-0.8328A12-1.184950.08717-0.07972-0.8429A2-1.711520.792311.84871-0.8630A4-1.08712-0.727280.16942-0.8831A8-1.378460.86587-0.38914-0.8832A9-1.464490.520960.01699-0.9533A6-1.19817-0.76130.11026-0.9734A7-1.387870.29908-0.3999-0.9935A11-1.485150.68983-0.77584-1.04363讨论课题组前期研究对比了分别以乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%磷酸、乙腈-1.0%磷酸作为流动相的实验结果，显示乙腈-0.1%磷酸的分离效果和峰形最佳；比较了不同柱温（30、35、40）对结果的影响，最终选定柱温为35；考察了不同波长(254nm、2 6 0 n m、2 7 0 n m、2 7 6 n m、2 8 0 n m）,结果显示检测波长为2 7 6 nm时，出峰数量多，峰面积大且峰形较好；并对分段梯度进行了优化以改善各成分的分离度。煎煮次数是影响中药汤剂质量的关键因素之一。文献资料整理可知秦汉时期汤剂均为煎煮1次，至晋代肘后备急方始载二煎。黄芩汤出处伤寒论载汤剂10 2 首，所有汤剂煎煮次数均为1次。而现代汤剂煎煮工艺中除具备特殊理化性质的药材外，则多为煎煮2 次。医疗机构中药煎药室管理规范 2 及方剂学教材中建议每剂药煎煮2 次，将头煎、二煎兑合服用。相关文献报道，一煎煎出率约为30%，二煎40-50%，两次合并约为70-80%。为了探讨二煎之法是否有违古人之意，能否提高有效成分在黄芩汤煎液中的溶出率，本研究对黄芩汤就一次煎煮及二次煎煮进行了比较，初步证实了二次煎煮的合理性及冷冻干燥法对二煎合并液成分的保留效果。诚然，在制备过程中影响复方质量的因素还有很多，如饮片炮制方法、煎煮时间等具体参数的优化、单煎与合煎的合理性比较、过滤与浓缩的方法选择等，后期将设置试验一一进行探讨。指纹纹图谱相似性分析及峰面积RSD值计算显示产地对黄芩汤质量有一定影响，为今后黄芩汤制备的药材选择提供参考；聚类分析清晰将样品划为2类，冷冻干燥组及二次煎煮组同为一类，一次煎煮组单独为一类，故煎煮次数对黄芩汤的质量影响较产地更为直接；冷冻干燥组与二次煎煮组指纹图谱较高的相似度提示冷冻干燥对黄芩汤化学物质群的影响较小，故对贮藏时间有要求的前提下可优先选择冷冻干燥制备黄芩汤冻干粉备用。后续将进一步对比从饮片到煎液到冻干粉各成分的保留与损失。PLS-DA是找出导致药材及复方质量差异因素的常用方法。本研究通过变量投影重要值筛选的4个差异标志物（5号峰、8 号峰、9 号峰、10 号峰）因其特殊理化性质引起样品的批间差异，是影响黄芩汤质量稳定性的关键性成分，可作为黄芩汤制备过程质量评价的指标。其中，8 号峰（黄芩苷）是方中君药黄芩抗炎、止泻、抑菌等药理作用的主要成分，5号峰（甘草苷）则是甘草抗炎、保肝、调和诸药等药理作用的主要成分。根据中药质量标志物的基本条件“5要素”（特有性、可测性、有效性、传递性、中医药理论关联性），初步可确定为黄芩汤的质量差异标志物，将结合血清药物化学、网络药理学等技术予以验证。因实验周期限制，未能明确9 号峰及10 号峰的化学成分信息。根据文献查阅及物质极性大小推测，可能为去甲汉黄芩素（9 号峰）、千层纸素A-苷（10 号峰），后续将采取UPLC-Q/TOF-MS/MS等技术进一步辨识其质控关键成分。近年来，我国颁布了中华人民共和国中医药法，形成了古代经典名方目录（第一批）古代经典名方关键信息考证中药注册分类及43Pharmacy andChineseMateria Medica2023;14(5)中药与临床申报资料要求等代表性政策法规文件，进一步规范经典名方的研究。然而经典名方研发中制剂过程的质量控制等关键环节仍面临许多挑战。黄芩汤作为组方精炼、疗效明确、有一定现代研究基础的中药复方，具备经典名方再开发的潜力。然而其系统深入的研究较少、低水平重复的研究较多是黄芩汤制剂过程研究中存在的普遍现象。以质量控制为核心，以全过程质量控制为导向，以“精细制造”为宗旨